高活性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物藥物領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 (TRAIL)的突變體，該突變體與野生型TRAIL相比對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體DR5具有更高 的親和力，同時(shí)表現(xiàn)出比野生型TRAIL更高的抗腫瘤活性。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-relatedapoptosis-inducingligand, TRAIL)又稱為凋亡素2配體(ApoptosisLigand，AP〇-2L)屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族成 員，它與TNF超家族其它成員一樣，屬于Π型跨膜蛋白。由于TRAIL可以特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒有細(xì)胞毒性，因此在腫瘤的免疫治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景 (CancerLett2013,332:156-162)〇
[0003] 人TRAIL基因共編碼281個(gè)氨基酸，其相對(duì)分子量為32.5KD，等電點(diǎn)為7.63，為II型 跨膜蛋白，由胞漿區(qū)（14個(gè)氨基酸），跨膜區(qū)（26個(gè)氨基酸)和胞膜外區(qū)（241個(gè)氨基酸)組成。 TRAIL的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(胞漿區(qū)）沒有信號(hào)肽序列，TRAIL的細(xì)胞外部分降解后可形成可溶性 TRAlUsTRAILhsTRAIL缺少跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，N末端無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，可溶型分子N端氨基酸 的缺失不影響其生物活性?，F(xiàn)有技術(shù)下最常使用的兩種sTRAIL為TRAIL(95-281)和TRAIL (114-281)，研究表明從95位或114位氨基酸殘基開始構(gòu)建可溶性TRAIL(sTRAIL)克隆，表達(dá) 出的蛋白均有活性，并能與特異性受體結(jié)合。膜結(jié)合型TRAIL(全長(zhǎng)TRAIL)和可溶性胞外區(qū) TRAIL即TRAIL(95-281)或TRAIL(114-281)均可與腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，選擇性 地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒有毒性。
[0004] TRAIL的受體分為三類，一類為死亡受體（deathreceptor，DR)，包括TRAIL-R1 (DR4)和TRAIL-R2(DR5)，它們含有胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域和依賴Caspase途徑的凋亡信號(hào)的識(shí)別 結(jié)構(gòu)域。TRAIL與DR結(jié)合后將TRAIL的死亡信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而激活Caspase系統(tǒng)，最終 引起細(xì)胞凋亡。另一類為誘騙受體(decoyreceptor，DcR)，包括TRAIL-R3(DcRl)和TRAIL-R4(DcR2)，它們由于缺乏胞內(nèi)功能死亡域而不能介導(dǎo)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡，故稱為誘騙受體。 誘騙受體可競(jìng)爭(zhēng)性抑制TRAIL與DR4和DR5的結(jié)合，起促凋亡拮抗作用。第三類為可溶性受體 OPG(osteoprotegrin)，它雖然可與TRAIL結(jié)合并抑制其活性，但正常生理?xiàng)l件下與TRAIL結(jié) 合力很低（CurrOpinPharmacol2008,8:433-439)。
[0005] TRAIL與腫瘤細(xì)胞膜表面的死亡受體DIM和DR5結(jié)合可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，但同時(shí) TRAIL也可與誘騙受體DcRl，DcR2及0PG結(jié)合，而這種結(jié)合卻不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此， 設(shè)計(jì)和構(gòu)建對(duì)死亡受體DR具有更高親和力的TRAIL突變體，可以減少與誘騙受體DcR及0PG 的結(jié)合，同時(shí)提高其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性。
[0006] 本發(fā)明構(gòu)建了對(duì)腫瘤細(xì)胞表面死亡受體DR5具有更高親合力的TRAIL突變體，該突 變體顯示出比野生型TRAIL更高的抗腫瘤活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 由于TRAIL的可溶性胞外區(qū)即TRAIL( 114-281)或TRAIL(95-281)與全長(zhǎng)TRAIL具有 相同的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，本發(fā)明的目的在于構(gòu)建對(duì)死亡受體DR5具有更高親和力 的TRAIL可溶性胞外區(qū)的突變體，以提高其抗腫瘤活性。
[0008] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下： 一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的突變體，含有E263G突變，即以人TRAIL全長(zhǎng) 氨基酸序列定位，發(fā)生突變的位點(diǎn)位于人TRAIL全長(zhǎng)氨基酸序列的第263位，氨基酸由Glu突 變?yōu)镚ly。由于TRAIL的可溶性胞外區(qū)與全長(zhǎng)TRAIL具有相同的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，因 此本發(fā)明中所述突變體可以為野生型、衍生型或重組的膜結(jié)合型的TRAIL(全長(zhǎng))或含有可 溶性胞外區(qū)的TRAIL活性片段。
[0009] 上述含有可溶性胞外區(qū)的TRAIL活性片段，優(yōu)選TRAIL(114-281 )-E263G，氨基酸序 列如SEQIDNo:l所示?；蛘邇?yōu)選TRAIL(95-281)-E263G，氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述突變體在制備治療或預(yù)防細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病藥 物中的用途。所述突變體通過與DR5結(jié)合后將TRAIL的死亡信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而激活 Caspase系統(tǒng)，最終引起細(xì)胞凋亡。所述突變體增強(qiáng)了與DR5的結(jié)合力，并提高了其激活 Caspase系統(tǒng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。
[0011]進(jìn)一步的，所述藥物可以說是抗腫瘤藥物。所述藥物含有本發(fā)明所述突變體作為 藥物活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0012] 進(jìn)一步的，所述藥物還含有其它抗腫瘤藥物和/或抗腫瘤藥物增敏劑。
[0013] 本發(fā)明所述的突變體可以通過人工合成或基因克隆的方法制備所述突變體的編 碼基因，并在相應(yīng)的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)得到。所述的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌，酵母，昆蟲 細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)及活性篩選方法獲得了對(duì)死 亡受體DR5具有更高親和力的突變體TRAIL( 114-281 )-E263G(即原第263位Glu突變成Gly)， 該突變體顯示出更高的抗腫瘤活性。
[0015] 通過分子克隆的方法，構(gòu)建出TRAIL(114-281)-E263G突變體的編碼基因，并克隆 到含有Tac啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pTASH(ProteinExprPurif2002,25:430-436)的EcoRI 和Hindm酶切位點(diǎn)之間，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliJM109中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)。工 程菌發(fā)酵培養(yǎng)后離心收集菌泥，破壁后離心上清經(jīng)陽離子交換樹脂SP-SepharoseFast Flow柱層析分離純化，得到純度達(dá)95%以上的樣品，經(jīng)SEC-HPLC分析表明，表達(dá)產(chǎn)物以三聚 體形式存在。
[0016] 生物大分子相互作用儀分析顯示，突變體TRAIL(114-281 )-E263G與死亡受體DR5 的親和力(& = 7.73±0.5110-91〇是野生型丁1^幾（114-281)與死亡受體01?5的親和力(& = 1.96±0.2叉10-8]\〇的2.54倍。
[0017] MTT抗腫瘤活性分析顯示，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0 205，突變體TRAIL( 114-281 )-E263G (IC5Q = 0 · 44nM)的抗腫瘤活性是野生型TRAIL( 114-281) (IC5Q = 2 · 4nM)的5 · 5倍。
[0018]流式細(xì)胞儀分析表明，在相同摩爾濃度條件下，突變體TRAIL(114-281)-E263G促 結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0 205的凋亡率顯著高于野生型TRAIL( 114-281)。
【附圖說明】
[0019] 圖1:突變體了1^11^(114-281)12636原核表達(dá)載體口了厶-了1^11^12636示意圖。 (Ptac:Tac啟動(dòng)子;AP:氨芐抗性基因；TRAIL-E263G:TRAIL( 114-281 )-E263G編碼基因；Ori: pUC質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn);rrnBTlT2:轉(zhuǎn)錄終止子）。
[0020] 圖2:突變體TRAIL(114-281)-E263G蛋白表達(dá)情況。（箭頭所指為目的蛋白所在位 置。M:低分子量蛋白Marker;Lane1:野生型TRAIL(114-281)菌體總蛋白；Lane2:TRAIL (114-281)-E263G菌體總蛋白；Lane3:TRAIL(114-281)菌體破碎上清；Lane4:TRAIL(114-281 )-E263G菌體破碎上清；Lane5 :TRAIL( 114-281)菌體破碎沉淀；Lane6:TRAIL( 114-281 )-E263G菌體破碎沉淀）。
[0021] 圖3:10%非還原SDS-PAGE電泳分析突變體TRAIL(114-281)-E263G純化產(chǎn)物。（M: 低分子量蛋白Marker;Lane1:純化的野生型TRAIL(114-281);Lane2:純化的TRAIL(114-281)-E263G)〇
[0022] 圖4:SEC-HPLC色譜分析四種標(biāo)準(zhǔn)蛋白。（色譜柱：ShodexPROTEINKW-802.5， SHOWADENK0Κ·Κ·Japan)分析四種標(biāo)準(zhǔn)蛋白：BSA(Mff=67kDa)、雞卵清蛋白（Mff=43kDa)、 胰凝乳蛋白酶原(MW= 2 5kDa)和溶菌酶(MW= 14.4kDa)。它們的保留時(shí)間分別是11.1miη， 11 ·9min，13· 2min，14.lmin，所對(duì)應(yīng)的保留體積分別為7·8ml，8· 3ml，9· 2ml，9·9ml。
[0023] 圖5:SEC-HPLC色譜分析純化的野生型TRAIL( 114-281)。（色譜柱：ShodexPROTEIN KW-802 · 5，SH0WADENK0K·K·，Japan)分析純化的野生型TRAIL( 114-281)，保留時(shí)間為 11 · 618，保留體積為8 ·lml，純度為96 · 53% )。
[0024] 圖6:SEC-HPLC分析純化的TRAIL(114-281)-E263G突變體。（色譜柱：Shodex PROTEINKW-802.5，SH0WADENK0Κ·Κ·Japan)分析純化的TRAIL(114-281)-E263G突變體， 保留時(shí)間為11.619，保留體積為8.lml，純度為95.91 %。
[0025] 圖7 :MTT法分析野生型TRAIL( 114-281)與TRAIL(114-281 )-E263G突變體對(duì)人結(jié)腸 癌細(xì)胞C0L0 205的促凋亡活性。（野生型TRAIL( 114-281)的IC5Q = 2.4nM;突變體TRAIL( 114-281)-E263G的IC5〇 = 0.44nM)。
[0026] 圖8:人結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0 205在不同濃度的野生型TRAIL(114-281)與TRAIL(114-281 )-E263G突變體作用4h后的凋亡率差異。（0.5nM突變體TRAIL(114-281 )-E263G給藥組 vs· 0 · 5野生型TRAIL( 114-281)給藥組，*P〈0 · 05;InM突變體TRAIL( 114-281 )-E263G給藥組 vs·InM野生型TRAIL( 114-281)給藥組，#P〈0 · 01