一種檢測(cè)熒光假單胞菌的方法及其試劑盒和引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)熒光假單胞菌的方法及其試劑盒 和引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 焚光假單胞菌（Pseudomonas Fluorescens)在分類學(xué)上屬于假單胞菌屬 (Pseudomonas)，菌體細(xì)胞為直的短桿狀，大小為0· 7~0· 8 X 2. 3~2. 8微米，兩端圓形，無(wú) 菌毛，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陰性，有數(shù)根極生鞭毛，利用鞭毛運(yùn)動(dòng)。熒光假單胞菌是好養(yǎng)或 者兼性厭氧的細(xì)菌，進(jìn)行嚴(yán)格的呼吸型代謝，以氧為最終電子受體，但能以硝酸鹽為替代的 電子受體進(jìn)行厭氧呼吸。其化能營(yíng)養(yǎng)為異養(yǎng)，不需要有機(jī)生長(zhǎng)因子。在酸性環(huán)境下幾乎所 有的種都不能生長(zhǎng)。熒光假單胞菌不產(chǎn)膿青酶，氧化酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性， 精氨酸雙水解酶陽(yáng)性，V. P試驗(yàn)陰性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能從蔗糖合成果膠糖。 熒光假單胞菌的生長(zhǎng)溫度范圍為4~37°C，在4°C時(shí)繁殖最快，在42°C時(shí)就會(huì)停止生長(zhǎng)，超 過70°C，只需數(shù)秒即可被殺死。
[0003] 熒光假單胞菌DNA中G+C的含量是60~61 %，細(xì)胞內(nèi)不積累聚-β -羥基丁酸鹽， 不能水解細(xì)胞外的聚-β-羥基丁酸鹽，腐生。大多數(shù)菌株分泌可溶性的黃綠色色素，這些 色素在紫外光下（波長(zhǎng)260 mm以下）呈現(xiàn)熒光，這些色素特別在缺鐵和特殊培養(yǎng)基中產(chǎn)生 (如King等1954年發(fā)表的B培養(yǎng)基）。熒光假單胞菌的某些種也產(chǎn)生特征性的藍(lán)、綠或橙 色吩嗪色素（特別在King等的A培養(yǎng)基中）。不產(chǎn)生特征性的吩嗪色素的罕見菌株有時(shí)會(huì) 以它們的營(yíng)養(yǎng)或生理特性被鑒定為其他的種。
[0004] 熒光假單胞菌屬于嗜冷菌的一種，是食品中極為常見的一種嗜冷微生物，它是一 種條件致病菌。隨著冷凍（藏）食品在日常生活中占據(jù)比例越來(lái)越大，熒光假單胞菌對(duì)人 類的危害幾率也將大大增加。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)熒光假單胞菌的檢測(cè)和鑒定依然以傳統(tǒng)培養(yǎng)方 法為標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通常需要5~7天才能確定檢測(cè)結(jié)果。不能滿足快速 高通量監(jiān)測(cè)食品的要求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction，PCR)已被運(yùn)用到檢測(cè)食品中焚光假單胞菌。然而，由于目 前運(yùn)用PCR檢測(cè)熒光假單胞菌的靶點(diǎn)較少，要么因保守性較高，種特異性不強(qiáng)，而出現(xiàn)假陽(yáng) 性結(jié)果，要么由于不同熒光假單胞菌菌株基因組序列差異比較大，容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果，造 成漏檢。因此亟需一種快速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，能夠?qū)κ称愤M(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)熒光假單胞菌的檢測(cè)的操作繁瑣， 檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，假陽(yáng)性和假陰性高的缺陷，提供一種檢測(cè)熒光假單胞菌菌株的方法即熒光假 單胞菌的雙重PCR檢測(cè)方法及其試劑盒和引物。采用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)熒光假單胞菌 菌株，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，檢測(cè)結(jié)果特異，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，具有大規(guī)模應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：一種檢測(cè)熒光假單胞菌的 方法，包括以下步驟：
[0007] (1)提取待測(cè)樣品的基因組DNA ;
[0008] ⑵以步驟⑴所得的基因組DNA為模板，以核苷酸序列分別如SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)；和
[0009] (3)檢測(cè)步驟⑵所得反應(yīng)產(chǎn)物中分別在384bp和194bp位置處單一擴(kuò)增產(chǎn)物的 存在。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，步驟（1)中，所述的提取待測(cè)樣品的基因組DNA的方法為本領(lǐng)域常 規(guī)，如使用市售的各種基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行操作，較佳的為CTAB法。所述的待測(cè)樣 品為常規(guī)的，較佳地為乳品或者液態(tài)低溫保藏乳經(jīng)過增菌培養(yǎng)得到的；所述的增菌培養(yǎng)為 常規(guī)的，較佳地為將乳品或者液態(tài)低溫保藏乳和選擇性增菌液混合，進(jìn)行培養(yǎng)；所述的選擇 性增菌液為常規(guī)的，較佳的選擇性增菌液包括如下組分：蛋白胨l〇g，胰蛋白胨l〇g，酵母提 取物l〇g，NaCL 10g，蒸餾水定容至1L。
[0011] 步驟（2)中，所述的PCR反應(yīng)為本領(lǐng)域常規(guī)，只要能夠擴(kuò)增出熒光假單胞菌菌株特 異性的基因片段即可。
[0012] 較佳地，本發(fā)明中所述雙重PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：1XPCR反應(yīng)緩沖液， 10-15mmol/L Mg2+，0. 2-0. 3mmol/L dNTP，0. 1-0. 3 μΜ 核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的引物，0. 3-0. 6 μΜ核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的引 物，0.01-0.1 U/μ L Taq酶，IO-IOOng/μ L DNA模板。較佳地，本發(fā)明中所述雙重PCR反應(yīng) 的反應(yīng)程序?yàn)椋孩兕A(yù)變性：92-95°C，3-6min ;②變性：92-95°C，20-40s ;③退火：58-63°C， 20-40s ;④延伸：68-74 °C，20-40s ;步驟②至④共30-35個(gè)循環(huán)；⑤后延伸：70-74 °C， 8-12min ;⑥降溫：降至4-15°C，結(jié)束，保存。
[0013] 更佳地，本發(fā)明中所述雙重PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：1XPCR反應(yīng)緩沖液， 12. 5mmol/L Mg2+，0. 25mmol/L dNTP，0. 2 μΜ 核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 所示的引物，0.4 μΜ核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的引物，0.04U/μ L Taq酶，40ng/μ L DNA模板。更佳地，本發(fā)明中所述雙重PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋孩兕A(yù)變性： 94°C，5min ;②變性：94°C，30s ;③退火：60°C，40s ;④延伸：72°C，30s ;步驟②至④共35個(gè) 循環(huán)；⑤后延伸：72°C，IOmin ;⑥降溫：降至12°C，結(jié)束，保存。
[0014] 步驟⑶中，所述的檢測(cè)可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法，優(yōu)選為凝膠電泳檢測(cè)法，可 以是瓊脂糖凝膠電泳，也可以是聚丙烯酰胺凝膠電泳。根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)可知，在本發(fā)明中， 若步驟（2)所得的反應(yīng)產(chǎn)物分別在384bp和194bp的位置存在單一擴(kuò)增產(chǎn)物，則說明待檢 樣品中含有熒光假單胞菌菌株；如果所得的反應(yīng)產(chǎn)物分別在384bp和194bp位置不存在單 一擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)樣品中不含有熒光假單胞菌菌株。
[0015] 本發(fā)明提供的方法尤其適用于檢測(cè)乳品中的熒光假單胞菌菌株，特別適用于液態(tài) 低溫保藏乳中的熒光假單胞菌菌株的檢測(cè)。
[0016] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是：一種用于雙重PCR檢測(cè)熒光假單胞菌的引物，所 述引物由核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示 的引物組成。
[0017] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是：一種檢測(cè)熒光假單胞菌的試劑盒，其包括前述引 物對(duì)。
[0018] 本發(fā)明中，較佳地，所述的試劑盒還包括PCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和Mg2+中 的一種或多種。更佳地，所述的試劑盒還包括基因抽提試劑和/或陽(yáng)性基因組DNA。
[0019] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0020] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0021] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：采用本發(fā)明提供的檢測(cè)方法檢測(cè)熒光假單胞菌，檢 測(cè)時(shí)間縮短了，檢測(cè)成本降低了，檢測(cè)效率提高了；并且本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，對(duì)于檢測(cè) 熒光假單胞菌具有種特異性，檢測(cè)結(jié)果可靠，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，尤 其為乳品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域提供了一種簡(jiǎn)單快速靈敏的檢測(cè)熒光假單胞菌細(xì)菌的方法，對(duì)判別 乳品中是否含有熒光假單胞菌菌株具有極大應(yīng)用空間。
【附圖說明】
[0022] 圖1是實(shí)施例1中PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。泳道1~11依次 為：熒光假單胞菌IQCC12601，熒光假單胞菌ASL 867,熒光假單胞菌ASL 55,熒光假單胞菌 ASL 823,熒光假單胞菌CICC20225,熒光假單胞菌CICC21896,熒光假單胞菌CICC21918,熒 光假單胞菌CICC23248,熒光假單胞菌CICC23250,熒光假單胞菌CICC23251，熒光假單胞菌 CICC23246, M 為 IOObp DNA Marker。
[0023] 圖2是實(shí)施列1中PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳圖譜。泳道1~32依次 為：熒光假單胞菌BDPF001，熒光假單胞菌BDPF002,熒光假單胞菌BDPF003,熒光假單胞菌 BDPF004,熒光假單胞菌BDPF005,熒光假單胞菌BDPF006,熒光假單胞菌BDPF007,熒光假單 胞菌BDPF008,熒光假單胞菌BDPF009,熒光假單胞菌BDPF010,熒光假單胞菌BDPFOl 1，熒光 假單胞菌BDPF012,熒光假單胞菌BDPF013,熒光假單胞菌BDPF014,熒光假單胞菌BDPF015， 熒光假單胞菌BDPF016,熒光假單胞菌BDPF017,熒光假單胞菌BDPF018,熒光假單胞菌 BDPF019,熒光假單胞菌BDPF020,熒光假單胞菌BDPF021，熒光假單胞菌BDPF022,熒光假單 胞菌BDPF023,熒光假單胞菌BDPF024,熒光假單胞菌BDPF025,熒光假單胞菌BDPF026,熒光 假單胞菌BDPF027，熒光假單胞菌BDPF029，熒光假單胞菌BDPF030，熒光假單胞菌BDPF031， 熒光假單胞菌 BDPF032, M 為 IOObp DNA Marker。
[0024] 圖3是實(shí)施列1中PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳圖譜。泳道1~11依次 為：惡臭假單胞菌ATCC17485,惡臭假單胞菌CICC21884,銅綠假單胞菌IQCC12625,產(chǎn)堿 假單胞菌IQCC12604,洋蔥假單胞菌CICC21624,類產(chǎn)堿假單胞菌IQCC12603,施氏假單 胞菌IQCC112612,綠針假單胞菌CICC21627,稻草假單胞菌C