中Η-9β與Η-15β，以及Η-13β與Η 3-17 的相關性確定的。因此，Η3-17為β構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻關于相 關類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論 值與實驗值基本一致(圖2)。
[0026]實施例2:化合物(I)藥理作用試驗 [0027] 一、材料和儀器
[0028] HepG2人肝癌細胞株購自中科院生物化學與細胞生物學研究所。L02正常人肝細胞 株由復旦大學中山醫(yī)院肝癌研究所饋贈?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98% APMI-1640培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司。標準小牛血清購自Biowest公司。3-(4,5-二甲基噻挫-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMS0)、臺盼藍(TrypanBLue)、二氯熒光素雙 醋酸鹽(DCFH-DA)均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。其他常用試劑均為分析純。 [0029] 微量天平(瑞士梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通臺式離心機(上海安亭科 學儀器廠）。數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(上海躍進醫(yī)療機械廠，HH.W21.600S)。二氧化碳細胞培養(yǎng) 箱(美國FormaScientif ic公司）。高速冷凍離心機(美國Thermo公司，IECMICROMAXRF)。超微 量紫外分光光度計(美國ThermoHsher公司，NanoDrop-1000)。紫外成像系統(tǒng)(上海復日科技 有限公司，F(xiàn)R-200A)。酶聯(lián)免疫檢測儀，熒光分光光度計(HitachiF2500)。
[0030] 二、試驗方法
[0031] 1、細胞培養(yǎng)
[0032] 將細胞常規(guī)接種于含10% (體積分數(shù))小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、 5 % C02濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033] 2、化合物（I)干預培養(yǎng)液的配置
[0034] 將45.44mg化合物（I)溶于10mL二甲基亞砜(DMS0)制得儲備液并分別稀釋2倍、4 倍，分別得到2mmo 1 /L、4mmo 1 /L及8mmo 1 /L的化合物（I)應用液。進行細胞干預前，將5 OyL應 用液與4950yL常規(guī)培養(yǎng)液(含10%體積分數(shù)的小牛血清)充分混合，得到化合物（I)干預培 養(yǎng)液(2〇4111〇1/1^、4(^1]1〇1/1^、8(^1]1〇1/1^)。
[0035] 3、MTT法檢測細胞存活率
[0036]取對數(shù)生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200yL(5X103細胞）。培養(yǎng)12h待細胞 貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入200此不同濃度的化合物（I)培養(yǎng)液(DMS0溶解化合物（I)后以 1 %體積分數(shù)與常規(guī)培養(yǎng)液混合，使化合物（I)終濃度為20μπι〇 1/L、40μπι〇 1/L、80μπι〇 1/L)，每 組6個平行孔。同時設6個溶劑(DMS0)對照孔。培養(yǎng)24h、48h、72h，每24小時更換化合物（I)干 預培養(yǎng)液。干預結束后，吸去培養(yǎng)液，向各孔加入20yLMTT溶液，37 °C孵育4h后吸去各孔上清 液，加入150yL DMS0，置搖床上低速震蕩10min，待結晶充分溶解后，以DMS0調(diào)零，用酶聯(lián)免 疫檢測儀在490nm處測定各孔吸光度，計算細胞存活率（survival rate，SR)。SR =實驗組 A49〇/對照組 A49QX100%
[0037] 4、臺盼藍染色測定存活細胞數(shù)
[0038] 將相同數(shù)量(2 X106)的細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時間待細胞貼壁后，棄 去培養(yǎng)液，用洗細胞兩遍后，加入5mL的化合物（I)干預培養(yǎng)液(20ym 〇l/L、40ym〇l/L、80y mol/L)。每組三瓶細胞，同時設立三瓶溶劑(DMS0)對照。培養(yǎng)48h后，用0.25 %胰酶消化細 胞，收集細胞懸液，臺盼藍染色測定細胞數(shù)。
[0039] 5、DCFH_DA法測定細胞內(nèi)R0S活性
[0040]將相同數(shù)量(2 X106)的細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時間待細胞貼壁后，吸 去原培養(yǎng)液，加入5mL化合物（I)干預培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化細胞， 收集細胞懸液于1.5mL EP管中，1500rpm離心5min，棄上清，向沉淀中加入lmL DCFH-DA，吹 打混勻，37°C孵育30min，加入roS終止反應，離心收集沉淀并溶解于lmL PBS，吹打成均勻細 胞懸液，用Hitachi-F2500焚光分光光度計測定熒光值。激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm。
[0041 ]三、結果及結論 [0042] 1、細胞生長存活率
[0043] HepG2細胞經(jīng)化合物（I)干預培養(yǎng)24h、48h、72h后，低、中、高劑量組的細胞存活率 均顯著低于溶劑對照組(P〈〇.05)，且細胞存活率下降的程度與化合物（I)干預濃度之間存 在一定劑量效應趨勢(表1，aP〈〇. 05VS對照組;bP〈0.05VS低劑量組;eP〈0.05VS中劑量組）。在 同一化合物（I)干預濃度下，細胞存活率隨著干預時間的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢。而同等條 件下，L02人正常肝細胞經(jīng)化合物（I)干預后，細胞存活率無顯著變化(表2)。臺盼藍染色細 胞計數(shù)結果與MTT-致(圖3， aP〈0.05VS對照組;bP〈0.05VS低劑量組;CP〈0.05VS中劑量組）。 [0044] 2、細胞內(nèi)R0S活性
[0045] HepG2人肝癌細胞經(jīng)不同濃度化合物（I)干預后，與對照組相比，細胞內(nèi)R0S水平顯 著下降(p〈0.05)。結果見表3(aP〈0.05VS對照組;bP〈0.05VS低劑量組）。
[0046] 結論，采用不同濃度的化合物（I)對人肝癌細胞HepG2進行干預處理，經(jīng)MTT比色及 臺盼藍染色細胞計數(shù)表明，化合物（I)能夠有效抑制HepG2細胞的生長增殖，干預組細胞的 存活率較對照組顯著降低，且降低程度與化合物（I)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應趨勢，同時在 同一化合物（I)濃度下，細胞存活率隨著干預時間的增加而呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢。與此同 時，相同劑量的化合物（I)干預對L02正常肝細胞并不產(chǎn)生抑制作用。
[0047] 表1化合物（I)對HepG2細胞生長存活率的影響(X土s，n = 6)
[0048]
[0049] 表2化合物（I)對L02細胞生長存活率的影響(X 土 s，n = 6)
[0050]
[0051 ] 表3化合物（I)對HepG2細胞R0S水平的影響(X土s，n = 6)
[0052]
[0053] 實施例3
[0054] 片劑的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0055] 實施例4
[0056] 口服液制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服 液。
[0057] 實施例5
[0058] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0059] 實施例6
[0060] 注射液的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0061] 實施例7
[0062] 無菌粉針的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0063] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權項】
1. 具有下述結構式的化合物（I)，2. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：（a)將半枝 蓮的干燥全草粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用 75 %乙醇洗脫8個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏；（C)步驟 (b)中75 %乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、65:1、30:1、15:1和1:1的 二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟k)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用 體積比為25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用 十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8 ~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述用乙醇熱回流提取 采用的乙醇濃度為80 %。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權利要求1所述的化合物（I) 和藥學上可接受的載體。6. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療肝癌藥物中的應用。7. 權利要求5所述的藥物組合物在制備治療肝癌藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的木藜蘆烷型二萜化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。該化合物為首次報道，是一種結構新穎的木藜蘆烷型二萜化合物，可以從半枝蓮的干燥全草中提取、分離純化得到。本研究證實該化合物能夠有效抑制HepG2細胞的生長增殖，且抑制作用與化合物(Ⅰ)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應趨勢，可以用來開發(fā)成治療肝癌的藥物。
【IPC分類】A61K31/336, A61P1/16, A61P35/00, C07D303/02, C07D301/32
【公開號】CN105566251
【申請?zhí)枴緾N201610093614
【發(fā)明人】孫琴華
【申請人】杭州富陽偉文環(huán)?？萍加邢薰?br>【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年2月20日