CGCCCACCTGACCATCGACGAGCAGCTGCTGGGCTTCCGCGGCCGCT GCCCCTTCCGCGTGTACATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCGACAGCGGCACC AAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCCGCGGCACCCAGACCAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGT GAAGGAGCTGAGCAAGCCCGTGCACGGCAGCTGCCGCAACATCACCTGCGACAACTGGTTCACCAGCATCCCCCTGG CCAAGAACCTGCTGCAGGAGCCCTACAAGCTGACCATCGTGGGCACCGTGCGCAGCAACAAGCGCGAGATCCCCGAG GTGCTGAAGAACAGCCGCAGCCGCCCCGTGGGCACCAGCATGTTCTGCTTCGACGGCCCCCTGACCCTGGTGAGCTA CAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTGCTGAGCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCA AGCCCCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACACCCTGGACCAGATGTGCAGCGTGATGACC TGCAGCCGCAAGACCAACCGCTGGCCCATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAACATCGCCTGCATCAACAGCTTCAT CATCTACAGCCACAACGTGAGCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGCAAGAAGTTCATGCGCAACCTGTACATGG GCCTGACCAGCAGCTTCATGCGCAAGCGCCTGGAGGCCCCCACCCTGAAGCGCTACCTGCGCGACAACATCAGCAAC ATCCTGCCCAAGGAGGTGCCCGGCACCAGCGACGACAGCACCGAGGAGCCCGTGATGAAGAAGCGCACCTACTGCAC CTACTGCCCCAGCAAGATCCGCCGCAAGGCCAGCGCCAGCTGCAAGAAGTGCAAGAAGGTGATCTGCCGCGAGCACA ACATCGACATGTGCCAGAGCTGCTTCTAA
[0117] 序列29(SEQ ID N0:29,600bp)，含HIV-1TAT核定位信號(hào)的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的氨基 酸序列
[0118] MGRKKRGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEVSDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQ PGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCffSTSKPTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVK ffTNAEISLKRRE SMTSATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRM DDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRVYIPNKPSKYGIKILMMCDSGT KYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPE VLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLDQMCSVMT CSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQSRKKFMRNLYMGLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISN ILPKEVPGTSDDSTEEPVMKKRTYCTYCPSKIRRKASASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF
【具體實(shí)施方式】
[0119]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃 培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試 劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0120] 實(shí)施例1:ρΝΒ載體的構(gòu)建
[0121] 依次按PiggyBac轉(zhuǎn)座子5'末端重復(fù)序列（SEQ ID N0:1)、多克隆插入位點(diǎn)（SEQ ID N0:2)、polyA加尾信號(hào)序列（SEQ ID N0:3)、PiggyBac轉(zhuǎn)座子3'末端重復(fù)序列（SEQ ID NO: 4)、含c-myc核定位信號(hào)的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶編碼序列（SEQ ID NO: 5)、CMV啟動(dòng)子序列（SEQ ID N0:6)，拼接成一段長(zhǎng)序列（SEQ ID N0:7)，其中含c-myc核定位信號(hào)的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶 編碼序列、CMV啟動(dòng)子序列序列反向互補(bǔ)(這里的反向互補(bǔ)是指由于外源基因表達(dá)框與PBS 因表達(dá)框方向相反，所以顯示的是PiggyBac轉(zhuǎn)座酶編碼序列、CMV啟動(dòng)子序列的反向互補(bǔ)序 列），委托上海杰瑞生物科技有限公司合成，并在兩端分別加入AscI與PacI酶切位點(diǎn)，裝入 pUC57(購(gòu)自上海杰瑞生物），命名為pNB載體(圖譜見(jiàn)圖1)。
[0122] 實(shí)施例2:含外源基因表達(dá)框的pNB載體的構(gòu)建
[0123] 1.按EFla啟動(dòng)子的序列，委托上海杰瑞生物科技有限公司合成，并在兩端分別加 入Xbal與EcoR頂每切位點(diǎn)，裝入前面實(shí)施例1制備的pNB載體，命名為pNB328載體。
[0124] EFla啟動(dòng)子序列如SEQ ID N0:8所示。
[0125] 2.按EGFP的編碼序列，委托上海杰瑞生物科技有限公司合成，并在兩端分別加入 EcoRI與SaU酶切位點(diǎn)，裝入pNB328載體，命名為pNB328-EGFP載體。
[0126] EGFP編碼序列如SEQIDN0:9所示。
[0127] 3.按Luc熒光素酶編碼序列，委托上海杰瑞生物科技有限公司合成，并在兩端分別 加入EcoRI與SaU酶切位點(diǎn)，裝入pNB328載體，命名為pNB328-Luc載體。
[0128] Luc熒光素酶編碼序列如SEQ ID N0:10所示。
[0129] 4.按照人GM-CSF基因的酶編碼序列，委托上海杰瑞生物科技有限公司合成，并在 兩端分別加入EcoRI與SaU酶切位點(diǎn)，裝入pNB328載體，命名為pNB328-GM-CSF載體。
[0130] GM-CSF基因編碼序列如SEQIDN0:11所示。
[0131] 實(shí)施例3: PB載體的構(gòu)建與核定位情況分析
[0132] 本發(fā)明人采用免疫熒光雜交的方法檢測(cè)PB轉(zhuǎn)座酶在人為增加核定位信號(hào)前后，蛋 白亞細(xì)胞定位的改變情況。由于目前市面上尚無(wú) PB轉(zhuǎn)座酶的抗體出售，所以本發(fā)明人在PB 的前面融合一段His標(biāo)簽，用His標(biāo)簽的抗體來(lái)檢測(cè)His-PB融合蛋白的亞細(xì)胞定位情況。
[0133] 具體步驟如下：
[0134] l.pcDNA3.1_cPB 載體的構(gòu)建
[0135] 按照人c-myc核定位信號(hào)編碼序列、6 XHis標(biāo)簽編碼序列、1?轉(zhuǎn)座酶編碼序列，拼 接成一段myc-hiS-PB融合蛋白的編碼序列（SEQIDN0 :17)，委托上海杰瑞生物科技有限公 司全序列合成，并在兩端分別加入Hindlll與Clal酶切位點(diǎn)，裝入pcDNA3.1載體（購(gòu)自 Invitrogen公司），命名為pcDNA3 · 1-cPBo
[0136] 2.對(duì)照載體pcDNA3.1-PB的構(gòu)建
[0137] 按照6 X His標(biāo)簽編碼序列、1?轉(zhuǎn)座酶編碼序列，拼接成一段His-ro融合蛋白的編 碼序列（SEQ ID N0:18)，委托上海杰瑞生物科技有限公司全序列合成，并在兩端分別加入 Hindlll與Clal酶切位點(diǎn)，裝入pcDNA3.1載體(購(gòu)自Invitrogen公司），命名為pcDNA3.1-PB。
[0138] 3.準(zhǔn)備5 X106生長(zhǎng)狀態(tài)良好的低代數(shù)Jurkat細(xì)胞株(購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中 心，六1'<：〇，通過(guò)1^01123 213-1'|11(316(^6(31：01'儀器（按儀器操作說(shuō)明書進(jìn)行），分別將6以區(qū)的 pcDNA3.1-cPB與pcDNA3.1-PB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，置37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)。
[0139] 4.電轉(zhuǎn)2天后，離心，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗1次，隨后棄掉roS，重復(fù)3次;加 5%多聚甲 醛，50μ1/孔，放置5-10分鐘；離心，小心棄掉多聚甲醛溶液；1 X BSA洗3次，每次浸泡2分鐘； 每孔加入His_Tag(2A8)Mouse mAb 100μΙ(購(gòu)自Abeam公司，抗體稀釋100倍），室溫放置1小 時(shí)；離心，1 X BSA洗3次，每次浸泡2分鐘；每孔加入抗體Alexa Fluor 594-con jugated Affinipure Donkey Anti-mouse IgG(H+L)(貝勾自Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司，按1:200比例稀釋），每孔50μ1，避光室溫放置60分鐘；1 XBSA洗3次，每次浸泡2分鐘， 離心，棄掉洗滌液，加 1 X DAPI 50μ1染色10分鐘；用1 X BSA洗3次，每次浸泡2分鐘。離心，加 1 X BSA，30μ1/孔，熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0140] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了 pcDNA3.1_cPB的質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞中，His標(biāo)簽抗體檢出 信號(hào)(紅色)幾乎與DAPI信號(hào)（藍(lán)色，顯示細(xì)胞核)完全重疊，表明cmyc-his-PB融合蛋白主要 聚集在細(xì)胞核內(nèi)（圖2A)。而在轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-ro對(duì)照質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞中，在藍(lán)色信號(hào) 外，也存在紅色信號(hào)，表明his-PB融合蛋白除分布在細(xì)胞核外，在細(xì)胞漿中也同樣存在（圖 2B)〇
[0141] 結(jié)果表明，增加了 c-myc核定位序列，能有效提高PB轉(zhuǎn)座酶在細(xì)胞核內(nèi)的富集程 度。
[0142] 實(shí)施例4: pNB載體在Jurkat細(xì)胞內(nèi)的整合效率定量檢測(cè)
[0143] 準(zhǔn)備5 X 106代代數(shù)旺盛的Jurkat細(xì)胞，通過(guò)Lonza 2b_Nucleofector儀器，分別將 6yg的pNB328-EGFP以及5yg PB513B-1 (提供包含ITR元件的EGFP表達(dá)質(zhì)粒，購(gòu)自System Bioscience公司）+2yg PB210PA-1質(zhì)粒(提供1?轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核中，置37 °C、5 % C02孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按1:10的比例傳代培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后的第12小時(shí) (P0)、第5天(P0+5)，l次傳代后(Pl)、2次傳代后(P2)、3次傳代后(P3)，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè) EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例變化。
[0144] 由于T細(xì)胞的增殖非?？欤?:10的比例稀釋傳代，非整合的質(zhì)粒隨著細(xì)胞的分 裂，質(zhì)粒很快丟失。因而，3代以后，綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞可以認(rèn)為綠色熒光表達(dá)框已經(jīng)穩(wěn)定 整合。通過(guò)流式檢測(cè)綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例，可確定整合的效率。
[0145] 如圖3所示，隨著連續(xù)1:10比例的傳代，EGFP陽(yáng)性的Jurkat細(xì)胞比例逐漸下降。3次 傳代后，二元系統(tǒng)PB轉(zhuǎn)座子(PB513B-1+PB210PA-1)轉(zhuǎn)染的Jurkat T細(xì)胞，EGFP陽(yáng)性細(xì)胞比 例為6.5% (整合效率6.5% );而改造過(guò)的一元系統(tǒng)的PB轉(zhuǎn)座子pNB328-EGFP轉(zhuǎn)染的Jurkat T細(xì)胞，EGFP陽(yáng)性細(xì)胞比例為36.4 % (整合效率36.4 % )。
[0146] 以上結(jié)果表明，改造過(guò)的一元系統(tǒng)的PB轉(zhuǎn)座子一pNB載體系統(tǒng)能高效的介導(dǎo)外源 基因的整合。
[0147] 實(shí)施例5: pNB328-EGFP載體在Jurkat、K562細(xì)胞內(nèi)的整合分析
[0148] 準(zhǔn)備5Χ106生長(zhǎng)狀態(tài)良好的低代數(shù)Jurkat、K562細(xì)胞株(購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收 藏中心，ATCC)，通過(guò)Lonza 2b-Nucleofector儀器(按儀器操作說(shuō)明書進(jìn)行），分別將6yg的 PNB328-EGFP、pcDNA3.1-EGFP(購(gòu)自Addgene公司）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核中，置37°C、5%C02孵 箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按1:10的比例傳代培養(yǎng)。3代后，應(yīng)用熒光顯微鏡記錄細(xì)胞內(nèi)綠色熒 光的表達(dá)情況;收集1 X 1〇5細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
[0149] 結(jié)果顯示，對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染后的Jurkat、K562在3代后，幾乎檢測(cè)不到 綠色熒光信號(hào)，表明轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)、處于游離狀態(tài)存在的非整合質(zhì)粒隨著細(xì)胞分裂已經(jīng)完 全丟失；相反，PNB328-EGFP轉(zhuǎn)染后的Jurkat、K562在3代后，仍能檢測(cè)到強(qiáng)烈的綠色熒光信 號(hào)（圖4A、4B、4C、4D)，表明EGFP表達(dá)框已經(jīng)整合到細(xì)胞基因組內(nèi)，能隨著細(xì)胞分裂穩(wěn)定存在 并表達(dá)。
[0150] 流式結(jié)果表明，？_32846??質(zhì)粒轉(zhuǎn)染1虹1?^、1(562后，整合效率分別為36.4%與 40.54%(圖 5Α、5Β)。
[0151] 實(shí)施例6 :pNB328-EGFP載體在原代Τ細(xì)胞內(nèi)的整合分析
[0152] 準(zhǔn)備1 X 107新鮮分離獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核中，置37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)；6小時(shí)后轉(zhuǎn)移到含30ng/mL抗CD3抗體、 3000IU/mL IL-2(購(gòu)自Novoprotein公司）的6孔板中，置37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿 后，按1:10的比例傳代培養(yǎng)。3代后，應(yīng)用熒光顯微鏡記錄細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的表達(dá)情況；同 時(shí)，收集1 X 1〇5細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
[0153] 結(jié)果顯示，對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染后的原代T細(xì)胞3代后，幾乎檢測(cè)不到綠色 熒光信號(hào)，表明轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)、處于游離狀態(tài)存在的非整合質(zhì)粒隨著細(xì)胞分裂已經(jīng)完全丟 失;相反，PNB328-EGFP轉(zhuǎn)染后的原代T細(xì)胞在3代后，仍能檢測(cè)到強(qiáng)烈的綠色熒光信號(hào)，表明 EGFP表達(dá)框已經(jīng)整合到細(xì)胞基因組內(nèi)，能隨著細(xì)胞分裂穩(wěn)定存在并表達(dá)(圖4E、4F)。
[0154] 流式結(jié)果表明，PNB328-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代T細(xì)胞后，整合效率分別為56.9 % (圖 5C)〇
[0155] 實(shí)施例7 :pNB328-EGFP載體在小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)的整合分析
[0156] 準(zhǔn)備5 X 106小鼠H9胚胎干細(xì)胞株(購(gòu)于ATCC)，通過(guò)Lonza 2b_Nucleofector儀器， 將6yg的pNB328-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核中，置37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按1: 10的比例傳代培養(yǎng)。3代后，應(yīng)用熒光顯微鏡記錄細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的表達(dá)情況；同時(shí)，收集1 X10 5細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
[0157] 結(jié)果顯示，pNB328-EGFP轉(zhuǎn)染后的小鼠胚胎干細(xì)胞在3代后，仍能檢測(cè)到強(qiáng)烈的綠 色熒光信號(hào)，表明EGFP表達(dá)框已經(jīng)整合到細(xì)胞基因組內(nèi)，能隨著細(xì)胞分裂穩(wěn)定存在并表達(dá) (圖4G、4H)。流式結(jié)果表明，pNB328-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠 ES細(xì)胞后，整合效率分別為73.12% (圖OT)。
[0158] 實(shí)施例8: pNB328_luc載體