.2。
[0064]1.5.2操作步驟:將酵母融合菌轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，32°C培養(yǎng)24小時(shí)后再轉(zhuǎn)入三角瓶培養(yǎng)72小時(shí)，檢查確認(rèn)無雜菌后用作發(fā)酵罐接種，發(fā)酵罐培養(yǎng)72小時(shí)后，完成發(fā)酵；將發(fā)酵液通過離心機(jī)進(jìn)行濃縮，成為濃縮發(fā)酵液；將濃縮發(fā)酵液打入調(diào)配罐內(nèi)，加入濃縮發(fā)酵液重量40%的輕質(zhì)碳酸鈣攪拌均勻，然后將其通過噴霧干燥塔進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度控制在195-200°C，出風(fēng)口溫度控制75-78°C，保持噴出的酵母融合菌原粉的水分重量百分比含量在5-6% ;將噴霧干燥塔塔底和旋風(fēng)口處的酵母融合菌原粉進(jìn)行混合，混合均勻后密封保存?zhèn)溆谩?br>[0065]1.6復(fù)合菌劑組配:
將上述各步驟制得的綠色木霉菌原粉、黑曲霉原粉、米曲霉原粉、側(cè)孢短芽孢桿菌原粉和酵母融合菌原粉按重量比1:2:2:2:2進(jìn)行復(fù)合組配，各組份混合均勻得到復(fù)合菌劑。
[0066]2.制備復(fù)合酶劑: 2.1制備纖維素酶:
2.1.1實(shí)驗(yàn)材料
菌種:里氏木霉cicc 13052。
[0067]PDA固體培養(yǎng)基:將200g馬鈴薯去皮切碎，煮沸30min，然后用雙層紗布過濾，加入20g葡萄糖，加入瓊脂20g，加水至1000mL，121°C滅菌。
[0068]液體種子培養(yǎng)基:每升蒸餾水中加入葡萄糖20g、蛋白胨lg、Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液100mL、Mandels微量元素濃縮液lmL、lmol/L檸檬酸緩沖液50mL，PH為5.5-6.0 ；
其中:Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液為:每升蒸餾水中加入(NH4)2S04 14 g、尿素3 g、ΚΗ2Ρ0420 g、CaCl2.2H20 4 g、MgS04.7H20 3 g ；Mandels微量元素濃縮液為:每升蒸餾水中加入FeS04.7H20 5 g、ZnS04.7H20 1.4 g、CoCl2.6H20 3.7 g、MnS04.H20 1.6 g ；
5m3通氣罐產(chǎn)酶培養(yǎng)基:每升蒸饋水中加入蛋白胨3g、酵母膏0.5g、(NH4) 2S04 2g、KH2P04 4g、CaCl2.2H20 0.3g、MgS04.7H20 0.3g、Tween- 80 0.2mL、微晶纖維素 20g、小麥麩皮30g，121 °C滅菌20 min后使用。
[0069]2.1.2實(shí)驗(yàn)方法
2.1.2.1種子的活化:
將原始菌種里氏木霉用接種環(huán)接種到PDA固體培養(yǎng)基上30°C下培養(yǎng)5-6天備用。
[0070]2.1.2.2液體種子培養(yǎng):
用孢子接種器在已活化的PDA固體培養(yǎng)基上挑取一環(huán)孢子接種于裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C、150r/min搖床上培養(yǎng)2d，作為液體種子。
[0071]2.1.2.3 5m3 通氣罐發(fā)酵:
將培養(yǎng)48小時(shí)的液體種子，按10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐的裝液量為80%，于28°C培養(yǎng)，控制通氣量為lvvm，用調(diào)頻裝置調(diào)整轉(zhuǎn)速為150r/mim，并通過流加2mol/LNH40H控制發(fā)酵液pH大于4.0 ;通過控制風(fēng)量和轉(zhuǎn)速，保持適當(dāng)?shù)娜苎躏柡投?，并通過流加消泡劑控制發(fā)酵過程中形成的泡沫。發(fā)酵過程中每4小時(shí)檢測一次各項(xiàng)生化指標(biāo)，包括還原糖濃度、菌體生長情況、pH不再下降或回升，待發(fā)酵液粘度明顯降低時(shí)終止發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)板框分離，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)離心機(jī)3500r/min離心15min，取上清即為纖維素酶粗酶液。
[0072]2.1.2.4纖維素酶固體粉末:
取纖維素酶粗酶液，向其中加入質(zhì)量比10%的硫酸鈉充分溶解，在經(jīng)過霧化器霧化成細(xì)小的霧滴，然后在干燥塔內(nèi)與經(jīng)高效過濾的熱空氣接觸，熱空氣進(jìn)風(fēng)溫度為110°c，出口溫度為60°c，如此迅速蒸發(fā)溶劑并形成細(xì)粉，經(jīng)分離系統(tǒng)后得到的粉末狀纖維素酶固體制劑的酶活回收率達(dá)到90%以上。所得酶粉中含有內(nèi)切葡聚糖酶EG 1、EG I1、EG III，外切葡聚糖酶CBH 1、CBH II，β -葡萄糖苷酶GB。其中酶含量最高的是外切葡聚糖酶CBH I，CBH I是里氏木霉表達(dá)最多的纖維素酶，也是最主要的纖維素酶。
[0073]2.2制備半纖維素酶:
2.2.1實(shí)驗(yàn)材料
菌種:枯草芽孢桿菌cicc 10088。
[0074]斜面培養(yǎng)基:每升蒸餾水中加入牛肉膏3g、蛋白陳10g、NaCl 5g、瓊脂20g，ρΗ7.0-7.2，121°C 滅菌 20min ； 液體種子培養(yǎng)基:每升蒸餾水中加入牛肉膏3g、蛋白陳10g、NaCl 5g，pH7.0_7.2，121°C 滅菌 20min ；
5m3發(fā)酵培養(yǎng)基:每升蒸餾水中加入糖蜜10g、魚粉10g、NaCl 2.5g、CaCl2 lg、MgS04.7H20 1.25g、KH2P04 0.38g、K2HP04 0.74g、麥麩 5.20 g、玉米粉 6.49 g，pH7.0-7.2。
[0075]2.2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.2.1種子的活化
將4°C冷藏的枯草芽孢桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌種活化。
[0076]2.2.2.2液體種子培養(yǎng)
在已活化的斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌體接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C、120-150rmp震蕩培養(yǎng)24h，即為種子液。
[0077]2.2.2.3發(fā)酵罐發(fā)酵
將上述液體種子按10%的接種量接種于5L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐的裝液量為70%，pH為7.5，溫度37°C，控制前期通氣量為1:0.8，后期通氣量為1:1，加兩滴乳化硅油作為消泡劑，培養(yǎng)48小時(shí)后收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)離心機(jī)3500r/min離心10_15min，取上清即為半纖維素酶粗酶液。
[0078]2.2.2.4半纖維素酶固體粉末
取半纖維素酶粗酶液，向其中加入質(zhì)量比10%的硫酸鈉充分溶解，在經(jīng)過霧化器霧化成細(xì)小的霧滴，然后在干燥塔內(nèi)與經(jīng)高效過濾的熱空氣接觸，熱空氣進(jìn)風(fēng)溫度為110°c，出口溫度為60°C，如此迅速蒸發(fā)溶劑并形成細(xì)粉，經(jīng)分離系統(tǒng)后得到的粉末狀半纖維素酶固體制劑的酶活回收率達(dá)到90%以上。所得酶粉中主要含有甘露聚糖酶、木聚糖酶這兩種半纖維素酶，其中甘露聚糖酶含量較高。
[0079]2.3制備木質(zhì)素酶:
2.3.1實(shí)驗(yàn)材料
菌種:糙皮側(cè)耳菌。
[0080]PDA固體培養(yǎng)基:將200g馬鈴薯去皮切碎，煮沸30min，然后用雙層紗布過濾，加入20g葡萄糖，加入瓊脂15-20g，加水至1000mL，121°C滅菌；
液體種子培養(yǎng)基:每升蒸饋水中加入馬鈴薯200g、蛋白胨4g、酵母膏2g、葡萄糖20g、KH2P04 3g、MgS04l.5g、VBi 2mg、營養(yǎng)鹽溶液 70mL，調(diào) PH 為 4.8，121°C 滅菌 20 min ；
5m3通氣罐產(chǎn)酶培養(yǎng)基:每升蒸饋水中加入麥草粉20g、酒石酸錢5g、Tween- 80 lmL、藜蘆醇600ul、營養(yǎng)鹽溶液70mL，調(diào)PH為4.5，121 °C滅菌20 min ；
其中液體種子培養(yǎng)基和通氣罐產(chǎn)酶培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽溶液為:每升蒸餾水中加入氨基乙酸 0.6g、MnS04.H20 0.5g、NaCl lg、FeS04.7H20 0.lg、CoS04.7H20 0.22g、CaCl2.2H20
1.56g、ZnS04.7H20 0.lg、CuS04.5H20 lg、Al2(S04)3.12H20 10mg、HB02 10mg、Na2Mo04.2H200.0lg ；
2.3.2實(shí)驗(yàn)方法
2.3.2.1種子的活化
將原始菌種糙皮側(cè)耳菌接種到PDA固體培養(yǎng)基上28°C下培養(yǎng)6天。
[0081 ] 2.3.2.2液體種子培養(yǎng)
在已活化的PDA固體培養(yǎng)基上挑取一環(huán)孢子接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于30°C，150r/min搖床上培養(yǎng)2d，作為液體種子。
[0082]2.3.2.3 5m3 通氣罐發(fā)酵
將上述液體種子按10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐的裝液量為80%，于28°C培養(yǎng)，控制通氣量為lvvm，轉(zhuǎn)速為150r/mim，控制風(fēng)量和轉(zhuǎn)速，保持適當(dāng)?shù)娜苎躏柡投仍?0%，通過流加2mol/LNH40H自動(dòng)控制發(fā)酵液pH為4.0，并通過流加消泡劑控制發(fā)酵過程中形成的泡沫，待發(fā)酵液粘度明顯降低時(shí)終止發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)板框分離，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)離心機(jī)3500r/min離心15min，取上清即為木質(zhì)素酶粗酶液。
[0083]2.3.3.4木質(zhì)素酶固體粉末
取木質(zhì)素酶粗酶液，向其中加入質(zhì)量比10%的硫酸鈉充分溶解，在經(jīng)過霧化器霧化成細(xì)小的霧滴，然后在干燥塔內(nèi)與經(jīng)高效過濾的熱空氣接觸，熱空氣進(jìn)風(fēng)溫度為110°c，出口溫度為60°c，如此迅速蒸發(fā)溶劑并形成細(xì)粉，經(jīng)分離系統(tǒng)后得到的粉末狀木質(zhì)素酶固體制劑的酶活回收率達(dá)到90%以上。所得酶粉中含有漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、賴錳木質(zhì)素過氧化物酶，其中漆酶含量較高，其他兩種酶含量較低，說明糙皮側(cè)耳菌主要產(chǎn)漆酶，而漆酶也是主要的木質(zhì)素降解酶。
[0084]2.4復(fù)合酶劑組配
將上述纖維素酶固體粉末、半纖維素酶固體粉末、木質(zhì)素酶固體粉末按重量比1:2:2進(jìn)行混合，制成復(fù)合酶劑。
[0085]3.腐熟劑組配
將上述制得的微生物復(fù)合菌劑和復(fù)合酶劑按重量比3:1混合，制成酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑。
[0086]本發(fā)明酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑的使用方法包括以下步驟:
使用腐熟劑前將農(nóng)作物秸桿平鋪于田間，按農(nóng)作物秸桿重量2%。的用量將酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑均勻撒入，然后添加農(nóng)作物秸桿重量2%的尿素以調(diào)整C/N比，保證微生物在最適生長代謝條件下發(fā)酵秸桿，之后灌水泡田7天，將半腐熟的秸桿和酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑一同翻入地下繼續(xù)腐熟，深度在10-15厘米左右。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑，其特征在于:由重量比為3-4:1的微生物復(fù)合菌劑和復(fù)合酶劑混合而成，所述微生物復(fù)合菌劑包括綠色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、側(cè)孢短芽孢桿菌和酵母融合菌，所述綠色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、側(cè)孢短芽孢桿菌和酵母融合菌的重量比為1-2:1-2:1-2:2-3:2-3，所述復(fù)合酶劑包括發(fā)酵里氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶、發(fā)酵枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的半纖維素酶、發(fā)酵糙皮側(cè)耳菌產(chǎn)生的木質(zhì)素酶，所述纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶的重量比為1-2:1-2:1-2。2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟: A、制備微生物復(fù)合菌劑 a、制備綠色木霉菌原粉:將綠色木霉菌孢子粉與面粉按照重量比1:500混勻后接種到培養(yǎng)基上，然后放入無菌發(fā)酵室內(nèi)，溫度控制在30°C，發(fā)酵時(shí)間為35-40小時(shí)，發(fā)酵完成后進(jìn)行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存?zhèn)溆?，制得綠色木霉菌原粉； b、制備黑曲霉原粉:將黑曲霉孢子粉與面粉按照重量比1:500混勻后接種到培養(yǎng)基上，然后放入無菌發(fā)酵室內(nèi)，溫度控制在30°C，發(fā)酵時(shí)間為35-40小時(shí)，發(fā)酵完成后進(jìn)