言，如上所述，只要是癌基因，任何 基因都能使用，但是優(yōu)選MYC家族基因，尤其優(yōu)選c-MYC基因。
[0108] 在本說(shuō)明書(shū)中，"紅血球前體細(xì)胞"是指，作為特異性紅血球分子的血型糖蛋白 A(glycophorin A)陽(yáng)性的脫核前的細(xì)胞。
[0109] 表達(dá)MYC家族基因等癌基因、以及H0XA2基因或BCLXL基因的造血前體細(xì)胞，在 添加下述物質(zhì)中的任意一種或者兩種以上組合添加的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，例如在基因?qū)牒?約4至7天，成為獲得高增殖能力的脫核前的紅血球前體細(xì)胞。即，SCF(K)~200ng/ml， 例如 l〇〇ng/ml)、TP0(10 ~200ng/ml，例如 40ng/ml)、FL(10 ~200ng/ml，例如 100ng/ml)、 VEGF(K)~200ng/ml，例如 40ng/ml)、EP0(1 ~100U/ml，例如 6U/ml)等。
[0110] 作為用于通過(guò)從表達(dá)MYC家族基因以及BCLXL基因或者H0XA2基因的造血前體 細(xì)胞獲得的紅血球前體細(xì)胞而分化誘導(dǎo)成熟紅血球細(xì)胞的適宜的條件，例如可以舉出添加 下述物質(zhì)中的任意一種或者兩種以上組合添加的條件，即TPO、IL-Ia、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-9、IL-Il、EPO(促紅細(xì)胞生成素）、GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）、 SCF、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子）、Flt3配體、肝素（h印arin)等。尤其紅血球細(xì)胞時(shí)，可 以在EP0(2~100U/mL，優(yōu)選約10U/mL)的存在下，或者在EP0(2~100U/mL，優(yōu)選約10U/ mL)、SCF(K)~200ng/mL，優(yōu)選約50ng/mL)的存在下，培養(yǎng)7~15天左右。作為培養(yǎng)環(huán) 境，只要是在機(jī)體外進(jìn)行血球細(xì)胞的分化誘導(dǎo)時(shí)的適宜的環(huán)境即可，例如在5%二氧化碳、 36~38°C (優(yōu)選37°C )的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0111] 本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中包括強(qiáng)制性表達(dá)癌基因的期望的分化階段的血球細(xì) 胞。在此，作為癌基因，可以使用上述的癌基因，例如可以使用MYC家族基因，尤其優(yōu)選 c-MYC基因。并且，"分化階段的血球細(xì)胞"是指，從完全沒(méi)有分化的階段到最終分化的階段 之間出現(xiàn)的血球細(xì)胞，指除了完全未分化階段的細(xì)胞以及最終分化階段的細(xì)胞以外的血球 細(xì)胞。例如，本實(shí)施方式的"分化階段的血球細(xì)胞"是指，例如可以舉出多核化前的巨核前 體細(xì)胞等。作為這種分化階段的血球細(xì)胞，例如可以使用從ES細(xì)胞或者iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì) 胞等。尤其，優(yōu)選從（從ES細(xì)胞或者iPS細(xì)胞制備的）網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物（又稱(chēng)作ES-sac或者 iPS-sac)獲得的血球細(xì)胞（尤其是剛從網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物分離的細(xì)胞）。并且，本實(shí)施方式中，還 可以包括除了癌基因外，進(jìn)一步強(qiáng)制性表達(dá)上述的polycomb基因的分化階段的血球細(xì)胞。 對(duì)于癌基因以及polycomb基因的強(qiáng)制性表達(dá)而言，如上所述，可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等而 實(shí)施。
[0112] 對(duì)于在期望的分化階段的細(xì)胞內(nèi)的癌基因或者polycomb基因的強(qiáng)制性表達(dá)而 言，可以通過(guò)將癌基因或者polycomb基因?qū)氲皆?期望的分化階段的血球細(xì)胞"內(nèi)強(qiáng)制 性表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，并且還可以通過(guò)向該"期望的分化階段的血球細(xì)胞"的前體細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入這些 基因，使這些基因強(qiáng)制性表達(dá)，維持其表達(dá)的同時(shí)進(jìn)行分化，由此在"期望的分化階段的血 球細(xì)胞"內(nèi)維持這些基因的強(qiáng)制性表達(dá)狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步地，還可以通過(guò)向該"期望的 分化階段的血球細(xì)胞"的前體細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入這些基因，分化為"期望的分化階段的血球細(xì)胞" 時(shí)，誘導(dǎo)這些基因的強(qiáng)制性表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。例如，作為期望的分化階段的血球細(xì)胞而擴(kuò)增多核 化前的巨核前體細(xì)胞時(shí)，還可以在其前驅(qū)階段的造血前體細(xì)胞中導(dǎo)入癌基因或者polycomb 基因，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)制性表達(dá)。
[0113] 在本實(shí)施方式中，例如，多核化前的巨核前體細(xì)胞等血球細(xì)胞具有即使冷凍保藏 后解凍也能維持細(xì)胞增殖能力以及分化能力的冷凍解凍耐性。因此，冷凍該血球細(xì)胞，可以 根據(jù)需要進(jìn)行溶解，制備分化誘導(dǎo)的血球細(xì)胞。因此，如果使用本細(xì)胞，則不需要從第一步 工藝開(kāi)始進(jìn)行從ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞制造血球細(xì)胞例如血小板的一系列作業(yè)。即，通過(guò)將本 發(fā)明的強(qiáng)制性表達(dá)癌基因或者癌基因以及polycomb基因的血球細(xì)胞作為原料大量配制， 并根據(jù)需要進(jìn)行冷凍保藏，由此可以實(shí)現(xiàn)制備工序的合理化、效率化，可以建立可迅速供給 血小板等多種血球細(xì)胞的機(jī)制。
[0114] 使用本發(fā)明的多核化前的巨核前體細(xì)胞等血球細(xì)胞而制造冷凍細(xì)胞組合物時(shí)，可 以由多核化前的巨核前體細(xì)胞等血球細(xì)胞和冷凍保藏液組成，另外也可以在組成中包含對(duì) 應(yīng)需要的添加劑等。
[0115] 作為冷凍保藏液，可以利用添加有DMSO(二甲基亞砜）的冷凍液等。具體而 言，是CELLBANKER(日本全藥工業(yè)株式會(huì)社）或BAMBANKER(日本genetics株式會(huì)社）、 TC-Protector (DS Pharma Biomedical株式會(huì)社）、白蛋白加 cp_l(極東制藥工業(yè)株式會(huì) 社）等。
[0116] 本發(fā)明中所使用的MYC家族基因、polycomb基因（例如，BMIl基因）、H0XA2基因 以及BCLXL基因包括其cDNA序列已經(jīng)被公開(kāi)的基因，而且還包含基于這些公知的cDNA序 列的同源性而根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)鑒定的同源物（homolog)。
[0117] 在MYC家族基因中，c-MYC基因的同源物是指，其cDNA序列例如由與序列標(biāo)識(shí)符 1表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的基因。由與序列標(biāo)識(shí)符1表示的核酸序列實(shí)質(zhì) 上相同的序列構(gòu)成的cDNA是指，與由序列標(biāo)識(shí)符1表示的序列構(gòu)成的DNA具有約60%以 上，優(yōu)選約 70% 以上，更優(yōu)選約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最為優(yōu)選約 99% 的一致性的序列構(gòu)成 的DNA，或者可以在嚴(yán)格條件下與由與序列標(biāo)識(shí)符1表示的核酸序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA 雜交的DNA。由這些DNA編碼的蛋白質(zhì)是對(duì)多核化前的巨核前體細(xì)胞等分化階段的細(xì)胞的 擴(kuò)增起作用的物質(zhì)。
[0118] 并且，在本發(fā)明中所使用的BMIl基因的同源物是指，其cDNA序列例如由與序列 標(biāo)識(shí)符2表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的基因。由與序列標(biāo)識(shí)符2表示的核酸 序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的cDNA是指，與由序列標(biāo)識(shí)符2表示的序列構(gòu)成的DNA具有 約60%以上，優(yōu)選約70%以上，更優(yōu)選約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最為優(yōu)選約 99% 的一致性 的序列構(gòu)成的DNA，或者可以在嚴(yán)格條件下與由與序列標(biāo)識(shí)符2表示的核酸序列互補(bǔ)的序 列構(gòu)成的DNA雜交的DNA。由其DNA編碼的蛋白質(zhì)是抑制表達(dá)MYC家族基因等癌基因的細(xì) 胞內(nèi)出現(xiàn)的癌基因誘導(dǎo)性細(xì)胞衰老，促進(jìn)該細(xì)胞的擴(kuò)增的物質(zhì)。
[0119] 在本發(fā)明中所使用的H0XA2基因或者BCLXL基因是指，其cDNA序列分別例如由與 序列標(biāo)識(shí)符3或序列標(biāo)識(shí)符4表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的基因。由與序列標(biāo) 識(shí)符3或序列標(biāo)識(shí)符4表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的cDNA是指，分別與由序列 標(biāo)識(shí)符3或序列標(biāo)識(shí)符4表示的序列構(gòu)成的DNA具有約60%以上，優(yōu)選約70%以上，更優(yōu)選 約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %，最為優(yōu)選約99 %的一致性的序列構(gòu)成的DNA，或者可以在嚴(yán)格條件 下與由與序列標(biāo)識(shí)符3或序列標(biāo)識(shí)符4表示的核酸序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA。 由其DNA編碼的蛋白質(zhì)是具有增殖紅血球前體細(xì)胞的效果的物質(zhì)。
[0120] 在此，嚴(yán)格條件是指，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易決定的雜交條件，一般是基于探針長(zhǎng) 度、清洗溫度以及鹽濃度的經(jīng)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)條件。一般，如果探針長(zhǎng)，則適宜的退火溫度會(huì)上升；如 果探針短，則溫度會(huì)降低。雜交物的形成一般依賴(lài)于互補(bǔ)鏈在比其熔點(diǎn)略低的環(huán)境中的再 退火能力。
[0121] 具體而言，例如作為低嚴(yán)格條件，可以舉出在雜交后的過(guò)濾器的清洗階段，在 37°C~42°C的溫度條件下，于0. 1XSSC、0. 1% SDS溶液中清洗等。并且，作為高嚴(yán)格條件， 例如可以舉出在清洗階段，在65°C溫度下，于5XSSC以及0. 1% SDS中清洗等。通過(guò)進(jìn)一 步提高嚴(yán)格條件，能夠得到同源性高的多核苷酸。
[0122] 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，進(jìn)一步地包括用于制備期望的分化階段的細(xì)胞（例如， 多核化前的巨核前體細(xì)胞或者紅血球前體細(xì)胞）、最終制備的特定細(xì)胞（例如，巨核細(xì)胞、 血小板或者紅血球細(xì)胞）的試劑盒。該試劑盒中，除了包含使癌基因、polycomb基因 、BCLXL 基因、H0XA2基因等在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必須的表達(dá)載體等以及試劑等以外，還包含用于細(xì)胞培 養(yǎng)的培養(yǎng)基、血清、增殖因子等添加劑（例如，TP0、EP0、SCF、肝素、IL-6、IL-Il等）、抗生物 質(zhì)等。除此之外，例如當(dāng)使用ES細(xì)胞或者iPS細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞時(shí)，還包含用于鑒定從這些 細(xì)胞配制的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物的標(biāo)記確認(rèn)用抗體（例如，針對(duì)FlkU⑶31、⑶34、UEA-I凝集素等 的抗體）等。試劑盒中所包含的試劑、抗體等可以供給在長(zhǎng)期有效地維持構(gòu)成成分的活性、 不會(huì)因容器的材質(zhì)而吸附、不會(huì)引起變質(zhì)的任意一種容器中。
[0123] 并且，根據(jù)本發(fā)明而制備的血小板以及紅血球細(xì)胞還可以以制劑的形態(tài)穩(wěn)定地供 給。根據(jù)本發(fā)明的方法而產(chǎn)生的血小板可以通過(guò)以下方法配制，即回收從巨核細(xì)胞釋放的 血小板豐富的培養(yǎng)液的組分（fraction)，使用白血球去除過(guò)濾器（例如，可以從TERUMO公 司、旭化成醫(yī)學(xué)公司等公司購(gòu)買(mǎi)）等而去除巨核細(xì)胞以及其他的除了血小板以外的血球細(xì) 胞成分。當(dāng)配制血液制劑時(shí)，還可以添加有助于血小板或紅血球細(xì)胞的穩(wěn)定化的其他成分。 這種有助于穩(wěn)定化的成分可以選擇本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法。
[0124] 進(jìn)一步具體而言，獲得的血小板例如可以通過(guò)以下方法制成制劑。
[0125] ACD-A液：將FFP (新鮮冷凍血漿（Fresh frozen plasma):是對(duì)從捐獻(xiàn)的血液獲 得的全血液進(jìn)行調(diào)配的血漿，包含除了白蛋白、凝固因子等血液成分以外的所有物質(zhì)）以 1:10的比率調(diào)配，照射15~50Gy的放射線(xiàn)后，在20~24°C下振蕩保存。用注射用水將 A⑶-A液；檸檬酸鈉22g、檸檬酸Sg以及葡萄糖22g整體調(diào)配成1L。
[0126] 當(dāng)使用以上的方法時(shí)，作為血小板的濃度，例如優(yōu)選約I X IO9血小板/mL。
[0127] 并且，如果添加 GM6001 (廣譜異輕H虧酸基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（a broad-range hydroxamic acid-based metalloprotease inhibitor)) (Calbiochem 公司，La Jolla，CA， USA)，則可以預(yù)防在冷凍保藏以及室溫保藏中發(fā)生的因血小板功能分子GPIb-V-IX或者 GPVI的切割而引起的失活。本發(fā)明的發(fā)明者們，確認(rèn)了通過(guò)該方法可以預(yù)防小鼠 ES細(xì)胞 來(lái)源的血小板失活。在此，作為關(guān)于使用人類(lèi)血小板的該血小板失活的機(jī)制的參考文獻(xiàn)，請(qǐng) 參見(jiàn) Bergmeier, W 等，Cir Res 95:677-683, 2004 以及 Gardiner, EE 等，J Thrombosis and Haemostasis，5:1530-1537, 2007。
[0128] 在此，對(duì)于容納包含血小板的制劑的容器而言，最好避開(kāi)使用諸如玻璃等使血小 板活化的材料的容器。
[0129] 另一方面，關(guān)于紅血球細(xì)胞的制劑化，可以通過(guò)以下的方法進(jìn)行。
[0130] 更詳細(xì)而言，獲得的紅血球例如可以通過(guò)以下的方法制成制劑。
[0131] 在離心處理培養(yǎng)上清液而濃縮的紅血球濃厚液中，加入MAP液（組成參照下述說(shuō) 明）而配制，照射15~50Gy的放射線(xiàn)后，在2~6°C下保存。
[0132] 使用以上的方法時(shí)，作為紅血球的濃度，例如優(yōu)選約IX 101°紅血球/mL。獲得的 紅血球可以使用