Myb99蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物種子萌發(fā)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種MYB99蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物種子萌 發(fā)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物激素脫落酸(abscisicacid，ABA)早在20世紀60年代被人們發(fā)現(xiàn)，因其具有 促進植物葉片脫落而得名。ΑΒΑ是一種重要的植物激素，在種子休眠、種子萌發(fā)、幼苗生長、 氣孔運動以及營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換等植物生長發(fā)育過程中均發(fā)揮著重要作用；同時， ΑΒΑ在植物應(yīng)對外界各種逆境脅迫響應(yīng)中也起著重要作用，例如干旱、高鹽、冷等非生物脅 迫以及病蟲害等生物脅迫。
[0003] 近20年里，對ΑΒΑ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究取得了很多重大的進展，大量的ΑΒΑ信號通路調(diào) 節(jié)組分被發(fā)現(xiàn)，包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶、伴侶蛋白、Ε3連接酶以及各種類型轉(zhuǎn)錄因子等 等；同時，幾類ΑΒΑ受體也相繼被發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)現(xiàn)有力推動了植物中ΑΒΑ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機理的 闡明。目前為止，研究人員分別鑒定出了三種不同的ΑΒΑ受體:鎂螯合酶Η亞基CHLH/ABAR、G 蛋白偶聯(lián)受體GTG1和GTG2以及START超家族中的PYR/PYL/RCAR受體。ABAR/CHLH是植物中第 一個被鑒定出來的ΑΒΑ受體；后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn):ABAR/CHLH介導(dǎo)的ΑΒΑ信號通路非常復(fù)雜，轉(zhuǎn) 錄因子WRKY18/40/60和伴侶蛋白CPN20被報道參與其中。
[0004] ΜΥΒ類轉(zhuǎn)錄因子家族是指含有ΜΥΒ結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子。ΜΥΒ結(jié)構(gòu)域通常含有1-4 個不完全重復(fù)的氨基酸序列(R)，每一個重復(fù)序列R中大約有52個氨基酸，形成3個α螺旋;根 據(jù)含有R的多少，ΜΥΒ家族轉(zhuǎn)錄因子被分為四類，1R-、R2R3-、3R-和4RΜΥΒ轉(zhuǎn)錄因子。目前為 止，擬南芥中已鑒定出超過200個以上MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中含有兩個MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3-MYB成 員最多。MYB轉(zhuǎn)錄因子在動植物中都存在，玉米的ClorlessKCl)基因是植物中第一個被分 離鑒定的MYB轉(zhuǎn)錄因子。MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物響應(yīng)外界各種逆境脅迫、植物次生 代謝調(diào)控、細胞形態(tài)發(fā)生、脅迫應(yīng)答、分生組織形成及細胞周期控制等。目前為止，擬南芥中 已發(fā)現(xiàn)的參與ΑΒΑ信號通路中的MYB轉(zhuǎn)錄因子有：MYB2、MYB7、MYB15、MYB20、MYB30、MYB33、 MYB44、MYB52、MYB96和MYB101;這10個參與調(diào)節(jié)ΑΒΑ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的MYB轉(zhuǎn)錄因子中，只有MYB7、 MYB20和MYB30是負調(diào)節(jié)子，其余均為正調(diào)節(jié)子。MYB99在擬南芥tair網(wǎng)站上的基因號為 AT5G62320(https: //www.arabidopsis ·org/)，MYB99被報道參與調(diào)節(jié)苯丙素代謝。
[0005]植物對ΑΒΑ信號的響應(yīng)水平還與種子胎萌相關(guān)。種子胎萌是指種子收獲前早萌現(xiàn) 象，泛指種子收獲前在田間母體植株上發(fā)芽的現(xiàn)象。水稻、小麥、油菜、玉米等禾本科植物， 收獲時如遇雨和高溫，種子收獲前在田間母體植株上會出現(xiàn)提前發(fā)芽的胎萌現(xiàn)象，胎萌會 消耗種子部分營養(yǎng)和貯藏物質(zhì)，致使種子食用品質(zhì)、貯藏品質(zhì)下降，嚴重劣化了種子的品 質(zhì)、種用價值和耐貯性，將給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成較大的損失。種子的胎萌現(xiàn)象取決于種子的休眠 特性，而ΑΒΑ是調(diào)控種子休眠的主要因素，對ΑΒΑ反應(yīng)不敏感可導(dǎo)致種子胎萌的發(fā)生;相反， 對ΑΒΑ反應(yīng)敏感可抑制種子胎萌的發(fā)生。
[0006]隨著ΑΒΑ信號傳導(dǎo)研究的深入及應(yīng)用的拓展，如何利用發(fā)現(xiàn)的正負調(diào)節(jié)因子改變 植物對ΑΒΑ信號的響應(yīng)水平，控制植物種子萌發(fā)、避免胎萌現(xiàn)象、提高種子品質(zhì)和耐貯性成 為研究前沿。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種ΜΥΒ99蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物種子萌發(fā)中的應(yīng) 用。
[0008] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為如下Α或Β:
[0009]A:由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(MYB99蛋白）在如下al)或a2)中的應(yīng)用：
[0010] al)提高植物的胎萌抗性(或降低植物種子的萌發(fā)速率）；
[0011] a2)選育胎萌抗性提高的植物品種(或選育種子萌發(fā)速率降低的植物品種）。
[0012] B:由序列表中序列3所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)(MYB99蛋白）的編碼基因在 如下al)或a2)中的應(yīng)用：
[0013] al)調(diào)控植物的胎萌抗性(或調(diào)控植物種子的萌發(fā)速率）；
[0014] a2)選育胎萌抗性提高的植物品種(或選育種子萌發(fā)速率降低的植物品種）。
[0015]在本發(fā)明中，以上a2)中的所述選育胎萌抗性提高的植物品種(或選育種子萌發(fā)速 率降低的植物品種)的方法，具體可包括將所述MYB99蛋白表達量較高的植株作為親本進行 雜交的步驟。
[0016]本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0017]本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為培育胎萌抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方 法(或培育種子萌發(fā)速率降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法），具體可包括如下步驟：向受體植物中 導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到轉(zhuǎn)基因植物;所述 轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比胎萌抗性提高(或種子萌發(fā)速率降低）；
[0018]在上述應(yīng)用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的 編碼基因（即MYB99基因）是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0019] 1)編碼序列為序列表中序列2自5'末端第148至885位核苷酸所示的DNA分子；
[0020] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0021] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0022] 4)在嚴格條件下與1)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0023] 5)與1)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0024] 上述嚴格條件可為用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0025]其中，序列1由1218個核苷酸組成，為所述MYB99基因在擬南芥基因組中序列，其中435-598位為內(nèi)含子序列；序列2由1054個核苷酸組成，為所述MYB99基因的cDNA序列，其中 第148-885位為編碼序列(0RF);序列1和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)，序列3 由245個氨基酸殘基組成。
[0026]在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基 因是通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達載體導(dǎo)入所述受體植物中的。
[0027] 所述重組表達載體可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建。所述植物表達載體包括雙元農(nóng) 桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA-1 300-221、pGreen0029、 pCAMBIA3301、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。 所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它 參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體 的3'端。使用所述基因構(gòu)建重組表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強 型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛素基因 1]1^911；[1:;[11啟動子化1]13；〇、脅迫誘導(dǎo)型啟動子1(1294等，它們可單獨使用或與其它的植物啟 動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯 增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但 必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密 碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū) 域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用重組表達載 體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具 有抗性的抗生素標記物或是抗化學(xué)試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接 以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0028]在本發(fā)明中，所述重組表達載體中啟動所述蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為 35S啟動子。
[0029]更為具體的，所述重組表達載體為將所述MYB99基因插入pCAMBIA-1300-221載體 的多克隆位點XbaI與ΚρηI之間后得到的重組質(zhì)粒。
[0030]在上述方法中，將攜帶有所述ΜΥΒ99基因的所述重組表達載體導(dǎo)入所述受體植物， 具體可為:通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌 介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0031]本發(fā)明的再一個目的是提供一種降低植物種子萌發(fā)速率的方法。
[0032]本發(fā)明所提供的降低植物種子萌發(fā)速