及c-MYC/BCLXL (序列標(biāo)識(shí)符4)表達(dá)細(xì)胞，進(jìn)行了 FACS分析。其結(jié) 果，在C-MYC/H0XA2表達(dá)細(xì)胞中，基因?qū)牒蟮?05天時(shí)，確認(rèn)出作為紅血球的標(biāo)記的⑶71 以及GlyA陽(yáng)性細(xì)胞群的存在（圖14右上）。并且，在c-MYC/BCLXL表達(dá)細(xì)胞中，也確認(rèn)出 GlyA陽(yáng)性細(xì)胞群的存在（圖14右下）。從該結(jié)果可以得知，導(dǎo)入了 c-MYC基因的造血前體 細(xì)胞改變組合導(dǎo)入因子，還可以向紅血球分化。
[0158] 4.利用基因的表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)的功能性血小板的制備
[0159] 已經(jīng)明確，為了有效且大量制備巨核細(xì)胞、血小板，增加巨核前體細(xì)胞數(shù)量是有效 的。為此，需要在多核化前的巨核前體細(xì)胞中同時(shí)共表達(dá)c-MYC家族基因、polycomb基因， 提高該多核化前的巨核前體細(xì)胞的增殖能力，但是為了促進(jìn)巨核細(xì)胞的成熟（多核化），根 據(jù)情況，優(yōu)選抑制性調(diào)控c-MYC家族基因、polycomb基因的表達(dá)。
[0160] 因此，利用pMX tet off系統(tǒng)，誘導(dǎo)性調(diào)控c-MYC基因以及BMIl基因的表達(dá)而制 造血小板，并對(duì)于該血小板的生理功能進(jìn)行了研究。
[0161] 4-1.基因調(diào)控部載體的功能性的確認(rèn)
[0162] 制備在pMX tet off載體（由自治醫(yī)科大學(xué)間野博行教授提供）中整合 C-MYC-2A-BMI1 的一體式(allin one)載體（"2A" 是具有口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus)來(lái)源的自剪切（self cleavage)活性的肽（peptide)，是通過(guò)在多 個(gè)蛋白質(zhì)之間插入該序列，由此從一個(gè)啟動(dòng)子有效地獲得多個(gè)蛋白質(zhì)（Hasegawa等， 2007StemCells))。pMX tet off c~MYC 2A BMI1 裁體在雌二酉享(estradiol)存在下，表 達(dá)c-MYC基因以及BMIl基因。另一方面，在四環(huán)素（tetracycline)存在下、但雌二醇 (estradiol)不存在下，抑制c-MYC基因以及BMIl基因的表達(dá)。
[0163] 使制備的pMX tet off c~MYC 2A BMI1載體在293GPG細(xì)朐?xún)?nèi)表汰,通討FACS確 認(rèn)c-MYC基因以及BMI1基因的表達(dá)調(diào)控的情況。圖15示出用抗c-MYC蛋白質(zhì)抗體對(duì)細(xì)胞 內(nèi)的c-MYC蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，然后用Alexa647標(biāo)記的抗抗體染色，進(jìn)行FACS分析的結(jié)果。 可以得知，在整合了 pMX tet off c-MYC 2A BMI1的293GPG細(xì)朐中，在四環(huán)素存在下，表現(xiàn) 與對(duì)照293GPG細(xì)胞相同的c-MYC基因的表達(dá)量（圖15中，用293gpg以及+四環(huán)素表示的 圖表）；在雌二醇的存在下，促進(jìn)c-MYC基因的表達(dá)（圖15,+β-雌二醇）。
[0164] 從以上結(jié)果可以確認(rèn)，在此基于使用的pMX tet off c~MYC 2A BMI1載體而能夠 調(diào)控目的基因的表達(dá)。
[0165] 4-2.基于基因調(diào)控載體的巨核細(xì)胞株的制備
[0166] 采用記載于上述4-1的基因調(diào)控載體，使c-MYC基因以及BMIl基因在人類(lèi)ES細(xì) 胞株（KhES-3)來(lái)源的巨核前體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，研究其增殖能力以及分化能力。
[0167] 對(duì)于僅導(dǎo)入了載體的細(xì)胞（圖16A(a))、分別使pMX c_MYC以及Dsam BMIl強(qiáng)制件 表達(dá)的細(xì)胞株（圖16A(b))、分別采用pMX tet off c_MYC以及dMX tet off BMI1表汰的 細(xì)胞株（圖16A(c))、采用pMX tet off c~MYC 2A BMI1表汰的細(xì)朐株(圖16A(d))以及采 用pMX tet off Bill 2A c_MYC表汰的細(xì)朐株(圖16A(e))進(jìn)行了研究。在此，（d)和（e) 是夾著2A序列而布置c-MYC基因和BMIl基因的順序不同的結(jié)構(gòu)（construct)。
[0168] 在圖16A中示出這些細(xì)胞株的⑶41a+細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)。采用作為巨核細(xì)胞標(biāo)記的 抗⑶41a抗體以及抗⑶42b抗體染色各細(xì)胞株，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行了分析。采用pMX tet off c-MYC 2A BMIl制備的細(xì)朐株（圖16A(d))與分別伸dMX c_MYC以及Dsam BMIl強(qiáng)制件 表達(dá)的細(xì)胞株（圖16A(b))表現(xiàn)出相同的表現(xiàn)型，幾乎所有的集落表達(dá)巨核細(xì)胞標(biāo)記（圖 16B上部板）。進(jìn)一步地，通過(guò)pMX tet off c~MYC 2A BMI1制備的細(xì)朐株(圖16A(d))與 分別導(dǎo)入pMX tet off c-MYC和dMX tet off mil的細(xì)朐株(圖16A(c))以及通過(guò)pMX tet off ΜΗ 2A c-MYC制備的細(xì)胞株(圖16A(e))相比，表現(xiàn)出更高的增殖能力。
[0169] 并且，如果采用抗Glycophorin-a抗體以及抗CD41a抗體染色，則分別強(qiáng)制性表達(dá) pMX c-MYC以及Dsam厘遼的細(xì)胞株中存在作為巨核細(xì)胞/成紅血球通用標(biāo)記的⑶41a 7 Gly-a+的細(xì)胞集落（圖16B，下部板的左側(cè)），相對(duì)于此，通過(guò)pMX tet off c~MYC 2A BMIl 制備的細(xì)胞株中，Gly-a消失（圖16B，下部板的右側(cè)）。該結(jié)果表示通過(guò)pMX tet off c~MYC 2A BMI1制備的細(xì)朐株是，與分別強(qiáng)制件表汰dMX c-MYC以及Dsam BMIl的細(xì)朐株相比，講 一步進(jìn)行向巨核細(xì)胞的分化的細(xì)胞株。
[0170] 4-3.關(guān)于巨核細(xì)胞的多核化
[0171] 在β-雌二醇存在下，對(duì)于通過(guò)pMX tet off c~MYC 2A EMIi載體使c_MYC基因 以及BMIl基因強(qiáng)制性表達(dá)的細(xì)胞株的多核化程度作了研究。表現(xiàn)出，人類(lèi)來(lái)源巨核細(xì)胞通 常多核化程度達(dá)32N左右（圖17A)，但是通過(guò)pMX tet off c~MYC 2A厘遼載體使c_MYC 基因以及BMIl基因強(qiáng)制性表達(dá)的細(xì)胞株幾乎沒(méi)有進(jìn)行多核化，達(dá)到2N~4N。
[0172] 4-4.表達(dá)c-MYC基因以及BMIl基因的巨核細(xì)胞株來(lái)源的血小板的功能分析
[0173] 對(duì)來(lái)源于表達(dá)c-MYC基因以及BMI1基因的巨核細(xì)胞株的血小板進(jìn)行了功能測(cè)定。
[0174] 對(duì)照用的人類(lèi)末梢血來(lái)源血小板在ADP (二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate): 活化血小板的細(xì)胞內(nèi)因子）存在下，與纖維蛋白原（fibrinogen)結(jié)合，表現(xiàn)出血栓形成初 期所必須的整合素活化能力（由內(nèi)到外信號(hào)傳導(dǎo)（inside-out signal))處于正常水平（圖 18上部右側(cè)圖）。另一方面，pMX tet off c-MYC 2A BMI1細(xì)朐株(雌二醇的存在下）以 及pMX c-MYC和Dsam BMIl強(qiáng)制件表汰株,即使加入ADP，均不與纖維蛋白原結(jié)合（圖18中 部以及下部）。據(jù)此，可以得知，如果維持c-MYC基因以及BMIl基因的強(qiáng)制性表達(dá)，則不能 釋放出具有正常功能的血小板。
[0175] 接著，對(duì)于通過(guò)pMX tet off c~MYC 2A幽11載體強(qiáng)制性表達(dá)〇-歷(：基因以及8111 基因的細(xì)胞株，在+四環(huán)素以及-β-雌二醇（四環(huán)素存在但β-雌二醇不存在）條件下， 解除強(qiáng)制性表達(dá)后，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析了培養(yǎng)第4天的CD41a +/CD42b+血小板的整合素活 化能力（圖19)。其結(jié)果表示，在ADP存在下與PACl抗體（活性整合素 α II b β 3結(jié)合抗 體）結(jié)合，整合素活化能力（由內(nèi)到外信號(hào)傳導(dǎo)（inside-out signal))處于正常水平（圖 19右側(cè)）。
[0176] 從以上結(jié)果表示，從由于c-MYC基因的強(qiáng)制性表達(dá)而增殖的巨核細(xì)胞株產(chǎn)生的血 小板，存在功能障礙，但是通過(guò)解除巨核細(xì)胞株的c-MYC基因等的強(qiáng)制性表達(dá)，能夠產(chǎn)生具 有正常功能的血小板。
[0177] 可以認(rèn)為，對(duì)于上述巨核前體細(xì)胞中的c-MYC基因以及BMIl基因的表達(dá)調(diào)控而 言，還可以同樣用在紅血球前體細(xì)胞株建立時(shí)所使用的MYC家族基因、BCLXL基因、H0XA2基 因上，可以誘導(dǎo)成熟紅血球。
[0178] MYC以及BMIl表現(xiàn)出在作為巨核細(xì)胞/紅血球細(xì)胞的共同前體細(xì)胞的 MEP (megakaryocyte-erythroid progenitor)的階段或者比該細(xì)胞進(jìn)一步分化的巨核前體 細(xì)胞的階段，使細(xì)胞增殖（圖20)。并且，導(dǎo)入了 c-MYC基因以及BMIl基因的多核化前的巨 核前體細(xì)胞可以冷凍保藏，因此需要時(shí)可以從冷凍原料（stock)配制巨核細(xì)胞、血小板。
[0179] 通過(guò)導(dǎo)入MYC基因、BCLXL基因或者H0XA2基因而制備的紅血球前體細(xì)胞株同樣 也可以冷凍保藏，可以在需要時(shí)解凍而配置。
[0180] 并且，上調(diào)或下調(diào)導(dǎo)入的MYC基因、BMIl基因的表達(dá)，由此可以配制充分量的保持 生理活性的血小板或者紅血球細(xì)胞。
[0181] 產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0182] 本發(fā)明提供擴(kuò)增分化階段的細(xì)胞、并制備進(jìn)一步分化的特定細(xì)胞的方法。本發(fā)明 的方法例如可以通過(guò)應(yīng)用于血球細(xì)胞而大量供給期望的分化階段的細(xì)胞。據(jù)此，本發(fā)明尤 其對(duì)醫(yī)療領(lǐng)域中的治療法的發(fā)展會(huì)作出較大貢獻(xiàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種方法，用于制備紅血球細(xì)胞，包括： 增殖工序，在造血前體細(xì)胞、血型糖蛋白A陽(yáng)性的脫核前的細(xì)胞或者紅血球前體細(xì)胞 中，使癌基因與以下（A)或（B)基因強(qiáng)制表達(dá)，培養(yǎng)該細(xì)胞并使其增殖， (A)BCLXL基因、 (B)H0XA2 基因； 分化工序，使增殖的細(xì)胞分化成紅血球細(xì)胞。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述分化工序是如下進(jìn)行的：通過(guò)抑制所述癌基因與所 述（A)或（B)基因的強(qiáng)制表達(dá)，或者通過(guò)從所述細(xì)胞去除所述癌基因與所述（A)或（B)基 因，由此培養(yǎng)增殖的細(xì)胞。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，還包括在所述增殖工序之后，冷凍保藏增殖的細(xì)胞的工 序， 解凍冷凍保藏的細(xì)胞后，進(jìn)行所述分化工序。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述癌基因?yàn)閺腗YC家族基因中選擇的基因。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，所述癌基因?yàn)閏-MYC基因。6. -種方法，用于制備血液制劑，包括： 通過(guò)如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法制備紅血球細(xì)胞的工序； 將所述紅血球細(xì)胞與其他成分混合而獲得血液制劑的工序。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，經(jīng)過(guò)以下工序后所述紅血球細(xì)胞與其他成分混合， 在離心處理通過(guò)如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法而獲得的培養(yǎng)上清液后濃縮 的紅血球濃厚液中，加入紅血球保藏用添加液而進(jìn)行配制的工序； 照射放射線(xiàn)的工序。8. 通過(guò)如權(quán)利要求6或7所述的方法制備的血液制劑。9. 一種細(xì)胞群，包含導(dǎo)入有癌基因與以下（A)或（B)基因的造血前體細(xì)胞、血型糖蛋白 A陽(yáng)性的脫核前的細(xì)胞、紅血球前體細(xì)胞或者紅血球細(xì)胞， (A)BCLXL基因、 (B)H0XA2 基因。10. 包含如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞群的冷凍細(xì)胞組合物。11. 一種試劑盒，用于制備紅血球前體細(xì)胞或者紅血球細(xì)胞，包含用于強(qiáng)制表達(dá)癌基因 與以下㈧或⑶基因的表達(dá)載體， (A)BCLXL基因、 (B)HOXA2 基因。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種擴(kuò)增期望的分化階段的細(xì)胞而制備特定細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供一種特定細(xì)胞的制備方法，該方法是分化誘導(dǎo)細(xì)胞而制備特定細(xì)胞的方法，其中，為了擴(kuò)增期望的分化階段的細(xì)胞，在該期望的分化階段的細(xì)胞內(nèi)使癌基因強(qiáng)制表達(dá)。進(jìn)一步地，還提供一種特定細(xì)胞的制備方法，抑制由在該期望的分化階段的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的癌基因而誘導(dǎo)的、癌基因誘導(dǎo)性細(xì)胞衰老(OIS)。
【IPC分類(lèi)】C12N5/10, C12N5/078, A01N1/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105385659
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510530896
【發(fā)明人】江藤浩之, 高山直也, 中村壯, 中內(nèi)啟光
【申請(qǐng)人】國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2010年9月15日
【公告號(hào)】CA2774193A1, CN102712906A, CN102712906B, EP2500418A1, EP2500418A4, US9200254, US20120238023, US20160115449, WO2011034073A1