等位差異設計的引物和LGC公司試劑盒Master Mix探針進 行等位位點檢測
[0042] 用實施例2中根據(jù)AhFAD2B基因等位差異設計的引物和Master Mix探針對供試 花生材料包括普通油酸花生（基因型aaBB)為母本與高油酸花生（基因型aabb)為父本雜 交的Fl代雜種、F2代分離群體進行檢測，同時以母本普通油酸花生和高油酸花生為對照， 具體方法如下：
[0043] (i)供試花生樣品基因組DNA的提取
[0044] 按TIANGEN公司提供的植物基因組DNA提取試劑盒（目錄號：DP-305)，并按照試 劑盒說明書提取供試花生樣品基因組DNA，具體步驟如下：
[0045] ①在液氮中研磨IOOmg新鮮或_20°C冷凍的樣品材料（注意：樣品要快速、充分研 磨為粉末）；
[0046] ②將研磨好的粉末迅速轉移到預選裝有700 μ 1，65°C預熱的緩沖液GPl的離心管 中（實驗前在預熱的GPl中加入巰基乙醇，使其終濃度為0. lwt% )，迅速顛倒混勻后，將離 心管放在65°C水浴20分鐘，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；
[0047] ③加入700 μ 1氯仿，充分混勾，12000rpm離心5min ;注：若提取富含多酸或淀粉 的植物組織，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1進行等體積抽提；
[0048] ④小心的將上一步所得上層水相轉入一個新的離心管，加入700 μ 1的緩沖液 GP2,充分混勻；
[0049] ⑤將混勻的液體轉入吸附柱CB3,12000rpm離心30s，棄掉廢液；
[0050] ⑥向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液⑶（使用前檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm離心30s，棄掉廢液；
[0051] ⑦向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW(使用前檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm離心30s，倒掉廢液；
[0052] ⑧重復步驟⑦；
[0053] ⑨將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置 于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；注意：這一步的目的是將吸附 柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中無水乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶切反應實驗；
[0054] ⑩將吸附柱放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量50-200 μ 1 洗脫緩沖液TE (pH值在7. 0-8. 5之間），室溫放置2min。12000rpm離心2min收集DNA溶 液；
[0055] 最后用紫外分光光度計檢測DNA的含量及純度，結果顯示所測樣品A260/280介 于1. 8~2. 0之間，表明所提取的DNA純度較高，將制得的DNA經12000g離心后，65°C烘干 30min，制得基因組DNA ;
[0056] (ii)以步驟⑴制得的基因組DNA為模板，配制PCR反應體系
[0057] PCR 引物的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 所示，Master Mix熒光探針為LGC試劑盒產品；
[0058] 以步驟⑴提取的DNA為模板，以實施例1表1中的引物檢測AhFAD2B基因基因 組序列ORF區(qū)第442位堿基序列InDel等位差異。
[0059] KASP PCR反應在LGC SNPline XL水浴PCR儀中進行，總反應體系為1 μ L。
[0060] PCR反應體系中包含10~50ng基因組DNA，0.5 yL Matser mix，0.013 yL等位基 因引物和通用引物混合物，其余用去離子水補足。加樣完畢后，低速離心、封膜。
[0061] 表2 AhFAD2B基因 SNP分型的KASP PCR反應體系
[0063] PCR擴增反應條件如下：
[0064] 94°C 預變性 15min ;
[0065] 第一步擴增反應，94°C變性 20s，61°C -55°C退火，61°C -55°C延伸 60s，10 個 Touch Down循環(huán)，每個循環(huán)降低0· 6°C ;
[0066] 第二步擴增反應，94°(：變性2〇8,55°(：退火，55°(：延伸6〇8,26個循環(huán)。
[0067] PCR擴增結束后，當反應溫度降至40°C以下，讀取數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)讀取使用LGC公司 SNPviewer軟件進行。
[0068] (iii)對步驟（ii)的檢測結果進行分析，分析使用LGC公司SNPviewer軟件進行， 當檢測到僅有HEX探針的熒光時，則第442位為A堿基插入純合，即突變基因型，記為bb ; 當檢測到僅有FAM探針的熒光時，則第442位A堿基缺失純合，即野生基因型，記為BB ;當 檢測到有HEX探針和FAM探針的熒光時，則第442位為雜合子，記為Bb。
[0069] 對于AhFAD2B基因第442位堿基InDel等位差異檢測，使用兩對熒光探針（分別 識別等位基因引物5'端的加尾序列），標有FAM的探針與顯性等位基因（B)完全匹配，另一 個標有HEX的熒光探針與隱性等位基因完全匹配（b)。
[0070] 等位基因鑒別分析實驗設計時，分別以無模板對照、已知的僅含有顯性等位基因 B、隱性等位基因 b、確定含顯隱性等位基因（Bb)的雜合花生品種為標準。未知樣本將分為 以下3類：①顯性純合子：樣本中只含有顯性純合基因 BB ;②隱性純合子：樣本中只含有隱 性純合基因 bb ;③雜合子：樣品中同時含有等位基因 B和等位基因 b。
[0071] 結果判斷：如果僅有FAM熒光信號明顯升高，則樣本為顯性純合子；如果僅有HEX 熒光信號（可檢測HEX熒光基團）明顯升高，則樣本為隱性純合子；兩種熒光信號均升高， 則樣本為雜合子Bb。為了便于判斷，數(shù)據(jù)讀取和結果分析使用LGC公司SNPviewer軟件進 行。
[0072] 為驗證本發(fā)明的可行性和準確性，實驗室選取91個未知基因型樣本（編號1-91)， 為提高實驗精確性與可信性，用魯花H(BB)與花育32(bb)作為點簇的標定，分別采用 TaqMan探針檢測方法與KASP-PCR檢測方法進行檢測驗證，分析兩種方法檢測結果的一致 性。
[0073] 表3、表4統(tǒng)計和比較了部分樣品不同檢測方法的檢測結果
[0074] 表3.不同檢測方法部分樣品檢測結果統(tǒng)計對比
[0076] 表4.等位差異位點不同檢測方法的比較
[0077]
[0078] a.實驗周期按照完成500個樣品檢測估算；b.不同的周期和成本根據(jù)使用不同的 檢測儀器計算
[0079] 由上述結果可以看出，KASP檢測結果與TaqMan探針檢測結果95%以上保持一致， TaqMan探針檢測結果更為準確。不過TaqMan探針法檢測成本過高，KASP檢測成本較低，因 此，本發(fā)明建立的AhFAD2B SNP基因分型的KASP高通量檢測體系，將使得花生育種過程中 的大群體篩選、分子標記的挖掘、重要性狀的精細定位，變得更為經濟、高效、簡單、準確。
【主權項】
1. 一種高通量檢測花生AhFAD2B基因SNP基因分型的引物，其特征在于，包括： 特異引物，核苷酸序列如SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示； 通用引物，核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示。2. -種高通量篩選AhFAD2B基因等位變異的方法，其特征在于，包括如下步驟： ⑴提樣品的DNA，經12000g離心后，65°C烘干20~35min，制得基因組DNA; (ii) 以步驟⑴制得的基因組DNA為模板，配制含有FAM淬滅基團和HEX淬滅基團的 PCR反應體系，進行PCR擴增，檢測熒光強度，讀取數(shù)據(jù)；引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1、 SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3 所示； (iii) 對步驟（ii)的數(shù)據(jù)進行分析，當檢測到僅有FAM探針的熒光時，則第442位為A 堿基缺失純合，即野生基因型，記為BB;當檢測到僅有HEX探針的熒光時，則第442位A堿基 插入純合，即突變基因型，記為bb;當檢測到有FAM探針和HEX探針的熒光時，則第442位 為雜合子，記為Bb。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟（ii)中，含有FAM淬滅基團和HEX 淬滅基團的PCR反應體系由LGC公司銷售的含有FAM淬滅基團和HEX淬滅基團的Master MiX、基因組DNA和引物組成。4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟（ii)中的PCR反應體系為1μL， 組分如下： 引物 0.013yL MasterMixQ. 5μL 基因組DNA 10~50ng cldHO 余量。5. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟（ii)中，PCR擴增反應條件如下： 94°C預變性 15min; 第一步擴增反應，94°C變性20s，61°C~55°C退火，61°C~55°C延伸60s，10個Touch Down循環(huán)，每個循環(huán)降低0· 6°C; 第二步擴增反應，94°C變性20s，55°C退火，55°C延伸60s，26個循環(huán)。6. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟（ii)中，檢測熒光強度的溫度為 40°C以下。7. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟（ii)中，數(shù)據(jù)讀取使用LGC公司 SNPviewer軟件進行。8. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟（iii)中，結果分析使用LGC公司 SNPviewer軟件進行。
【專利摘要】本發(fā)明涉及高通量檢測花生AhFAD2B基因SNP基因分型的引物及方法。引物包括：特異引物，核苷酸序列如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示；通用引物，核苷酸序列如SEQ？ID？No.3所示。本發(fā)明可以高通量檢測鑒別AhFAD2B基因等位基因變異情況，一次檢測樣本量最高可達1536個，檢測成本低，快速、準確，大大提高了花生育種選擇的效率和準確性。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105385778
【申請?zhí)枴緾N201510999219
【發(fā)明人】單雷, 徐平麗, 唐桂英, 劉瑋, 谷朝陽
【申請人】山東省農業(yè)科學院生物技術研究中心
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年12月26日