[0048] 使用抓10ml血漿采集管化DTA抗凝管)采集收集14例正常人和77例鼻咽癌患者靜 脈空腹血約8ml，輕輕顛倒3次，化內(nèi)離屯、，X 1600g，lOmin，4°C;冰上小屯、吸取上層血漿至新 的離屯、管，編號、標記，-80°C保存。
[0049] 血漿中抽提總RNA利用血漿核酸抽提試劑盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Ca1:alog no.55114，Qiagen公司）抽提，具體步驟如下：
[0050] (1)吸取300ul蛋白酶K至50ml離屯、管。
[0051 ] (2)加3ml血漿至離屯、管。
[0052] (3)加2.4ml carrier-A化mix至離屯、管，蓋好管帽，滿旋振蕩30s混勻。
[0053] (4)將離屯、管放到水浴箱中60°C解育30min。
[0054] (5)從水浴箱中取出離屯、管，旋開管蓋。加入5.4ml ACB緩沖液至離屯、管，關(guān)閉管 蓋，滿旋震蕩20s，充分混勻。
[0055] (6)將離屯、管置于冰上解育lOmin。由于巧光實時定量PCR需要參照，血清循環(huán)RNA 檢測過程中無公認可靠的內(nèi)參基因（管家基因），因此我們選擇往3ml血漿中加入Ing無關(guān)質(zhì) 粒pGL3 (購自Promega公司）作對照。
[0056] (7)采用真空抽吸方法純化血清核酸(包括血清中的RNA及加入的pGL3質(zhì)粒DNA): 組裝好20ml延長管，mini柱和真空連接器，打開真空累，待到全部裂解液通過mini柱(約10 分鐘），關(guān)閉真空累，將壓力釋放到0,卸下并丟棄延長管。
[0057] (8)加600ul ACW1緩沖液到mini柱，維持mini柱蓋子呈打開狀態(tài)，打開真空累，待 到ACW1完全通過mini柱，關(guān)閉真空累，將壓力釋放到0。（第一遍洗涂，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[005引（9)加750ul ACW2緩沖液到mini柱，維持mini柱蓋子呈打開狀態(tài)，打開真空累，待 到ACW2完全通過mini柱，關(guān)閉真空累，將壓力釋放到0。（第二遍洗涂，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[0059] (10)加750ul 100%乙醇至mini柱，維持mini柱蓋子呈打開狀態(tài)，打開真空累，待 到乙醇完全通過mini柱，關(guān)閉真空累，將壓力釋放到0。（第Ξ遍洗涂，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[0060] (11)關(guān)閉mini柱的蓋子，將mini柱卸下來，丟棄連接器，將mini柱放到干凈的2ml 收集管，20,000x g離屯、3min。（去除殘留的乙醇）
[0061] (12)將mini柱放到一個新的2ml收集管，打開管蓋，放到水浴箱中56°C解育lOmin， 直到mini膜完全干燥。將mini柱放到一個干凈的1.5ml洗脫管，丟棄上一步的2ml收集管，加 入20ul AVE緩沖液(不含carrier RNA)至mini膜的中央，關(guān)上蓋子，室溫解育3min。20，OOOx g離屯、Imin，洗脫純化的核酸。
[006引 lyg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行實時巧光定量PCRdL0C284454正向引物為5'-ATCCCCAACTCTGCAACTGG-3 ' 如沈Q NO: 6所示，和反向引物5 ' -ACACAGCTGGCTTCCCTTTT-3 ' 如 沈Q NO:7所示。
[0063] 用于對照的質(zhì)?？?1^3正向引物為5'-了0：41'(：176(：了0：44〔4〔0：-3'如沈9^:8所示， 和反向引物5'-1^61'(：口7〇1^'6口'〇：444-3'，如沈0備:9所示。
[0064] 進行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，取cDNA為模板，加入SEQ ID N0:6、7、8、9所示的引物W及PCR 反應液，進行PCR擴增，檢測樣本闊值Cq;同時，P化3質(zhì)粒DNA液10倍梯度稀釋，作為校對樣 本，在每個PCR反應板中進行檢測，記錄Cq值；內(nèi)參pGL3質(zhì)粒PCR擴增;實時巧光定量PCR反應 體系 iTaqi、i Universal SYB民K Green Super Mix 5 μ1 PCR Forward Primer ( ΙΟμηι) 0.5μ1 P(?R Reverse F*rimcr (ΙΟμηι) 0.5μ1
[0065] cDNA 役板 2.0μΙ dH,0 2μ1 Total 10 μ1
[0066] 實時巧光定量PCR反應步驟 1 95 C 30 see '2 %'〔' 5 see
[0067] 3 60 C 30 sec 4 Go lo step 2 for more 35 times 5 Perform mcliing curve from 55.0 C lo 95.0 C, read every 0.2 C, hold for 1 see
[0068] 制作標準曲線:上述檢測完成后，拷貝數(shù)WlO為底取對數(shù)作為橫坐標，Cq值為縱坐 標作圖，繪制標準曲線，計算斜率S，然后根據(jù)公式E = l〇hW-i，計算擴增效率E;
[0069] 計算:選中樣本和校對樣本檢測孔，應用實時巧光定量PCR儀的隨機軟件得出樣本 闊值Cq(T)和校對樣本闊值Cq(C)，根據(jù)公式Q=巧+l)AEq，ACq=[Cq(T)-Cq(C)]，得出基因 的校正起始拷貝數(shù)Q;將L0C284454的Q值與pGL3質(zhì)粒的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到 L0C284454的相對表達量，采用impaired t-test檢驗計算P值。
[0070] 2.結(jié)果
[0071] L0C284454在正常人血清中不表達或者表達很低，而在鼻咽癌患者血清中高表達P <0.00!(圖2)。
[0072] 實施例3,原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌中的表達與患者預后相關(guān) [007引1.材料方法
[0074] 1.1設(shè)計并合成雜交探針
[0075] 為了采用原位雜交方法檢測L0C284454的表達情況，我們設(shè)計了針對原位雜交檢 測L0C284454表達的寡核巧酸探針及陽性對照兩組原位雜交寡核巧酸探針各3條。
[0076] 用于原位雜交檢測L0C284454表達的寡核巧酸探針：
[0077] L0C284454探針1:5 ' -GACCGGAAAATAACAAACAAAAACTCTGCCTCAG-3 ' 如SEQ NO: 10所 示，
[0078] L0C284454探針2:5 ' -GTGATAGAACTTTAGTCTACCCTCCTCCGAAAAA-3 ' 如SEQ NO: 11所 示，
[0079] L0C284454探針3:5'-GTACAGACAACAAGTTCATTTATTTTCAACGGGAC-3'如沈Q NO: 12所 /J、- 〇
[0080] 陽性對照探針(檢測看家基因 GAPDH):
[0081 ] GAPDH探針1:5 ' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3 '，如沈Q NO: 13所示，
[0082] GAPDH探針2:5 ' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3 '，如沈Q NO: 14所示，
[0083] GAPDH探針3:5 ' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3 '，如沈Q NO: 15所示。
[0084] 采用化學合成方法合成上述設(shè)計的各基因特異性寡核巧酸探針序列。
[0085] 1.2寡核巧酸探針標記試劑盒和原位雜交檢測試劑
[0086] 地高辛寡核巧酸加尾試劑化ig Oligonucleitide Tailing Kit Generation, Roche公司），抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測試劑盒(Anti-Digoxigenin-PODJab fragments，Roche公司），增強原位表達檢測信號的TSA信號放大系統(tǒng)（TSA? Biotin System,肥L700試劑盒，Perki址Imer公司），DAB染色試劑盒（北京中山公司），20x巧樣酸鋼 緩沖溶液（saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(；Dextran sulphate),去離子甲酯胺 (Deionized Formamide)，多聚腺巧酸（polyadenylic acid,Poly A)，多聚脫氧腺巧酸 (polydeoxyadenylic acid,Poly dA)，變性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母轉(zhuǎn)運RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫蘇糖醇化TT)，50x鄧罕 氏緩沖液(Denhardts's solution)，憐酸緩沖液(PBS buffer)，胃蛋白酶Κ，牛血清白蛋白 (BSA)，S乙醇胺（ΤΕΑ),ΤΝΒ BuffeHO.lM Tris-HCl，pH7.5,0.15M 化化，0.5%Blocking Reagent)，TNTBuffer(0.1MTris-肥l，抑7.5,0.15M化化，0.05%Tween20)，醋酸酢，阻 斷子式齊iKBlockin邑rea邑ent a邑ent，Roche公司）。
[0087] 1.3其他主要試劑和材料
[008引無水乙醇、90 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、松節(jié)油、雙蒸水、PBS緩沖液(pH7.2~ 7.4，化(：113711111101/1，1((：12.7臟01/1，化抽口04 4.311111101/1，1(此口04 1.411111101/1);3%甲醇-雙氧水溶液(80%甲醇和30%雙氧水配置）；0.01mol/L巧樣酸鹽緩沖液（citrate buffer, CB，p冊.0±0.1，9ml 0.1 M巧樣酸溶液和41ml 0.1 M巧樣酸鋼溶液加入450ml蒸饋水中臨時 配置后再校正工作液抑值）；0.1 %膜蛋白酶;蘇木素；1 %鹽酸酒精（1ml濃鹽酸+99ml 70 % 酒精配置）；封片膠(PTS Cure Mountn );專用蓋玻片(480X240mm2)定制于鄭州玻璃儀器 廠。Leica低烙點（58°C)石蠟，國產(chǎn)蜂蠟，無水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醒(O.Olmol/L， 抑7.4，DEPC雙蒸水和PBS緩沖液配制），蘇木素，伊紅，中性封片樹膠，蓋玻片，載玻片。
[0089] 1.4標記探針
[0090] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit進行寡核巧酸探針標記，反應體系如 下。 ΙΠΟρη?οΙ oiigomickotide -Κ??1Η::0 二9 μΙ (conlroi: control oligoniic!cuik】;c + 加葉:0 4μ1) [0091 ] Re狂她cm buffer 4μ1 Cod：? 4μ1 Dig-dUTP ][[!
[0092] ciATP 1μ! Termirial transferase 1μ1
[009引混勻，稍離屯、。37°C水浴反應30min，加2μ1邸TA(0.2M，PH 8.0)中止反應。
[0094] 1.5寡核巧酸探針標記后純化
[0095] 為了增加標記探針的純度，需對已標記的探針進行純化，具體操作如下：
[0096] 1)探針反應混合物(2化1)+2.5414]?11化巧如1100%冷乙醇(-20°〇.
[0097 ] 2) -70°C 沉淀 60min，or-20°C 化。
[0098] 3)13.000Xg 4°C離屯、15min。
[0099] 4)棄上清，用50μ1冰冷的70% (V/V)乙醇洗涂。
[0100] 5)13.000xg 4°C，離屯、5min。
[0101] 6)棄上清，真空4°C干燥。
[0102] 7)用無菌雙蒸水重溶探針。
[0103] 1.6原位雜交檢測存檔石蠟切片中L0C284454的表達
[0104] 石蠟切片雜交前處理
[0105] 1)4°C保存的石蠟切片置于58°C烤片30min，烙化表面石蠟。
[0106] 2)二甲苯依次脫蠟3X5min。
[0107] 3)梯級酒精洗