一種用于標(biāo)記羧酸類化合物的熒光衍生試劑的合成及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及衍生試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于標(biāo)記羧酸類化合物的熒光衍生試劑的合成及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酸廣泛地分布于自然界中，是生物體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。對調(diào)節(jié)生物體內(nèi)生理和生物功能起著重要作用。飽和脂肪酸通常被認(rèn)為對人體有害，如果食用過量，能引起高膽固醇癥和心血管疾病。然而許多研究也證明飽和脂肪酸對酒精引起的肝損傷有治療作用。因此脂肪酸的定量分析在生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域都有重要意義。
[0003]由于這類化合物在紫外-可見光區(qū)吸收較弱，光度法難以準(zhǔn)確測定。目前較常用的方法是GC法，但GC法在分析前需進(jìn)行酯化處理，操作繁瑣且檢測限低。高效液相色譜熒光檢測法具有較高的靈敏度，用于柱前衍生的試劑主要有溴代香豆素類化合物和重氮甲烷類，然而該類化合物對潮氣及水不穩(wěn)定。NOEPES磺酸酯也可用于脂肪酸類化合物的衍生測定，但衍生過程需在氫氧化鉀、冠醚以及相轉(zhuǎn)移催化劑的存在下于苯或甲苯溶劑中完成，分離前也需煩瑣的預(yù)處理，費時、費力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種衍生產(chǎn)率高、條件溫和、操作簡便，衍生溶液不必預(yù)處理可直接進(jìn)樣分析的熒光衍生試劑的合成及應(yīng)用，能夠解決上述問題。
[0005]本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是:
[0006]—種用于標(biāo)記羧酸類化合物的熒光衍生試劑的合成，包括以下步驟:
[0007]1)2-噻吩-2-1!1-菲[9，10-(1]并咪唑的合成，在100011^三口燒瓶中，分別加入1689，10-菲醌、12mL 2-噻吩甲醛、120g醋酸銨和300mL冰醋酸，在機械攪拌的條件下快速加熱至Ij80-90°C，保持溫度攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)物冷卻至室溫后倒入燒杯中，用氨水調(diào)節(jié)pH至7-8，過濾，固體用水洗2次后放暗處干燥。干燥后的固體用乙腈/DMF(5:1，v/v)重結(jié)晶三次，得棕色晶體，產(chǎn)率88 %。
[0008]2)2-(2-噻吩-2-基-菲[9，10-d]并咪唑-1-基)-乙醇的合成，在500mL燒瓶中，分別加入9g 2-噻吩-2-1H-菲[9，10-d]并咪唑，痕量氫氧化鉀和lOOmLDMF，在攪拌的條件下加熱到沸騰后，把3.2g的碳酸亞乙酯分三次在Ih內(nèi)加入到燒瓶中，在繼續(xù)加熱5h。反應(yīng)完畢冷卻到室溫后，燒瓶中的混合物倒入到300mL水中，過濾并用水和60 %乙醇依次洗滌固體。固體干燥后用乙腈/DMF(4:1，v/v)重結(jié)晶三次，得黃色晶體，產(chǎn)率51%。
[0009]3)2-(2-噻吩-2-基-菲[9，ΙΟ-d]并咪唑-1-基)-對甲苯磺酸乙酯(TSTPE)的合成，在10mL燒瓶中，分別加入3g對甲基苯磺酰氯和20mL吡啶，冷卻至0°C。把6g 2-(2-噻吩-2-基-菲[9，IΟ-d]并咪唑-1-基)_乙醇溶解在1mL吡啶中滴加到燒瓶中的溶液里，保持溶液在0°C攪拌反應(yīng)4h，繼續(xù)在室溫下攪拌反應(yīng)1h后，反應(yīng)物倒入適量冰水中并攪拌0.5h。過濾，固體用水洗滌，干燥后用乙腈重結(jié)晶3次，得淺黃色晶體，產(chǎn)率91%。
[0010]—種用于標(biāo)記羧酸類化合物的熒光衍生試劑的應(yīng)用，將熒光衍生試劑用于標(biāo)記脂肪酸類化合物，濃度為1.0X 10—Vol.L—1的混合脂肪酸(C5-C30)標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈/DMF(1:l，v/v)溶解;準(zhǔn)確稱取0.5gTSTPE，用DMF溶解并定容至10mL，得濃度為1.0X10—V)l.L—1的熒光衍生試劑溶液；向盛有1mg無水K2CO3的2mL安培瓶中依次加入400yL DMF，10yL混合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，220yL熒光衍生試劑溶液，封口后于85°C恒溫水浴下振蕩反應(yīng)30min，得到穩(wěn)定的熒光產(chǎn)物。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
[0012]本發(fā)明合成了新型高靈敏的熒光試劑2-(2-噻吩-2-基-菲[9，ΙΟ-d]并咪唑-1-基)-對甲苯磺酸乙酯(TSTPE)，在DMF溶劑中以碳酸鉀為催化劑，85°C時反應(yīng)30minS卩可獲得穩(wěn)定的熒光產(chǎn)物，衍生產(chǎn)率高、條件溫和、操作簡便，衍生溶液不必預(yù)處理可直接進(jìn)樣分析。
[0013]實驗數(shù)據(jù):
[0014]溶液的制備，濃度為1.0X10-4mol.L_1的混合脂肪酸(C5-C30)標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈/DMF(1:1，V/V)溶解。準(zhǔn)確稱取0.5gTSTPE，用DMF溶解并定容至10mL，得濃度為l.0XlO-Smol.L-1的衍生試劑溶液。所有的溶液保存于4°C的冰箱中。
[0015]樣品中脂肪酸的提取，稱取樣品約0.2g，放于1mL容量瓶中用1mL氯仿浸泡，超聲振蕩數(shù)次放置過夜后過濾。殘余物加入2mL氯仿洗滌，濾液合并后加1.5mL吡啶超聲振蕩20秒使其轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)脂肪酸的有機鹽，溶劑經(jīng)N2吹干分別用600yL DMF定容備用。
[0016]脂肪酸的衍生，向盛有1mg無水K2⑶3的2mL安培瓶中依次加入400yL DMF,10yL混合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，220yL衍生試劑溶液，封口后于85°C恒溫水浴下振蕩反應(yīng)30min，放冷后取10yL衍生液加入280yL乙腈/DMF溶液(1:1，v/v)稀釋后直接進(jìn)樣1yL分析。
[0017]色譜條件，色譜柱為HypersiIBDS-C8coIumn(200 X4.6mm,5ym);流動相A為5% 乙腈，B為乙腈，梯度洗脫條件:t = 0min時為60%B，t = 15min時為80%B，t = 40min時為100%B，并保持100%B運行15min;流速為l.0mL.π?η-1;柱溫為30°C;激發(fā)波長為260nm，發(fā)射波長為380nm。
[0018]脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的色譜分離，按前述優(yōu)化條件，對26種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后的色譜分離結(jié)果見圖2，所有衍生物在50min內(nèi)獲得良好的基線分離。
[0019]線性關(guān)系和檢測限，26種脂肪酸衍生物在10pmol到40fmol的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)大于0.993線性方程見圖3，按照信噪比(S/N = 3)計算所有衍生物的檢出限在8.8-45.5fmol之間。
[0020]衍生試劑和衍生溶液的穩(wěn)定性，TSTPE溶液保存于4°C冰箱中，在兩周內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣分析，峰面積沒有明顯變化，見圖4，表明TSTPE足夠穩(wěn)定。衍生溶液保存于4°C冰箱中，在一周內(nèi)平行進(jìn)樣測定6次，計算峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差〈2.5%，表明衍生產(chǎn)物足夠穩(wěn)定。
[0021]重現(xiàn)性，在前述條件下，對25pmol脂肪酸衍生物進(jìn)行平行六次分析，保留時間和峰面積重現(xiàn)性見圖5，保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD( % )小于0.18%，峰面