一種熱休克蛋白70功能肽與甲胎蛋白抗原表位肽復(fù)合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熱休克蛋白70功能肽與甲胎蛋白抗原表 位肽復(fù)合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲胎蛋白（AFP)作為一種腫瘤胚胎抗原，免疫原性很弱，AFP對(duì)肝癌生長的促進(jìn)作 用以及對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用，提示其可以成為一種靶點(diǎn)在肝癌的生物治療中發(fā)揮作用。 近來的研究證實(shí)甲胎蛋白存在不同的抗原表位為肝細(xì)胞癌的免疫治療提供了解決問題的 途徑。Butterfield等研究發(fā)現(xiàn)在小鼠的免疫系統(tǒng)中也找到了誘發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的甲胎蛋白抗 原表位肽，不但可以在體誘發(fā)針對(duì)表達(dá)AFP腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，而且產(chǎn)生的保護(hù)性免疫效 應(yīng)可以克服AFP的免疫抑制，為肝癌的防治提供新的策略。但是AFP在患者體內(nèi)不能被有效 地遞呈和激活免疫細(xì)胞是防治策略實(shí)施的瓶頸所在。通過增強(qiáng)AFP的免疫原性使免疫細(xì)胞 對(duì)其產(chǎn)生強(qiáng)而有效的主動(dòng)識(shí)別對(duì)于肝癌的治療有重要意義。目前增強(qiáng)AFP特異性免疫反應(yīng) 的策略集中于AFP核酸疫苗，基因重組AFP載體介導(dǎo)DC細(xì)胞免疫和AFP質(zhì)粒與腺病毒多基因 重組聯(lián)合免疫，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上述免疫策略可以檢測到一定水平的特異性T細(xì)胞反應(yīng)， 但是相對(duì)有限的體內(nèi)保護(hù)效應(yīng)，復(fù)雜的基因技術(shù)操作程序，可能產(chǎn)生的耐性疫苗及重組基 因的安全性問題局限了之后的深入研究。增強(qiáng)AFP免疫原性的另一個(gè)重要而簡便的方法就 是應(yīng)用有效的免疫佐劑，而熱休克蛋白70的"分子伴侶"和"內(nèi)在佐劑"作用成為解決的有效 策略。
[0003]已證實(shí)熱休克蛋白70具有良好的"免疫佐劑"效應(yīng)，其與不同的腫瘤抗原肽相伴可 誘發(fā)腫瘤特異性主動(dòng)免疫。研究表明對(duì)某個(gè)抗原的保護(hù)性細(xì)胞反應(yīng)可以通過HSP70偶聯(lián)抗 原肽復(fù)合物免疫而實(shí)現(xiàn)，尤其對(duì)于抗原弱或難以誘發(fā)免疫的抗原，HSP70呈現(xiàn)了良好的內(nèi)在 免疫佐劑效應(yīng)。本研究在前期工作基礎(chǔ)上通過簡便實(shí)用的氨基酸偶聯(lián)法構(gòu)建HSP70功能肽-AFP表位肽復(fù)合物，合成多肽能較好的保持肽的結(jié)構(gòu)，具有成本低，合成量多，反應(yīng)快，產(chǎn)物 相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種熱休克蛋白70與甲胎蛋白抗原表位肽的復(fù)合物及其 制備方法。
[0005] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 一種熱休克蛋白70功能肽與甲胎蛋白抗原表位肽復(fù)合物，由熱休克蛋白70功能肽 和甲胎蛋白抗原表位肽偶聯(lián)構(gòu)成，所述的復(fù)合物的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明所述的熱休克蛋白70功能肽與甲胎蛋白抗原表位肽按照摩爾比為1:1。
[0008] 本發(fā)明所述的熱休克蛋白70功能肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述的甲 胎蛋白抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009] 本發(fā)明所述的復(fù)合物在制備治療或預(yù)防肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0010] 一種治療肝癌的藥物組合物，包括上述所述的熱休克蛋白70功能肽與甲胎蛋白抗 原表位肽復(fù)合物及一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
[0011] 所述輔料包括:水溶性填充劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調(diào)節(jié)劑等。
[0012] 所述的水溶性填充劑輔料為選自以下的一種或一種:甘露醇、低分子右旋糖苷、山 梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。
[0013] 所述的PH調(diào)節(jié)劑為選自以下的一種或幾種:枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等非 揮發(fā)性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀或氫氧化銨、碳酸鈉或碳酸鉀或碳酸銨鹽、 碳酸氫鈉或碳酸氫鉀或碳酸氫銨鹽等生理可接受的有機(jī)或無機(jī)酸和堿及鹽等。
[0014] 所述的穩(wěn)定劑為選自以下的一種或幾種:EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞 硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十 二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷等。優(yōu)選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇 6000、三羥甲基氨基甲烷。
[0015] 所述的滲透壓調(diào)節(jié)劑是氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。
[0016] 所述藥物組合物可以通過肌肉、靜脈內(nèi)、皮下注射途經(jīng)進(jìn)行給藥，優(yōu)選的劑型為凍 干粉或溶液注射劑。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為:通過簡便實(shí)用的氨基酸偶聯(lián)法構(gòu)建HSP70功能肽-AFP表位 肽復(fù)合物，合成多肽能較好的保持肽的結(jié)構(gòu)，具有操作簡單，成本低，合成量多，反應(yīng)快，產(chǎn) 物相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0018] 圖1是HSP70-P/AFP-P復(fù)合物的高效液相色譜圖；
[0019] 圖2是HSP70-P/AFP-P復(fù)合物質(zhì)譜分析圖；
[0020] 圖3是實(shí)施例2體內(nèi)H22肝癌荷瘤小鼠治療實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；
[0021 ]圖4是實(shí)施例3淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。 [0023]實(shí)施例1多肽的合成及鑒定
[0024] 根據(jù)熱休克蛋白70(HSP70)功能肽TKDNNLLGRFELSG和甲胎蛋白（AFP)FMNKFIYEI合 成所需的氨基酸，采用固相多肽合成技術(shù)，以Ν-α-Fmoc保護(hù)的氨基酸為原料，F(xiàn)moc-AA-Wang 樹脂為載體，HBTU方法偶聯(lián)。
[0025] 具體步驟為：
[0026] 1 ·將樹脂F(xiàn)moc-AA-Wang樹脂（lmmol)用哌啶-DMF(V: V = 1: 5)脫除Fmoc保護(hù)基，15 分鐘。
[0027] 2.DCM 和 DMF 洗滌后，分別加入 Fmoc 保護(hù)基-氨基酸（3mmol)、HBTU(3mmol)、DIEA (3mmol)進(jìn)行偶聯(lián)，30分鐘。
[0028] 3. DCM和DMF洗滌后，循環(huán)以下步驟:脫除Fmoc保護(hù)基-洗滌-偶聯(lián)-再洗滌，直至最 后一個(gè)氨基酸偶聯(lián)結(jié)束，完成整條肽鏈的合成，按照IEYIFKNMFGSLEFRGLLNNDRT順序依次偶 聯(lián)。
[0029] 4.以切肽試劑TFA:苯甲硫醚:苯酚:乙二硫醇:雙蒸水(82.5: 5:5:2.5:5)將多肽從 載體樹脂上裂解下來，并同時(shí)脫去所有保護(hù)劑，2小時(shí)。
[0030] 5.加入4°C預(yù)冷的乙醚100ml使多肽沉淀，離心收集沉淀物，并用乙醚洗滌3遍，真 空抽干，得到多肽粗品。
[0031] 純化：將得到的粗品多肽分析鑒定，粗品用制備型反相液相色譜（RP-HPLC)法純 化，以HPLC和MS分析鑒定。色譜柱為Sy_etrix 0DS-R，4 · 6*250_，5μπι;流動(dòng)相A: 0 · 1 %TFA/ 乙腈，流動(dòng)相B: 0.1 %TFA/H20;線性洗脫梯度：18 %A-43 ;流速為lml/min，檢測波長為 220nm; -次檢測進(jìn)樣量為20μ1。經(jīng)冷凍干燥機(jī)后得到精品多肽。
[0032] 其中AA=Amino Acid氨基酸
[0033]