用于親和色譜法和用于延長治療劑的半衰期的化合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于親和色譜法的化合物，更具體地設(shè)及用于親和純化血清白蛋白 (尤其是人血清白蛋白化SA))的化合物。該化合物還用于延長治療劑(尤其是治療性膚試劑 和小分子)的半衰期，如通過綴合至該治療性膚或小分子(該治療性膚或小分子在給藥后結(jié) 合至HAS)，從而提供治療劑的延長釋放。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)合至人血清白蛋白的小分子已描述用于純化生物分子（如血清白蛋白，包括人 血清白蛋白（HSA)，抗體和融合蛋白）（參見S. Subramanian，Dye-Ligand Affinity Chromatography : The Interaction of Cibacron Blue F3GA飯胖ith Proteins and E；nz;ymes,CRC Critical Reviews in Biochemist;ry(1984)voll6(2),pp. 169-205;美國專 利4，722，896;美國專利5，849，874;和PCT公開WO 2012/020080A2)。類似地，結(jié)合至人血清 白蛋白的小分子已描述用于延長通過注射給藥的治療劑的半衰期，尤其是治療性膚試劑 (參見例女日L.Pollaro and C.Heinis , Strategoes to Prolong the Plasma Residence Time of Peptide Drugs,Med.Qiem.Commun.(2010)1,319-324)。
[0003] 需要另外的改善的化合物，所述化合物可用于從存在于細(xì)胞裂解液(lysate)或其 它液體混合物和溶液中的其它生物分子和化合物純化、分離和/或捕捉運(yùn)些生物分子。同 樣，需要可用于安全和有效增加現(xiàn)有治療性分子(尤其是治療性膚、多膚和小分子）的半衰 期的另外的化合物，運(yùn)些治療性分子當(dāng)給藥于受試者后進(jìn)入受試者的循環(huán)系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的實(shí)施方案的特征為新的化合物，其用作直接純化多種生物分子的親和試 劑，所述生物分子如血漿蛋白質(zhì)，包括血清白蛋白，尤其是人血清白蛋白和HSA-融合蛋白。 其它可純化的生物分子包括免疫球蛋白、纖維蛋白原、α1-酸糖蛋白等;酶，包括淀粉酶、纖 維素酶、小牛腸堿性憐酸酶(CIAP)、乳酸脫氨酶化DH)等;和人工蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包 括親和標(biāo)記的蛋白或結(jié)構(gòu)域（如具有6His、FLAG、GST等標(biāo)記）、Fc-融合蛋白、域抗體等。此 夕h當(dāng)綴合至治療劑特別是膚治療劑時(shí)，運(yùn)些化合物可用于延長該治療劑在給藥后在血液 中的半衰期。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了新的化學(xué)類型，其對HAS(包括其片段和變體)具有高 親和力和特異性，如當(dāng)偶聯(lián)至瓊脂糖或另一底物時(shí)。而且，對于純化HAS和HSA-融合蛋白，該 親和樹脂技術(shù)比可商購的配體具有顯著更高的選擇性。更高的選擇性通過本發(fā)明的化合物 與白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)的特異性相互作用而實(shí)現(xiàn)。
[000引本發(fā)明的實(shí)施方案為式I或式II的化合物
[0006]
[0007]或其鹽，
[000引其中r1為H、-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-CN、-N02、取代或未取代的C廣C6烷基、取代或未 取代的C1-C6締基、取代或未取代的環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
[0009] 護(hù)為-[(C出)2E]n(C出)2NR'護(hù)且η為0至30的任意整數(shù)，
[0010] 其中R'和r各自獨(dú)立地為Η、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C1-C6締 基、或取代或未取代的環(huán)烷基；
[0011] 芳基為任何取代或未取代的、完全或部分芳香的控取代基或雜芳基取代基；
[001引 Y哺Y3獨(dú)立地為C、0、N、NR2或S，其中R2為H、取代或未取代的&-C6烷基、取代或未取 代的C1-C6締基、取代或未取代的環(huán)烷基、芳基或雜芳基;Y2為C或N;
[001引 A和D獨(dú)立地為

脈、硫代酷胺，或A和/或D不存在，其中 R'為H、取代或未取代的Ci-Cs烷基、取代或未取代的Ci-Cs締基、取代或未取代的環(huán)烷基、芳 基或雜芳基；
[0014] B為取代或未取代的。-C9-環(huán)烷基、取代或未取代的包含N、0或S的。-C9-雜環(huán)燒 基、取代或未取代的包含N、0、S的雜芳基，或B不存在；
[0015] C為W下任意一種：
[0016]

芳基、雜芳基、脈、硫代酷胺，或C不存在， Y
[0017] 其中R'和/或R"各自獨(dú)立地為H、取代或未取代的Ci-Cs烷基、取代或未取代的Ci-Ce 締基、取代或未取代的環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
[001引 E為邸2、0、畑或S，或E不存在；
[0019] Z為取代或未取代的芳基、取代或未取代的包含N、0或S的雜烷基，或取代或未取代 的包含N、0、S的雜芳基，或Z不存在。
[0020] 在另一方面，本發(fā)明提供了式HI或式IV的化合物
[0021]
[0022] 或其鹽，其中：
[002引各Zi、Z2、Z3和Z4獨(dú)立地選自N和CRi且Zi、Z2、Z3和Z沖的不超過兩個(gè)為N，且各r1獨(dú)立 地選自H、-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-CN、-N02、取代或未取代的C廣C6烷基、取代或未取代的C廣C6 烷氧基、取代或未取代的C1-C6締基、取代或未取代的環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
[0024] 護(hù)為-[(C此)2E]n(C出)2NR'護(hù)且η為0至30的任意整數(shù)，其中R'和護(hù)各自獨(dú)立地為H、 取代或未取代的C廣C6烷基、取代或未取代的C廣C6締基、或取代或未取代的環(huán)烷基；
[0025] 芳基為任何取代或未取代的、完全或部分芳香的控取代基或雜芳基取代基；
[0026] Υ哺Υ3獨(dú)立地為C、CR2、0、N、NR2或S，其中R2為H、取代或未取代的C廣C6烷基、取代或 未取代的C1-C6締基、取代或未取代的環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
[0027] γ2為C;
[002引 A和D獨(dú)立地為

脈、硫代酷胺，或A和/或D不存在； 、
[0029] B為取代或未取代的C4-C9-環(huán)烷基、取代或未取代的包含N、0或S的C4-C9-雜環(huán)燒 基、取代或未取代的包含N、0、S的雜芳基，或B不存在；
[0030] C為W下任意一種：

芳基、雜芳基、脈、硫代酷胺；
[0031 ] E為C出、0、畑或S，或E不存在;且
[0032] Z為取代或未取代的芳基、取代或未取代的包含N、0或S的雜烷基，或取代或未取代 的包含N、0、S的雜芳基，或Z不存在。
[0033] 如本文所公開，式I、式II、式ΙΠ 和式IV的化合物可結(jié)合至固相W制備親和色譜的 固相，其用于從包含蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的水溶液分離感興趣的蛋白質(zhì)。例如，該固相 為瓊脂糖。感興趣的蛋白質(zhì)可包括，例如，人血清白蛋白。該水溶液可為:源自細(xì)胞裂解液， 源自細(xì)胞收集物/肉湯（cell harvest/broth)，分離自體液（例如血液），或源自其它混合 物。例如，如本文所公開的親和瓊脂糖材料可用于從細(xì)胞裂解液和其它混合物純化、分離或 捕捉多種生物分子?？蓮囊后w/水溶液混合物中的其它生物分子和雜質(zhì)純化、分離或捕捉的 生物分子為運(yùn)樣的生物分子，如血漿蛋白質(zhì)，包括血清白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原、曰 1-酸糖蛋白等;酶，包括淀粉酶、纖維素酶、小牛腸堿性憐酸酶(CIAP)、乳酸脫氨酶化DH)等； 和人工蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括親和標(biāo)記的蛋白或結(jié)構(gòu)域(如具有6化3、尸1^\6、651'等標(biāo) 記）、HSA-融合蛋白、Fc-融合蛋白、域抗體等。
[0034] 如本文所述的化合物也可用于延長治療劑(尤其是膚、多膚和小分子治療劑）的半 衰期。通常，膚在靜脈內(nèi)給藥后在幾分鐘內(nèi)從血流清除。腎似乎完全將小于化Da的分子濾 除，而較大的膚(大于~50-70W)a)似乎被有效保留和循環(huán)。然而，已知一些膚的腎清除率可 通過結(jié)合至可接觸的(accessible)膜蛋白或血清蛋白而減少。循環(huán)中分子的壽命通常表示 為血漿半衰期，定義為通過系統(tǒng)（腎等）的消除而使循環(huán)中分子濃度減半所耗費(fèi)的時(shí)間。因 為從血液消除靜脈內(nèi)給藥的分子總是接近兩相過程(第一相為由于分布至外周組織而快速 下降），第二相(通過腎等的消除而減少)為與術(shù)語"血漿半衰期"相關(guān)的減少部分，也通常稱 為"消除半衰期"。
[0035] 本發(fā)明的實(shí)施方案因此提供了如本文所述的式I或式II的化合物，其綴合至治療 劑(特別是膚或多膚治療劑），W用于延長治療劑在血流中的消除半衰期或血漿半衰期。
[0036] 附圖簡述
[0037] 參考W下發(fā)明詳述，并參考附圖，本發(fā)明上述特征將更容易理解，其中：
[0038] 圖1顯示活化的瓊脂糖和本文所述化合物之間反應(yīng)制備親和-綴合的瓊脂糖珠子 的示意圖。
[0039] 圖2顯示微型瓊脂糖凝膠，其中與如本文所述的式I的化合物綴合的親和瓊脂糖珠 子用于從加入HAS的細(xì)胞裂解液制備/純化HSA。
[0040] 圖3顯示綴合至式I的化合物的親和瓊脂糖材料對HSA-融合的膚的特異性，與 Mimetic Blue租相比。
[0041] 圖4a顯示不同緩沖溶液從如本文所述的親和瓊脂糖材料洗脫HAS的有效性的比 較。
[0042] 圖4b顯示圖4a結(jié)果的圖解說明。
[0043] 圖5顯示加熱對HSA與綴合至式I的化合物的親和瓊脂糖材料的結(jié)合的影響和對相 同生物分子與Mime t i cB山e礙的結(jié)合的影響的比較。
[0044] 具體實(shí)施方案的發(fā)明詳述 [004引定義
[0046] 本說明書和隨附權(quán)利要求中所用的W下術(shù)語將具有指示的意思，除非上下文另有 規(guī)定：
[0047] DIPEA是指N，N-二異丙基乙基胺且也稱為化nig堿
[0048] DMF是指二甲基甲酯胺
[0049] 邸TA是指N，N-乙二胺-Ν,Ν,Ν'，N'-四乙酸
[0050] HATU是指1-[二（二甲基氨基）亞甲基]-1Η-1，2,3-Ξ挫并[4,5-b]化晚鐵3-氧化物 六氣憐酸鹽
[0051 ] h是指小時(shí)
[0052] HSA是指人血清白蛋白
[0053] MimeticRIue ?是指ProMetic BioSciences Ltd的Mimetic Blue" SA HL P6XL，如 W下所述（ www.prometicbiosciences.com/曰ssets/files/曰pp_notes/Mimetic%20Blue% 20SA% 20HL% 20P6)(L% 20Appl iation % 20Note % 20-% 20protein-f usion % 20protein % 20protein%20(091110)%20v2[l].p壯），MimeticBlue'i SA HL
[0054] min是指分鐘
[005引 MSA是指小鼠血清白蛋白
[0056] NP40是指洗涂劑化巧itol-type NP-40,也稱為壬基苯氧基聚乙氧基乙醇
[0057] 0D是指使用分光光度計(jì)測量的光密度，
[0058] 0D28日是指使用分光光度計(jì)在280nm測量的光密度，
[0059] PBS是指憐酸鹽緩沖鹽水
[0060] Pierce NHS-活化的瓊脂糖是指N-徑基班巧酷亞胺-活化的瓊脂糖，如獲自化ermo Scientific PexUProduct Cod 別25)，應(yīng)用注解-使用Mimetic良lue?SA HL P閒L捕捉和 純化重組白蛋白-融合蛋白。
[0061] 巧m是指每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)
[0062] 腳或的是指室溫
[0063] RSA是指大鼠血清白蛋白
[0064] SDS是指十二烷基硫酸鋼 [00巧]TFA是指Ξ氣乙酸
[0066] 如本文所述，"烷基"是指任何脂族控取代基，其為直鏈或支鏈或環(huán)狀的控或其組 合，其為完全飽和的。如本文所述，烷基也可是指單-或多不飽和的控，或其組合。飽和控取 代基的實(shí)例包括，但不限于W下已知的取代基：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正下基、叔下 基、異下基、仲下基、環(huán)己基、取代的環(huán)己基，W及例如取代或未取代的戊基、己基、庚基、辛 基取代基等的同系物W及位置異構(gòu)體和立體異構(gòu)體。烷基取代基，如本文所述，包括可具有 一個(gè)或多個(gè)雙鍵或皇鍵的烷基取代基。
[0067] 如本文所述/'氨基烷基"是指在控中的一個(gè)或多個(gè)氨被氨基取代基 NHR、-NR2、-N=R、= NR等)取代的烷基取代基。
[0068] 如本文所述，"取代或未取代的氨基烷基"是指氨基烷基取代基可為-N此（未取代 的)或在氨基中的一個(gè)或多個(gè)氨原子被碳取代基取代，如W下所述:-NHR、-N = R、=NR等(取 代的）。
[0069] 如本文所述、"芳堂'是指任何芳香的控取代基如苯、糞、菲、巧、苯并[a]蔥、苯并 [a ]巧等，例如苯基、糞基、菲基等。如本文所述，芳基也包括雜芳基，包括任何完全或部分芳 香的雜環(huán)取代基。實(shí)例包括，但不限于，化咯、化晚、喀晚、嚷嶺、化喃、巧喃、嚷吩、嚷挫、嗎I 噪、咪挫、硫代咪挫、嗯挫、氮雜.葬、硫雜華(thiopene)、硫氮雜.華、哇嘟、氧雜聾、嗯二挫取 代基。
[0070] 如本文所述，"取代或未取代的芳基"是指在芳環(huán)上(苯基、糞基、菲基等)不具有除 氨W外的取代基的任何芳基取代基，或?yàn)槠渲幸粋€(gè)或多氨被取代基取代的芳基取代基，該 取代基如碳(烷基等）、胺(氨基、氨基烷基、亞氨基、硝基、硝基烷基等）、硫(硫基、硫代烷基、 橫酸醋基、硫酸醋基等）、氧代(幾基、醒、酸、醋、酸等）、面素(氯、氣、漠、艦)基團(tuán)等。實(shí)例包 括但不限于芐基取代基，和甲苯、苯酪、苯胺、節(jié)臘、苯乙酬、苯甲醒、苯甲酸、二甲苯、和硝基 苯取代基。
[0071]如本文所述，"取代或未取代的雜芳基"是指如上所述的含有N、0或S的任何雜芳基 取代基，其中環(huán)碳上的一個(gè)或多個(gè)氨被取代。
[0072 ]本發(fā)明的實(shí)施方案提供了式I的化合物
[0073]
[0074] 或其鹽，其中：r1為H、-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-CN、-N02、取代或未取代的C廣C6烷基、 取代或未取代的C1-C6締基、取代或未取代的環(huán)