0分鐘后將離心管再次置于分離器上，2-5分鐘后，將洗脫液吸出置于 新的離心管中備用；
[0064] (8)每個(gè)反應(yīng)管加入上述經(jīng)預(yù)處理的待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照5-10μ1;
[0065] (9)每管加入PCR-mix40-45μ1，蓋上管蓋（去除氣泡后），2000rpm離心30秒。
[0066] 2、方法B:樣本釋放劑提取核酸
[0067](1)取200-500μ1待測(cè)樣本，13000rpm離心5分鐘后吸棄上清，加入20-50μ1樣 本釋放劑靜置10分鐘后，備用；
[0068] (2)每個(gè)反應(yīng)管加入上述經(jīng)預(yù)處理的待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照5-10μ1;
[0069] (3)每管加入PCR-mix40-45μ1，蓋上管蓋（去除氣泡后），2000rpm離心30秒。
[0070] 三、熒光PCR反應(yīng)
[0071] (1)將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱及陽性參照 品濃度。
[0072] (2)焚光檢測(cè)通道選擇：1)選擇FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:none)檢測(cè) 淋球菌DNA;2)選擇HEX或VIC通道（Reporter:HEX/VIC,Quencher:none)檢測(cè)沙眼衣原 體DNA;3)選擇ROX通道（Reporter:ROX,Quencher:none)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；4)參比焚光（Passive Reference)設(shè)置為none。
[0073] (3)熒光定量PCR反應(yīng)條件見表1 :
[0074] 表1 :熒光定量PCR反應(yīng)條件
[0075]
[0076] 四、結(jié)果分析
[0077] 反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)保存結(jié)果，可以利用儀器自帶的軟件進(jìn)行自動(dòng)分析（也可 以手動(dòng)調(diào)芐基線的開始值、結(jié)束值以及閾值線值進(jìn)行分析），然后記錄樣本Ct值和定值結(jié) 果。擴(kuò)增曲線與閾值線的交點(diǎn)，稱為Ct(即cyclethreshold，指PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào) 達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)值）；儀器軟件根據(jù)各樣本Ct值大小，通過如圖1和2 分別所示的陽性參照品A、B、C、D四個(gè)濃度梯度對(duì)于沙眼衣原體的擴(kuò)增曲線以及對(duì)于淋球 菌的擴(kuò)增曲線，繪制如圖3和圖4分別所示的沙眼衣原體定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖以及淋球 菌定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖自動(dòng)求得各樣本的定值結(jié)果。如果樣本擴(kuò)增 曲線呈S型，有Ct值且Ct< 38,可以判為沙眼衣原體/淋球菌陽性；如果樣本擴(kuò)增曲線平 直，無Ct值顯示（Undet)顯示，可以判為沙眼衣原體/淋球菌陰性。
[0078] 本實(shí)施例還包括沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)，利用本實(shí)施例 提供的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)8份企業(yè)陽性參考品，結(jié)果均為陽性且鑒 別準(zhǔn)確，無交叉反應(yīng)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示：
[0079] 表2 :準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
[0080]
[0081] 圖5和圖6分別所示為8份企業(yè)陽性參考品沙眼衣原體和淋球菌的擴(kuò)增曲線，由 圖可知，8份參考品的擴(kuò)增曲線均呈S型，有Ct值且Ct< 38,8份參考品均為陽性，且8份 陽性參考品出現(xiàn)交叉反應(yīng)率=0,表明本沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確 性較高。
[0082] 本實(shí)施例還包括沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)，利用本實(shí)施例 提供的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)8份企業(yè)陰性參考品，結(jié)果均為陰性，表明 本沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒特異性強(qiáng)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示：
[0083] 表3 :特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
[0084]
[0086] 圖7和圖8分別所示為8份企業(yè)陰性參考品沙眼衣原體和淋球菌的擴(kuò)增曲線，由 圖7和圖8可知，沙眼衣原體和淋球菌的擴(kuò)增曲線均為平直直線，無Ct值顯示顯示，可以判 為8份企業(yè)陰性參考品均為陰性，表明本沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒特異性強(qiáng)。 [0087] 本實(shí)施例還包括沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒精密度實(shí)驗(yàn)，利用本實(shí)施例 提供的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)2份樣品（R1和R2)做10組重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié) 果表明本沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒精密度Ct值的變異系數(shù)（CV，％ 5%，精 密度較高，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表4所示：
[0088] 表4 :精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
[0089]

[0090] 圖9和圖10分別所示為2份樣品中沙眼衣原體和淋球菌的擴(kuò)增曲線，由圖9和圖 10可知，本沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)2份樣品的檢測(cè)重復(fù)性較好，精密度Ct值的變異系數(shù)（CV，％ 5%，表明本沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒精密度較高。
[0091] 以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明 的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 [0092] 以上所述僅是本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解或?qū)崿F(xiàn)本發(fā) 明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的 一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一 致的最寬的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述沙眼衣原體/淋球菌核 酸檢測(cè)試劑盒包括：沙眼衣原體/淋球菌PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括反應(yīng)緩沖液、脫 氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物以及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針， 其中，所述用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針序列為： 沙眼衣原體探針：5' -CTTAAAAGACAATGGATTACCTAT-3'； 淋球菌探針：5' -CAATGCCTCGTTGATATTTTTCCGTAA-3'。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述用于 靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的序列為： 沙眼衣原體上游引物：5' -CATATTCATAGTATTTAAAT-3'； 沙眼衣原體下游引物：5' -CGGCGTCGTATCAAAGATATGGAC-3'； 淋球菌上游引物：5' -GCTCCACAGATAGGGCTTGAATACT-3'； 淋球菌下游引物：5' -ACAAACGAAAGCAGACTTAGAGACG-3'。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述沙眼 衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)的序列為： GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCT TTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGG。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述沙眼 衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒還包括：用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物和用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo) 的探針，且所述檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針的序列為：5' -CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC-3'。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述用于 內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物序列為： 上游引物：5' -GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT-3'； 下游引物：5' -CCCATAACAGCATCAGGAGTG-3'。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述沙眼 衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐熱DNA聚合酶 和尿嘧啶DNA糖基化酶，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包括dUTP。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述沙眼 衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒還包括： DNA提取溶液I :含有十二烷基硫酸鈉0. 2-1. 0g/100ml，曲拉通1. 0-4. 0ml/100ml，異硫 氰酸胍〇· 2mol/L_l. Omol/L和磁珠100_400tg/ml ; DNA提取溶液II :含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸0· 1-0. 3mol/L和氯化鈉0· 1-0. 3mol/L且 所述DNA提取溶液II的pH值為6. 5±0. 2 ; DNA提取溶液III :含有曲拉通0· 1-1. 0ml/100ml和氯化鈉0· 1-0. 3mmol/L ; DNA提取溶液IV:礦物油。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述沙眼 衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒還包括：樣本釋放劑，所述樣本釋放劑為莎梵婷表面活性 劑0.01-0.5禮/1，氯化鉀50-2001111/1，十二烷基磺酸鈉0.01-2%和乙醇0.05-1%。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒，沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒包括：沙眼衣原體/淋球菌PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物以及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針等。本試劑盒提供的用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針特異性較高，應(yīng)用該試劑盒，可以對(duì)生殖道分泌物等未知樣本中的沙眼衣原體/淋球菌DNA同時(shí)進(jìn)行快速檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)200copies/ml，檢測(cè)范圍為200copies/ml～4.00E+10copies/ml，為診斷沙眼衣原體和淋球菌感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可以解決現(xiàn)有技術(shù)中試劑盒檢測(cè)效率低、特異性差以及靈敏度低的問題。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04
【公開號(hào)】CN105349661
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510849075
【發(fā)明人】戴立忠, 楊幫林, 李勃, 鄧中平
【申請(qǐng)人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年11月27日