專利名稱：在體內(nèi)具有延長的半衰期和增強的紅細胞生成活性的重組人EPO-Fc 融合蛋白的制作方法
在體內(nèi)具有延長的半衰期和增強的紅細胞生成活性的重組人EPO-Fc融合蛋白
本申請是申請日為2007年1月25日、申請?zhí)枮?00780000439. 2、發(fā)明名稱為“在體內(nèi)具有延長的半衰期和增強的紅細胞生成活性的重組人EPO-Fc融合蛋白”的發(fā)明專利申請的分案申請。
相關申請
本申請涉及并要求2006年1月27日提交的美國專利申請?zhí)?1/340,661的權益， 所述申請在此以其全文引用作為參考。技術領域
本申請涉及人促紅細胞生成素融合蛋白。
背景
人促紅細胞生成素(EPO)(造血生長因子家族的成員)主要在成人腎臟和胎兒肝臟中作為對于由于減少的血氧可獲得性引起的組織缺氧的響應而合成[1]。EPO的主要功能是對骨髓中的某些紅細胞(RBC)祖細胞和前體細胞直接作用以刺激血紅蛋白的合成和成熟RBC的產(chǎn)生。其還控制RBC的增殖、分化和成熟。已產(chǎn)生了具有天然發(fā)生的EPO的氨基酸序列的重組ΕΡ0，并且被批準用于治療與腎功能衰竭、癌癥和其他病理狀態(tài)相關的貧血癥[2]。除了其紅細胞生成特性外，近來的研究報導[3]表明，EPO還對非骨髓細胞例如神經(jīng)元起作用，這暗示EPO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和其他器官/系統(tǒng)中的其他可能的生理/ 病理功能。因為已在許多不同的器官中發(fā)現(xiàn)EPO受體，因此EPO可具有多種生物學效應， 例如用作抗凋亡劑。
人EPO是分子量為30. 4千道爾頓的糖蛋白。糖類占其總質(zhì)量的大約39%。EPO基因位于染色體7qll_22上，并且橫跨具有5個外顯子和4個內(nèi)含子的5. 4kb區(qū)域[4]。EPO 的前體由193個氨基酸組成。通過翻譯后修飾而進行的前導序列和最后的氨基酸Arg的切割產(chǎn)生了具有165個氨基酸的成熟ΕΡ0。糖基化(在Asr^4、Asn38、Asn83處的3個N聯(lián)位點和在處的一個0聯(lián)位點)在EPO的生物合成、三級結構和體內(nèi)生物學活性中起著至關重要的作用[5]。EPO通過給合至促紅細胞生成素受體(分子量為72-78千道爾頓的糖基化且磷酸化的跨膜多肽)來發(fā)揮功能。該結合觸發(fā)所述受體的同源二聚化，這導致幾個信號轉導途徑的激活JAK2/STAT5系統(tǒng)、G-蛋白、鈣通道和激酶。對于獲得最佳受體激活需要兩個分子的EPO蛋白同時結合一個受體分子W]。
作為第一個被批準用于人類治療的造血生長因子，重組人EPO(rHuEPO)已被用于治療由慢性腎衰竭、癌癥(主要是化療相關的貧血)、自身免疫疾病、AIDS、手術、骨髓移植和骨髓增生異常綜合征等引起的貧血癥。有趣地，近年來的研究已觀察到，rHuEPO具有非血液系統(tǒng)功能，并顯示用作用于腦缺血、腦外傷、炎性疾病和神經(jīng)變性疾病的神經(jīng)保護性藥物的潛能。
目前，商購可得三種類型的rHuEPO或rHuEPO類似物，即rHuEPO α、rHuEP0 β和 darbepoetin α [8]。這三種重組蛋白結合相同的促紅細胞生成素受體，但在結構、糖基化程度、受體結合親和力和體內(nèi)代謝方面不同。自20世紀80年代開始引入rHuEPO-α以來， 臨床醫(yī)生很快就認識到所述藥物的頻繁給藥/注射要求是個很大的缺點。靜脈內(nèi)和皮下施用的rHuEPO α和rHuEPO β的平均體內(nèi)半衰期分別只有8. 5和17小時[9，10]。因此患者需要每天1次、每周2次或每周3次的注射方案，這對患者和衛(wèi)生保健提供者(health care provider)都產(chǎn)生了負擔。因此，對開發(fā)具有更長的體內(nèi)半衰期和/或增強的紅細胞生成活性的重組EPO類似物存在長久的需要。
在現(xiàn)有技術中已作出了嘗試，以遺傳改變或化學修飾天然EPO蛋白的結構從而減慢其體內(nèi)代謝或提高其治療特性。例如，EPO分子上包含唾液酸的糖類的量與其體內(nèi)代謝和功能活性之間看上去呈正相關性。因此，增加EPO分子的糖含量可導致體內(nèi)更長的半衰期和增強的活性[11，12]。Amgen已設計了 rHuEPO類似物darbepoetin α，其包含5個N 聯(lián)糖鏈(比rHuEPO多兩個)。darbepoetin α也稱作新型紅細胞生成刺激蛋白(NESP)， 并且以商標Aranesp 進行銷售。darb印oetin α與天然人EPO在5個位點(Ala30Asn、 His32Thr、Pro87Val、Trp88Asn、Pro90Thr)上不同，這使得兩個額外的N聯(lián)寡糖能夠附著在天冬酰胺殘基位點30和88上。darb印oetin α以與天然EPO相同的方式結合EPO受體從而誘導細胞內(nèi)信號傳導，所述信號傳導包括由JAK-2激酶和相同的細胞內(nèi)分子Ras/MAP-k、 P13_k和STAT-5引起的酪氨酸磷酸化。由于增加的糖類含量，darb印oetin α在動物和人中的的半衰期幾乎為rHuEPO-α的三倍(25. 3小時對8. 5小時)[9]。在體內(nèi)，darb印oetin α (Aranesp )還似乎展現(xiàn)出相比天然發(fā)生的或重組的人EPO而言增強的生物學活性[13]， 并且已被FDA批準為第二代rHuEPO藥物；該藥物只需要每周施用1次即可獲得與每周注射 2至3次rHuEPO相同的治療效果[10，14，15]。
延長EPO的半衰期的其他努力已集中在通過化學綴合聚乙二醇(PEG化)等來增加EPO蛋白的分子量。PEG化的EPO具有大得多的分子量，并受到保護而免于被從循環(huán)中清除，從而具有更長的血漿半衰期[16]。然而，PEG化可能改變蛋白的結構，從而導致EPO部分的功能和特異性的不可預期的改變。還存在通過其他方法，例如將EPO分子連接至載體蛋白(人白蛋白)，或者使用連接肽(3至17個氨基酸)或經(jīng)化學交聯(lián)劑形成兩個完整EPO 分子的同源二聚化，來增加EPO的分子量的報道[17，18，19，20]。盡管所有這些方法已在延長EPO的半衰期和增加其活性中獲得一定的成功，但在本申請所描述的融合蛋白中將EPO 分子與人免疫球蛋白(IgG)的Fc片段相結合獲得了獨特的優(yōu)點。
人免疫球蛋白IgG由4個通過二硫鍵共價連接的多肽(輕鏈和重鏈的兩個相同拷貝)組成。通過木瓜蛋白酶來蛋白水解IgG分子產(chǎn)生兩個Fab片段和一個Fc片段。所述 Fc片段由通過二硫鍵連接在一起的兩個多肽組成。每個多肽，從N至C末端，由鉸鏈區(qū)、CH2 結構域和CH3結構域組成。所述Fc片段結構在所有亞型的人免疫球蛋白中幾乎相同。IgG 是人血液中最豐富的蛋白之一，其在組成了人血清中總免疫球蛋白的70至75%。IgG在循環(huán)中的半衰期在所有5種類型的免疫球蛋白中是最長的，并且可達到21天。
已成功地將現(xiàn)代生物工程技術用于產(chǎn)生由治療性蛋白質(zhì)片段例如細胞因子和可溶性受體與人IgG的Fc片段組成的融合蛋白[21，22，23，M]。這些融合蛋白具有顯著更長的體內(nèi)半衰期，而同時保持其生物學和治療性質(zhì)。到目前為止，已成功地開發(fā)出兩種包含 Fc片段的融合蛋白作為生物藥物，并經(jīng)FDA批準用于治療類風濕性關節(jié)炎和慢性斑塊狀銀屑病[25,26]0
在現(xiàn)有技術中已顯示，通過化學交聯(lián)或通過多肽連接的兩個EPO分子的二聚體展現(xiàn)出增強的體內(nèi)活性和延長的半衰期[17，19]。所述增強的活性可能是由于所述EPO 二聚體與一種受體的更有效的結合而產(chǎn)生的，和所述延長的體內(nèi)半衰期可能是由于所述二聚體蛋白的大小更大而引起的。然而，化學交聯(lián)過程不是有效的且難以控制。此外，EPO 二聚體中的連接肽可能改變EPO分子的三維結構，并且所述肽本身可能刺激體內(nèi)的免疫原性應答。這些缺點削弱了 EPO 二聚體的治療潛能，特別是由于腎病患者中的EPO替代療法是終生進行時尤其如此。
因此產(chǎn)生了對于具有顯著更長的體內(nèi)半衰期和增強的體內(nèi)紅細胞生成活性但不具有增加的免疫原性特性的EPO類似物的需要。
發(fā)明概述
根據(jù)本發(fā)明，描述了包含連接至免疫球蛋白肽部分的人促紅細胞生成素肽部分的重組融合蛋白。所述融合蛋白具有相比天然發(fā)生的或重組的天然人促紅細胞生成素而言延長的體內(nèi)半衰期。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述蛋白的體內(nèi)半衰期為天然人促紅細胞生成素的至少三倍。所述融合蛋白還展現(xiàn)出相比天然人促紅細胞生成素而言增強的紅細胞生成生物活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述免疫球蛋白肽部分是Fc片段，例如IgGl片段。 所述Fc片段包含CH2和CH 3結構域和鉸鏈區(qū)。所述EPO肽部分直接連接至鉸鏈區(qū)。優(yōu)選地，所述鉸鏈區(qū)的長度為至少9個氨基酸。在一個實施方案中，所述EPO肽部分具有臨近其 C末端的半胱氨酸殘基，并且所述鉸鏈區(qū)包含位于最靠近所述EPO肽部位的半胱氨酸殘基。 優(yōu)選地，這兩個半胱氨酸殘基間隔至少12個氨基酸。在一個實施方案中，所述EPO肽部分可包含直接連接至免疫球蛋白部分的完整EPO分子(即在EPO和免疫球蛋白部分之間沒有插入外來肽連接體)。
本發(fā)明還涉及包含多個單元的本發(fā)明融合蛋白的多聚體蛋白構建體。例如，兩個融合蛋白可裝配為二聚體，其中所述蛋白的鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接。所述二聚體具有IgG 分子的一般形狀，并且比游離的EPO分子更穩(wěn)定。
本發(fā)明還涉及編碼所述融合蛋白的核酸和氨基酸序列，以及用于產(chǎn)生所述融合蛋白的經(jīng)轉染的細胞系和方法。本發(fā)明進一步包括包含所述融合蛋白的藥物組合物，和使用所述融合蛋白和/或所述藥物組合物(例如在需要治療的受試者中刺激紅細胞生成)的方法。
附圖簡述
在舉例說明本發(fā)明的各種實施方案但不希望以限定性方式解釋的附圖中
圖IA是示意圖，其顯示了本發(fā)明的重組人EPO-Fc融合蛋白(rHuEPO-Fc)的一般結構。
圖IB是序列表，其顯示了 rHuEPO-i^c蛋白的核苷酸序列和推導的氨基酸(aa) 序列。DNA的總長度為1281bp。在所述推導的蛋白質(zhì)序列中的4 個氨基酸包括信號肽的27個aa和完整rHuEP0_Fc蛋白的399個aa。所述完整的rHuEP0_Fc蛋白由人EPO結構域(166aa)以及人IgGl的Fc片段的鉸鏈區(qū)(16aa，加下劃線的)和CH2和CH3結構域(217aa)組成。計算出的成熟rHuEPO-Fc融合蛋白的多肽的分子量為44. 6kDa，其由 18. 5kDa(41.4%)的EPO片段和洸.IkDa(58. 6%)的IgGlFc片段組成。同源二聚體由鉸鏈區(qū)內(nèi)的兩個半胱氨酸殘基(加框的)通過兩個二硫鍵形成。在成熟融合蛋白的殘基172(即鉸鏈區(qū)的第6個氨基酸)處，天然的半胱氨酸殘基被甘氨酸(粗體)置換。
圖2是示意圖，其顯示了用于插入編碼rHuEPO-Fc融合蛋白的多肽的DNA序列和用于轉染表達所述rHuEPO-Fc融合蛋白的CHO細胞的哺乳動物表達質(zhì)粒ρ⑶1的結構和特征。
圖3是SDS-PAGE圖像，其顯示了通過SDS-PAGE分析顯示的在非還原條件下純 rHuEPO-Fc蛋白的二聚體形式和在還原條件下純rHuEPO-Fc蛋白的單體形式的大小。在非還原條件下，在8% Bis-Tris凝膠上，從表達rHuEPO-FC的培養(yǎng)的CHO細胞系的上清液中純化出的rHuEPO-Fc蛋白主要以二聚體形式存在并且具有大約ISOkDa的分子量。在打斷二硫鍵的還原條件(IOOmM 二硫蘇糖醇，DTT)下，所述二聚體分成兩個相同的分子量為75kDa 的單體單元。
圖4A和4B所示的圖顯示了在通過每周3次皮下注射(s. c.) rHuEPO-Fc或rHuEPO 進行處理的正常小鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組(6只小鼠)的平均Hb水平。第0天的水平代表處理前的Hb水平。A 用rHuEPO-Fc處理的小鼠。 B 用天然rHuEPO處理的小鼠。
圖5A和5B所示的圖顯示了在通過每周1次皮下注射(s. c.) rHuEPO-Fc或rHuEPO 進行處理的正常小鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組(6只小鼠)的平均Hb水平。第0天的水平代表處理前的Hb水平。A 用rHuEPO-Fc處理的小鼠。 B 用天然rHuEPO處理的小鼠。
圖6A和6B所示的圖顯示了在通過靜脈內(nèi)注射(i. v. ) 12. 5 μ g/kgrHuEPO-Fc或 rHuEPO進行處理的正常小鼠中血紅蛋白(Hb)水平的增加。每個點代表所述組(6只小鼠) 的平均Hb水平。第0天的水平代表處理前的Hb水平。A 每周1次處理的小鼠。B 每周3 次處理的小鼠。
圖7所示的圖顯示了在通過每周1次皮下注射rHuEPO-Fc、rHuEPO或 darbepoetin-α (縮寫為Darbe.)進行處理的并切除了 5/6的腎的大鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組的平均Hb水平。正常對照是用載體溶液進行注射的正常大鼠。模型對照是用載體溶液進行注射的并切除了 5/6的腎的大鼠。第0周的水平代表處理前的Hb水平。* 處理后的周數(shù)。
圖8所示的圖顯示了在通過每兩周1次皮下注射rHuEPO-Fc、rHuEPO或 darbepoetin-α (縮寫為Darbe.)進行處理的并切除了 5/6的腎的大鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組的平均Hb水平。正常對照是用載體溶液進行注射的正常大鼠。模型對照是用載體溶液進行注射的并切除了 5/6的腎的大鼠。第0周的水平代表處理前的Hb水平。*:處理后的周數(shù)。
圖9所示的圖顯示了在通過每兩周1次靜脈內(nèi)注射62. 5 μ g/kgrHuEP0-Fc或 darbepoetin-α (縮寫為Darbe.)進行處理的并切除了 5/6的腎的大鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組的平均Hb水平。正常對照是用載體溶液進行注射的正常大鼠。模型對照是用載體溶液進行注射的并切除了 5/6的腎的大鼠。第0周的水平代表處理前的Hb水平。*:處理后的周數(shù)。
圖 10A-10C 顯示了 rHuEPO-Fc、rHuEPO 和 darbepoetin- α 在以用不同劑量和方案進行處理的并切除了 5/6的腎的大鼠中刺激CFU-E和BFU-E集落形成的效力比較。 rHuEPO-Fc和darb印oietin- α (縮寫為Darbe.)處理顯示出相似的刺激CFU-E和BFU-E集落形成的劑量依賴性效力，而rHuEPO的效力較低。A，每周1次皮下注射。B，每兩周1次皮下注射。C，每兩周1次靜脈內(nèi)注射。


圖11所示的圖顯示了在對獼猴靜脈內(nèi)注射5 μ g/kg rHuEPO-Fc或rHuEPO后 rHuEPO-Fc和rHuEPO的血清水平(5只猴子的平均水平)。
圖12是序列表，其顯示了野生型rHuEPO-FcC蛋白的核苷酸序列和推導的氨基酸 (aa)序列。除了天然的野生型半胱氨酸存在于成熟的融合蛋白的殘基172(即，鉸鏈區(qū)的第 6個氨基酸)處之外，所述序列的細節(jié)與圖1中所示的相同。
圖13所示的圖顯示了在通過每周3次皮下注射(s. c. ) rHuEPO-Fc (本發(fā)明的突變型融合蛋白)、rHuEPO-FcC (野生型融合蛋白)和rHuEPO進行處理的正常水鼠中血紅蛋白 (Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組(8)的平均Hb水平。正常對照是用載體溶液進行注射的正常小鼠。第0天的水平代表處理前的Hb水平。
圖14所示的圖顯示了在通過每周1次皮下注射(s. c. ) rHuEPO-Fc、rHuEPO-FcC和 rHuEPO進行處理的正常水鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組 (8)的平均Hb水平。正常對照是用載體溶液進行注射的正常小鼠。第0天的水平代表處理前的Hb水平。
發(fā)明詳述
在整個下列描述中顯示了特定的詳細內(nèi)容以便更全面地理解本發(fā)明。然而，可實施本發(fā)明而不采用這些細節(jié)。在其他情況下，未詳細顯示或描述熟知的元素以避免不必要地使本發(fā)明模糊不清。因此，本說明書和附圖被認為是舉例說明性的而不是限制性的。
本申請涉及具有紅細胞生成特性的新型融合蛋白。所述融合蛋白，此處稱為 rHuEPO-Fc，包括重組連接至免疫球蛋白Fc片段的人促紅細胞生成素(EPO)分子。如在下面進一步討論的，所述融合蛋白可以為由兩個相同的多肽亞基組成的二聚體形式。在圖IA 中示意性地顯示的實施方案中，每個多肽亞基，從N末端至C末端，由人EPO分子的多肽序列以及人免疫球蛋白IgGl的Fc片段的鉸鏈區(qū)、CH2結構域和CH3結構域的多肽序列組成。 所述兩個多肽亞基通過各自鉸鏈區(qū)之間的二硫鍵連接在一起從而形成所述二聚體結構。因此，所述二聚體具有與IgG分子相同的一般形狀，并且展示出比在下面實施例中所討論的游離的EPO分子更好的穩(wěn)定性。
正如對于本領域技術人員來說將會是顯然的，完整的免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)為所述蛋白提供了用于有效的抗原-抗體結合的足夠的柔性。類似地，在本發(fā)明中，在rHuEPO-Fc 融合蛋白的設計包括了鉸鏈區(qū)以保持其柔性，尤其是當融合蛋白以二聚體形式存在時。如下面所描述的，這允許所述rHuEPO-Fc融合蛋白的EPO部分與EPO受體的正常結合，從而激活EPO生物學功能。據(jù)認為rHuEPO-FC融合蛋白的二聚體形式通過提供兩個EPO分子而能夠誘導EPO受體的最佳激活(例如，通過促進受體交聯(lián))。
正如在下面所示的實施例中所證明的，使用重組DNA技術已經(jīng)成功地合成了所述 rHuEPO-Fc融合蛋白。已顯示，在小鼠、大鼠和靈長類動物的研究中，所述融合蛋白展示出相比天然發(fā)生的或重組的天然人EPO而言延長的體內(nèi)半衰期和增強的紅細胞生成特性。如本專利申請中所用的，術語“天然人促紅細胞生成素”和“天然人ΕΡ0”是指具有未修飾的野生型結構的ΕΡ0。正如本領域技術人員將會認識到的，天然人EPO可天然地發(fā)生或重組產(chǎn)生 (例如rHuEPO α )。術語“天然人ΕΡ0”不包括rHuEPO類似物，例如darb印oetin α，其中 EPO結構已被明顯修飾，例如通過高糖基化(hyperglycosylation)。
本發(fā)明的rHuEP0-Fc融合蛋白的核酸序列顯示于SEQ. ID. No. 1中。相應的推導的氨基酸序列顯示于SEQ. ID. No. 2中。完整的rHuEPO-Fc融合蛋白的長度為399個氨基酸。 如圖IB中所示的，完整的rHuEPO-Fc融合蛋白由EPO結構域(166個氨基酸)、鉸鏈區(qū)(16 個氨基酸，加下劃線的)以及CH2和CH3結構域017個氨基酸)組成。由27個氨基酸組成的信號或前導肽序列也顯示于圖IB中。信號肽在rHuEPO-Fc的合成過程中被切割。包含信號肽或前導肽的rHuEPO-Fc的核酸和氨基酸序列分別顯示于SEQ. ID. No. 3和SEQ. ID. No. 4 中。
如圖IB和SEQ. ID. No. 2中所最佳顯示的，EPO結構域在氨基酸編號161處具有接近其C末端的半胱氨酸殘基。鉸鏈區(qū)在氨基酸編號178和181 (在圖IB中用框標示)處包含2個半胱氨酸殘基。所述鉸鏈區(qū)半胱氨酸殘基在上述同源二聚體的多肽亞基之間形成二硫鍵。天然發(fā)生的人IgGl片段的鉸鏈區(qū)也在鉸鏈區(qū)部分的殘基編號6 (從N末端測量的) 處具有半胱氨酸。在本發(fā)明中，鉸鏈部分的半胱氨酸殘基6已被非半胱氨酸殘基置換。特別地，在圖IB和SEQ. ID. No. 2的實施方案中，所述氨基酸半胱氨酸已被甘氨酸(在rHuEPO-Fc 的氨基酸殘基172處，所述殘基相應于鉸鏈區(qū)的殘基6)置換。正如對于本領域技術人員來說將是顯然的，其他非半胱氨酸殘基也可在該位置上置換半胱氨酸以避免二硫鍵的形成。
由于在殘基172處的氨基酸置換，鉸鏈區(qū)的第一個半胱氨酸殘基(在殘基178處) 與EPO結構域的上述半胱氨酸殘基(在殘基161處)相隔17個氨基酸。本發(fā)明者認為， EPO結構域的半胱氨酸殘基161與鉸鏈區(qū)的第一個半胱氨酸殘基之間的最小間隔應當為至少12個氨基酸，從而使得能夠成功地裝配rHuEPO-Fc的同源二聚體和/或使得EPO受體能夠結合rHuEPO-Fc的同源二聚體。即，如果殘基172是半胱氨酸殘基，則在例如在半胱氨酸殘基161和172之間可能形成不想要的二硫鍵。這可能改變EPO分子的三維結構，從而導致無生物學活性或生物學活性減少。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將EPO結構域直接連接至融合蛋白的Fc片段部分。 通過避免提供外來連接體肽，rHuEPO-Fc融合肽的優(yōu)選三維結構得到保持，并且使觸發(fā)不希望的免疫原性應答的風險減少至最低。Fc片段的鉸鏈區(qū)的長度優(yōu)選為至少9個氨基酸，并且長度優(yōu)選地在大約10至20個氨基酸的范圍內(nèi)。實施例
下列實施例將進一步更詳細地舉例說明本發(fā)明，盡管將會認識到本發(fā)明不限于所述特定的實施例。
1.編碼HuEPO-Fc的融合蛋白的重組質(zhì)粒pCdEpo-Fc的構建
通過使用下列oligo引物(QIAGEN Inc.，US)的重疊PCR來產(chǎn)生編碼rHuEPO-Fc 多肽的氨基酸序列的全長DNA分子
EF5 :5， -ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3，；
EF3 :5， -ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3，；
EFL5 :5， _aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatctggtgaca_3，；9
EFL3 :5， _tgtcaccagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct_3，。
上述引物的序列分別列于SEQ. I. D. No. 5-8中。
分別將EcoR I和Not I位點導入EF5和EF3中。為了在哺乳動物細胞中最佳地表達HuEPO-Fc蛋白，還將Kozak序列(GCCACCATGG)導入EF5中。EFL5和EFL3是由Epo的 3'末端DNA序列和IgGl鉸鏈的5'末端DNA序列Q2bp)組成的互補序列。
首先，分別地，使用引物EF5 和 EFL 3 通過 PCR(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)從包含全長人EPO cDNA的質(zhì)粒p9E中擴增出0. 6kb的EPO DNA片段，使用引物EF3和EFL5從包含全長人IgGl cDNA序列的質(zhì)粒pD中擴增出0. 7kb的Fc片段(p9E 和PD來自本發(fā)明者自已的實驗室)。然后純化這兩種片段，并將其以等量混合。使用所述混合物作為模板，通過引物EF5和EF3擴增出1. 3kb的全長rHuEP0_Fc DNA。用EocR I和 Not I (New England Biolab Inc. US)消化經(jīng)純化的1. 3kb片段，然后將其克隆入經(jīng)EcoR I/ Not I消化的哺乳動物表達載體ρ⑶1 (圖2)中。所得的重組載體稱為pCdEpo-Fc，并通過 DNA測序來驗證所插入的編碼HuEPO-FC蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
2. rHuEP0-Fc表達細胞系的建立
將具有二氫葉酸還原酶(dhfr)缺陷的中國倉鼠卵巢細胞(CHO/dhfr—，ATCC No. CRL-9096)用作用于rHuEP0_Fc表達的宿主細胞，所述中國倉鼠卵巢細胞經(jīng)FDA批準用于生物物質(zhì)的生產(chǎn)。
使用Lipofectamine (Gibco，Cat. No 18292-037，USA)，用重組載體 pCdEpo-Fc 轉染 CHO-dhfr"細胞。通過 ELISA (Roche, Cat. No :1-693 417，Canada)就 EPO 活性來測定來自所選克隆的培養(yǎng)物的上清液。在不斷增加的氨甲蝶呤(MTX)的壓力下進一步篩選陽性克隆。選擇一個具有最高rHuEPO-Fc蛋白表達的細胞系作為表達rHuEP0_Fc的CHO細胞系， 并且使其逐漸地適應無血清培養(yǎng)基(CD CHO培養(yǎng)基，Gibco, Cat. No 10743-029，USA)。該表達rHuEP0-Fc的CHO細胞系用于產(chǎn)生rHuEP0_Fc蛋白。
3. rHuEP0-Fc 蛋白的純化
首先通過A蛋白親和層析(Amersham，Cat. No 17-0402-01，Canada)來分離上清液中所包含的rHuEPO-Fc蛋白分子，所述上清液從培養(yǎng)表達rHuEPO-Fc的CHO細胞的無血清培養(yǎng)基中收集。通過在HiLoad 16/60 Superdex 200pg柱(Amersham，Cat. No :17-1069-01， Canada)中進行凝膠過濾來進一步純化所述分離的蛋白。如通過電泳所測定的，rHuEPO-Fc 蛋白的純度超過98%。
4.純rHuEPO-Fc蛋白的大小的測定
首先，進行SDS-PAGE以確定純rHuEPO-Fc蛋白的大小。如圖3中所示，在非還原條件下，在8% Bis-Tris凝膠上看到具有大約ISOkDa的分子量的單一條帶，這測量了存在有二硫鍵的蛋白的總體大小。這表明，大多數(shù)rHuEPO-Fc蛋白分子以二聚體形式產(chǎn)生，如根據(jù)所述融合蛋白的設計所預期的。當在打斷二硫鍵的還原條件(IOOmM 二硫蘇糖醇，DTT) 下進行SDS-PAGE分析時，只鑒定了具有7漲叔的分子量的條帶，這與估計的HuEPO-鉸鏈區(qū)-CH2-CH3的單個多肽鏈的分子量相一致。
通過質(zhì)譜(MALDI-TOF-MQ測定的具有糖基化的純rHuEPO-Fc融合蛋白的精確分子量是111099道爾頓(111. IKda)。在該測定法中，只觀察到單一蛋白峰，表明所述純化的 rHuEPO-Fc蛋白幾乎具有100%的純度。通過蛋白質(zhì)序列分析測定純rHuEPO-Fc蛋白的N末端的15個氨基酸為=APPRLI⑶SRVLERY。這與天然人EPO多肽的前15個氨基酸的序列相一致，并驗證了所述純化的rHuEPO-Fc蛋白確實具有根據(jù)編碼rHuEPO-Fc融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列所預測的正確且完整的EPO分子序列。
5.在正常小鼠中rHuEPO-Fc的增強的紅細胞生成活性
進行在小鼠中的體內(nèi)實驗以驗證rHuEPO-Fc蛋白的紅細胞生成活性的保持，和測定其與rHuEPO和darb印oetin-α相比的功效。為了進行比較，在本發(fā)明的所述動物實驗中使用的3種EPO (我們的rHuEPO-Fc、rHuEP0 (即天然人ΕΡ0)和darb印oetin- α )的所有劑量是基于摩爾基礎的單獨的EPO分子部分的量。對于rHuEPO-Fc蛋白，如通過EPO的氨基酸重量在整個rHuEPO-Fc分子的總氨基酸重量中的比例(399個aa中166個aa)所計算的，EPO部分貢獻了 41. 4%的總rHuEPO-Fc分子量。那么就將rHuEPO-Fc的EPO量確定為 rHuEPO-Fc蛋白總量的41. 4%。
將rHuEPO-Fc (母液濃度0. 5mg/ml,98. 6%的純度)和天然人rHuEP0(即具有天然的人 EPO 結構)(6000IU/0. 5ml，由 Kirin Brewery Co.，Japan 生產(chǎn))在載體溶液(2. 5mg/ ml的人血清白蛋白、5. 8mg/ml檸檬酸鈉、0. 06mg/ml檸檬酸和5. 8mg/ml氯化鈉，pH5. 5-5. 6) 中稀釋。根據(jù)其活性/數(shù)量比例來計算總計的rHuEPO劑量。將BALB/c小鼠(6至8周齡， 體重18-22g，雄性和雌性數(shù)目相等，購自Experiment Animal Center，AMMS，China)隨機分組，每組6只。用一種劑量(0. 1、0.5、2. 5、12. 5、62.5 μ g/kg)、一種注射途徑(通過尾靜脈的靜脈內(nèi)注射(i. v.)或皮下注射(s. C.))和一種注射方案(每周3次或每周1次)的一個組合來處理各組小鼠。用等體積的載體溶液注射對照組小鼠。所述處理持續(xù)3周，并且總觀察時間為5周。在處理前于每周的第4天和第7天測量外周血樣品(尾靜脈)，進行5 周。通過吸光測定法將Hb測量為指數(shù)。根據(jù)各組的數(shù)據(jù)來計算平均值士SD，并在不同組之間進行t檢驗。
每周3次給小鼠施用ΕΡ0，條件是所述EPO具有正常的紅細胞生成活性，這將誘導紅細胞生成的飽和刺激。如圖4中所示，每周3次通過皮下注射進行處理的這兩個組即使在 2. 5 μ g/kg的劑量上也具有顯著提高的Hb水平。該實驗證明，rHuEPO-Fc展示出與rHuEPO 一樣有效的體內(nèi)紅細胞生成活性。處理組中Hb水平的提高是劑量依賴性的。但是，在 12. 5 μ g/kg rHuEPO-Fc的劑量上在小鼠中誘導了 Hb水平的飽和提高，而只有在62. 5 μ g/ kg rHuEPO的劑量上才獲得了相似的Hb水平的飽和提高。由2. 5 μ g/kg rHuEPO-Fc誘導的 Hb水平的提高也大于由2. 5 μ g/kg rHuEPO所誘導的提高。這些結果暗示，由rHuEPO-Fc產(chǎn)生的紅細胞生成刺激比rHuEPO更有效。
通過將皮下注射次數(shù)減少至每周1次來進一步探究rHuEPO-Fc的紅細胞生成效力。如圖5中所示，經(jīng)rHuEPO-Fc處理的組在12. 5或62. 5 μ g/kg的劑量上顯示出劑量依賴性的Hb水平的提高。12. 5和62. 5 μ g/kg rHuEPO的劑量還都誘導了相似程度的Hb水平的提高，所述程度遠低于由62. 5 μ g/kg的rHuEPO-Fc所誘導的程度。這強有力地表明， rHuEPO-Fc具有增強的體內(nèi)紅細胞生成活性。據(jù)推測這是由于所述rHuEPO-Fc蛋白中二聚體EPO分子導致的延長的rHuEPO-Fc的體內(nèi)半衰期或改善的EPO受體結合/激活，或兩者的組合效應。
當每周3次或每周1次靜脈內(nèi)施用相同劑量(12. 5 μ g/kg)的rHuEPO-Fc或rHuEPO 時，對于所有處理組均觀察到Hb水平的提高(圖6)。然而，每周1次靜脈內(nèi)施用rHuEPO-Fc誘導了更大、更持久的Hb水平的提高，其可在處理結束后持續(xù)更長的時間。該數(shù)據(jù)進一步支持了，與具有天然發(fā)生的EPO蛋白的結構的rHuEPO相比，所述rHuEPO-Fc蛋白具有增強的紅細胞生成特性。
6. rHuEPO-Fc在切除5/6的腎的大鼠中的增強的紅細胞生成活性
正常小鼠中的實驗證明了 rHuEPO-Fc具有增強的體內(nèi)紅細胞生成活性。為了進一步觀察rHuEPO-Fc在刺激紅細胞生成中的功效，在具有實驗性腎臟貧血(通過切除 5/6的腎臟來產(chǎn)生)的大鼠中進行藥效動力學研究。將rHuEPO-Fc的功效與rHuEPO和 darbepoetin-a (60 μ g/ml，lot. No. N079，由 Kirin Brewery Co. ,Japan 生產(chǎn))的功效進 亍比較。
在本發(fā)明中使用Wistar大鼠(雄性和雌性的數(shù)目相等，體重160_180g，購自 Vitalriver Experiment Animal Inc.,Beijing,China. Licence No. SCXKl 1-00-0008)來建立由于通過兩步驟腎切除術產(chǎn)生的腎功能衰竭而形成的貧血癥模型[27]。通過在無菌條件下的兩次分開的手術對全身麻醉的大鼠實施5/6的腎切除術。在切除2/3的左腎后， 讓大鼠恢復20天。然后小心地切除右腎。施用抗生素以在每次手術后預防感染。最終切除總共5/6的腎臟組織。腎切除的大鼠逐漸發(fā)生腎功能不全和貧血癥。在腎切除術后50 天大鼠進入穩(wěn)定的貧血狀態(tài)，然后將其隨機分組(9只/組)以開始施用ΕΡ0。用一種劑量 0.5、12.5、62.5yg/kg)、一種注射途徑(通過尾靜脈的靜脈內(nèi)注射或皮下注射)和一種注射方案(每周1次或每兩周1次)的一個組合來處理各組大鼠。用體積的載體溶液注射對照組和模型組的大鼠。所述處理持續(xù)4周，總觀察時間為6周。
每周1次皮下施用的rHuEPO-Fc的所有劑量(2. 5、12. 5,62. 5 μ g/kg)都誘導了相比未接受EPO處理的模型對照組而言Hb水平的劑量依賴性提高。每周1次皮下施用的12. 5 和62. 5 μ g/kg的rHuEPO或darbepoetin也誘導了 Hb水平的提高。在用12. 5或62. 5 μ g/ kgrHuEP0-Fc處理的兩個組中增加的Hb水平都分別顯著高于用12. 5或62. 5 μ g/kg rHuEPO 處理的組。在用62. 5 μ g/kg rHuEPO-Fc處理的組中的Hb水平也稍微比在用62. 5 μ g/kg darb印oetin處理的組中的Hb水平高。在停止處理后，在用62. 5 μ g/kg rHuEPO-Fc處理的組中的Hb水平的降低比正常對照組和模型對照組慢得多，并且直至觀察結束時(在處理后兩周)都保持了比正常對照組和模型對照組高的Hb水平，從而表明更強和/或延長的紅細胞生成刺激作用(概括于圖7中)。
對于每兩周1次的皮下注射處理，只施用12. 5或62. 5 μ g/kg的所述三種EPO (圖 8)。與模型對照組相比，12. 5 μ g/kg rHuEPO僅僅增加Hb的水平，并且與正常對照組相比， 在經(jīng)62. 5 μ g/kg rHuEPO處理的組中的弱紅細胞生成應答不能將Hb水平恢復至正常水平。 以12. 5或62. 5 μ g/kg的劑量用rHuEPO-Fc或darb印oetin進行處理誘導了顯著的Hb水平的提高，其高于正常對照組，這表明rHuEPO-Fc和darb印oetin都產(chǎn)生有效的貧血狀況的改正。就功效而言，在相同劑量的rHuEPO-Fc和darb印oetin之間未觀察到顯著差異。 62. 5 μ g/kg的高劑量導致紅細胞生成的持續(xù)增加，直至觀察結束時(處理后2周)。這進一步暗示，rHuEPO-Fc和darb印oetin展示出長效地刺激體內(nèi)紅細胞生成的特性，該特性反過來可轉化成在臨床上減少對患者的施用頻率。
盡管已批準darb印oetin用于臨床應用(該應用具有較不頻繁的注射以增加患者的順應性和減少衛(wèi)生保健提供者的工作負擔)，但這些實驗數(shù)據(jù)強烈地表明本發(fā)明中公開的rHuEPO-Fc具有至少相似的潛在益處。如上所述，darb印oetin，作為包含額外的糖化合物(增加的糖基化)的人EPO分子的突變型類似物，可能具有增加的誘導體內(nèi)免疫發(fā)生的風險，所述免疫發(fā)生是由于改變的三維結構引起的。只有長期觀察經(jīng)歷使用darb印oetin 進行治療的患者才可作出對darb印oetin的免疫原性風險的決定性回答。相反地，沒有修飾EPO分子部分的rHuEPO-Fc的糖含量與天然人EPO相同或非常相似。在本發(fā)明者的純 rHuEPO-Fc蛋白中的唾液酸的量為大約10. Ommol/mmolEPO，這與報導的rHuEPO的參數(shù)一致。無外來氨基酸/連接肽的rHuEPO-Fc的R部分代表了人IgGl的一般結構，并且在理論上不會導致免疫原性應答。如果在臨床上被批準，rHuEPO-Fc可能為患者(尤其是需要長期施用的患者)提供比目前可獲得的rHuEPO和EPO類似物更好的選擇。
每兩周1次進行靜脈內(nèi)注射后，rHuEPO-Fc和darb印oetin (62. 5 μ g/kg)都能夠在具有腎臟貧血癥的大鼠中誘導相同的、遠高于正常對照大鼠中的正常Hb水平的Hb水平增加(圖9)。這進一步證明了由rHuEPO-Fc產(chǎn)生的紅細胞生成的持續(xù)刺激作用，因為 darb印oetin的功效已在臨床上得到證明。
來自骨髓細胞的細胞培養(yǎng)實驗的數(shù)據(jù)顯示rHuEPO-Fc、rHuEPO和darb印oetin都刺激了 CFU-E和BFU-E的形成，所述骨髓細胞是在處理(每周1次或每兩周1次皮下或靜脈內(nèi)施用)后從切除了 5/6的腎的大鼠中收集的。rHuEPO-Fc和darb印oetin的效力相似， 并且比rHuEPO強(圖10)。
在處理組和模型對照組中血液urinonitrogen(BUN)和肌酐(Crea)水平相似。所有處理組中的血清狗水平比模型對照組高。病理學檢查觀察到所有經(jīng)EPO處理的小鼠的骨髓和脾臟中紅細胞(RBC)相關細胞的分布增加。
7.獼猴中rHuEPO-Fc的藥物動力學研究
如上所述，本發(fā)明者以下列方式設計了 rHuEPO-Fc 融合蛋白的EPO部分保持天然 EPO的功能特性(例如刺激紅細胞生成)，和人IgGl的Fc片段使得融合蛋白能夠在循環(huán)中穩(wěn)定存在，從而延長了其體內(nèi)半衰期。上述動物研究已證明，與rHuEPO相比，rHuEPO-Fc的紅細胞生成活性得到增強。本發(fā)明者還進行了藥物動力學研究以確定相比rHuEPO而言的 rHuEPO-Fc的體內(nèi)半衰期。使用靈長類動物來產(chǎn)生數(shù)據(jù)，因為它們在生物學上與人類非常相似。
研究設計是基于文獻報導的，并且按照藥物動力學的一般指導來進行實驗。分別用5μ g/kg rHuEP0-Fc或rHuEPO靜脈內(nèi)注射兩組獼猴，每組5只猴子(34kg，購自 Experiment Animal Center, AMMS, China)。在注射之前和注射之后 0· 017、0· 167、0. 5、1、 2、4、8、12、24、48、96、168、240小時采集血液樣品。通過離心收集血清，并通過使用人促紅細胞生成素酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒(購自R&D Systems, Minneapolis, MN)來測定血清rHuEPO-Fc或rHuEPO水平。通過靜脈內(nèi)注射的rHuEPO-Fc和rHuEPO的平均半衰期(tl/2)分別是35. 24+/-5. 15小時和8. 72+/-1. 69小時(概括于圖11中)。
為了觀察rHuEPO-Fc的生物利用度，將5ug/kg rHuEPO-Fc皮下注射給5只獼猴。在注射前和注射后1、2、5、8、10、12、15、24、48、72、96、168、240小時采集血液樣品，并通過R&D試劑盒來測定rHuEPO-Fc的血清水平。對于皮下注射，生物利用度指數(shù)計算為 ；35. 71+/-5. 37%。這與報導的在慢性腎功能衰竭患者中的darb印oetin-α (Aranesp )的生物利用度數(shù)據(jù)相一致[9，15]。
該數(shù)據(jù)證明，rHuEPO-Fc在靈長類動物中具有顯著延長的半衰期，并且rHuEP0_Fc 的體內(nèi)半衰期為由Kirin Beer Brewing Co. of Japan生產(chǎn)的rHuEPO的至少4倍。延長的體內(nèi)半衰期可能有助于rHuEPO-Fc的增強的紅細胞生成活性。
8. rHuEPO-Fc 在食蟹猴(Macaca fascicularis)中的免疫原性
如上面所指明的，在rHuEPO-Fc融合蛋白的設計中要注意有意地避免或最小化 rHuEPO-Fc融合蛋白的免疫原性特性的改變。本發(fā)明者避免了在融合蛋白中包含/加入任何外來氨基酸或連接肽序列。圖IB的實施方案的所發(fā)明的HuEPO-Fc融合蛋白只包含天然 EPO蛋白和人IgGl的Fc片段(鉸鏈區(qū)、CH2、CH3)的多肽序列，并且在理論上不誘導免疫原性應答和抗rHuEPO-Fc蛋白抗體的產(chǎn)生。正如本領域技術人員將會認識到的，具有備選的結構的其他實施方案也包括在本發(fā)明中。
進行下列靈長類動物研究以觀察rHuEPO-Fc蛋白的免疫原性。每周3次用5 μ g/ kg純化的rHuEPO-Fc皮下注射10只食蟹猴(雄性/雌性=5/5，大約5歲，雄性平均體重為 4. 0 士 0. 3kg，雌性為 2. 9 士 0. 4kg，購自 Laboratory Animal Center, AMMS, China)，進行4周，并用等體積的載體溶液注射兩只食蟹猴作為對照動物。每周采集血清1次，進行 5周(處理后1周)，并使用純化的rHuEPO-Fc (5 μ g/ml)作為包被抗原通過ELISA就抗 rHuEPO-Fc的特異性抗體對其進行測試。此外，還在實驗期間測定了外周血中的RBC計數(shù)和 Hb水平。所得的數(shù)據(jù)顯示，盡管在經(jīng)rHuEPO-Fc處理的食蟹猴中觀察到被刺激的紅細胞生成的增加(平均RBC數(shù)目從4. 74 X 109/ml增加至6. 67 X 109/ml，并且平均Hb水平從12. 2g/ dl增加至13. 7g/dl)，但rHuEPO-Fc不能誘導可檢測的抗融合蛋白的特異性抗體。這些結果表明，rHuEPO-Fc融合蛋白不在靈長類動物中引起免疫原性。
9. rHuEPO-Fc在正常小鼠中的急性毒性研究
為了評估rHuEPO-Fc融合蛋白的安全性，在動物中進行急性毒性研究。
分別用過量的純化的rHuEPO-Fc (雄性=13. 3mg/kg,雌性=13. 2mg/kg)或等體積的載體溶液通過其尾靜脈來靜脈內(nèi)注射2組BALB/c小鼠(n = 20，等數(shù)目的雄性和雌性,5-6周齡，雌性平均體重為15. 8士0. 4g，雄性為15. 9士0. 6g，購自Chinese Academy of Medicine, China) 1次。除了觀察注射后的即時反應外，每天監(jiān)控和記錄一般行為和狀態(tài)、 活動性、進食和排便模式以及變化，進行14天。在第7天和第14天還對所有小鼠稱重。在注射后第15天，對小鼠的主要器官進行解剖檢查。如果觀察到器官的任何不尋常的改變或可疑的改變，則進行病理學檢查。
在所述2個組中的所有小鼠在注射后都沒有明顯的即時反應。在14天的時期內(nèi)， 未觀察到行為、活動性、進食和排便模式的明顯改變。此外，在測試期間兩組小鼠的重量都穩(wěn)定地增加，并且在注射后第7天或第14天在2個組之間未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。在腦、肺、心臟、肝臟和腎臟組織中未檢測到異常的或病理性的改變。這些結果表明，施用遠比對于展示正常紅細胞生成功能所需的量多的過量rHuEPO-Fc是安全的，并且無顯著的毒性效應。
10.野生型和突變型EPO融合蛋白的比較
還進行了用于比較野生型和突變型EPO蛋白的研究。如上所述，在一個實施方案中，本發(fā)明包括在氨基酸殘基172處的單個氨基酸突變(C172G)。為了進行比較，還制備了在殘基172處具有半胱氨酸氨基酸的野生型融合蛋白(圖12)。以與上述實施例1至3中相同的方法制備了所述野生型融合蛋白。關于重組質(zhì)粒的構建，使用下列oligo引物OiIAGENInc.，US)(與實施例1中的引物相比，EFL5w和EFL3w中改變的氨基酸以粗體標示)
EF5 :5， _ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct_3，；
EF3 :5， _ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag_3，；
EFL5w 5' _aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatcttgtgaca_3，；
EFL3w :5，_tgtcacaagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct_3，。
引物EFL5w和EFL 3w的序列分別列于SEQ. I. D. No. 9-10中。
進行在小鼠中的體內(nèi)實驗以將野生型融合蛋白(此處稱為rHuEPO-FcC)的紅細胞生成活性與突變型融合蛋白(即上述的本發(fā)明rHuEPO-Fc蛋白)和與重組人EPO(rHuEPO) 進行比較。為了進行比較，用于該實施例的所述三種蛋白(即rHuEPO-Fc、rHuEPO-FcC 和rHuEPO)的所有劑量是基于摩爾基礎的單獨的EPO分子部分的量。對于rHuEPO-Fc和 rHuEPO-FcC蛋白，如通過EPO的氨基酸重量對整個rHuEPO-Fc和rHuEPO-FcC分子的總氨基酸重量的比例(即399個aa中166個aa)所計算的，EPO部分貢獻了總分子量的41. 4%。
將rHuEPO-Fc (母液濃度300 μ g/ml)、rHuEPO_FcC (母液濃度90 μ g/ml)和具有天然人 EPO 結構的 rHuEPO (6000IU/0. 5ml,由 Kirin Brewery Co.，Japan 生產(chǎn))在載體溶液(2. 5mg/ml人血清白蛋白，5. 8mg/ml檸檬酸鈉，0. 06mg/ml檸檬酸和5. 8mg/ml氯化鈉， PH5.5-5.6)中稀釋。根據(jù)其活性/數(shù)量比例來計算總計的rHuEPO劑量。將BALB/c小鼠 (9至10周齡，體重18-22g，雄性和雌性數(shù)目相等，購自Experiment Animal Center, AMMS, China)隨機分組，每組8只。用一種劑量(2.5、12.5、62.5yg/kg)、一種注射途徑(s. c.) 和一種注射方案(每周3次或每周1次)的一種組合來處理各組小鼠。用等體積的載體溶液注射對照組小鼠。所述處理持續(xù)沈天。在處理前以及在處理的第2、6、9、13、16、19、22 和沈天采集用于測量的外周血樣品(尾靜脈)。通過吸光測定法將Hb測量為指數(shù)。根據(jù)各組的數(shù)據(jù)來計算平均值士SD，并在不同組之間進行t檢驗。
如圖13中所示，以每周3次的間隔施用所有三種EPO蛋白刺激了紅細胞生成。在 2. 5 μ g/kg或12. 5 μ g/kg的劑量上，rHuEPO-Fc誘導了比rHuEPO更高的Hb水平的提高。最高的Hb水平的提高通過12. 5 μ g/kg劑量的rHuEPO-Fc獲得。如由經(jīng)rHuEPO-FcC處理的組中的顯著更低的Hb水平的提高所表明的，2. 5 μ g/kg和12. 5 μ g/kg劑量的rHuEPO-FcC 誘導了相比等劑量的rHuEPO和rHuEPO-Fc而言弱得多的紅細胞生成。事實上，12. 5 μ g/kg rHuEPO-FcC誘導了相比2. 5 μ g/kgrHuEP0而言更低的Hb水平的提高。這些結果暗示，與具有天然EPO分子序列的rHuEPO相比，rHuEPO-FcC削弱了體內(nèi)紅細胞生成活性。相反地，本發(fā)明的rHuEPO-Fc融合蛋白展示出更強的紅細胞生成功能。以每周3次的間隔施用所述三種EPO蛋白大大地排除了所述蛋白的半衰期差異的影響。
通過減少皮下注射次數(shù)至每周一次來進一步評估rHuEPO-Fc和rHuEP0_FcC的紅細胞生成效力。如圖14中所示，在12. 5 μ g/kg或62. 5 μ g/kg的劑量上，與經(jīng)rHuEPO處理的組相比，經(jīng)rHuEPO-Fc處理的組顯示更高的Hb水平的提高。相反地，與由rHuEPO所誘導的Hb水平的提高相比，rHuEPO-FcC誘導了弱得多的Hb水平的提高。例如，在大多數(shù)時間點上，12. 5 μ g/kg rHuEPO誘導了相比62. 5 μ g/kgrHuEP0-FcC而言更高的Hb水平的提高。 這進一步表明，通過減少施用次數(shù)至包括半衰期的影響，rHuEPO-FcC展示出相比具有天然 EPO分子序列的rHuEPO和本發(fā)明的rHuEPO-Fc融合蛋白而言弱得多的體內(nèi)紅細胞生成功能。
總之，這些結果證明，與具有天然EPO分子序列的rHuEPO相比，由人EPO和人Fc 片段(鉸鏈、CH2和CH3)的天然分子序列融合形成的rHuEPO-FcC展示出弱得多的體內(nèi)紅細胞生成功能。特別地，所述rHuEPO-FcC融合蛋白的紅細胞生成活性低于天然EPO分子的紅細胞生成活性的1/5。這表明，EPO分子和人Fc片段的天然序列之間的融合削弱了 EPO分子的功能特性。通過在Fc片段的鉸鏈區(qū)中于第一個半胱氨酸殘基處進行單個氨基酸替代， 包含天然EPO分子序列和突變型Fc片段的本發(fā)明的rHuEPO-Fc融合蛋白顯示出相比天然 EPO分子而言更強的體內(nèi)紅細胞生成功能。該數(shù)據(jù)暗示，野生型Fc片段的鉸鏈區(qū)中的第一個半胱氨酸殘基不知何故干擾了 EPO分子，可能是由于使EPO分子的結構發(fā)生改變而導致的，并且這反過來削弱了 EPO分子在刺激紅細胞生成中的功能特性。
正如依據(jù)上述公開內(nèi)容而對于本領域技術人員來說將是顯然的，在本發(fā)明的實施中可能進行許多改變和修飾，但不背離其精神或范圍。
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1.包含直接連接至人IgGFc片段的人促紅細胞生成素分子的重組融合蛋白，其中所述融合蛋白具有相比天然發(fā)生的或重組的天然人促紅細胞生成素而言延長的體內(nèi)半衰期。
2.權利要求1的蛋白，其中所述蛋白的半衰期為所述天然人促紅細胞生成素的至少3倍。
3.權利要求2的蛋白，其中所述蛋白的半衰期為所述天然人促紅細胞生成素的至少4倍。
4.權利要求2的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有相比所述天然人促紅細胞生成素而言增強的紅細胞生成生物活性。
5.權利要求1的融合蛋白，其中所述Fc片段是IgGl片段。
6.權利要求5的融合蛋白，其中所述Fc片段包含鉸鏈區(qū)和CH2和CH3結構域。
7.權利要求6的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)的長度為至少9個氨基酸。
8.權利要求1的融合蛋白，其中所述蛋白具有SEQ.I. D. No. 2中所示的氨基酸序列或基本上與其同源的序列。
9.包含多個權利要求1的融合蛋白的多聚體蛋白構建體。
10.權利要求9的多聚體蛋白構建體，其中所述結構是二聚體。
11.包含多個多肽的多聚體蛋白，所述多肽各具有SEQ.I. D. No. 2中所示的氨基酸序列或基本上與其同源的序列。
12.權利要求11的蛋白，其中所述蛋白是二聚體。
13.權利要求12的蛋白，其中所述二聚體在所述多肽的鉸鏈結構域之間包含二硫鍵。
14.權利要求11的蛋白，其中所述多肽中的每一個具有大約75kDa的分子量。
15.權利要求12的蛋白，其中所述二聚體具有大約ISOkDa的分子量。
16.包含權利要求1的蛋白以及藥物學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。
17.編碼與SEQ.I. D. No. 2具有至少90%的氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有相比天然人促紅細胞生成素而言延長的體內(nèi)半衰期。
18.重組DNA分子，其包含SEQ.I. D. No. 1中所示的核酸序列或基本上與其同源的序列。
19.用權利要求18的重組DNA分子轉染的細胞系。
20.權利要求19的細胞系，其中所述細胞系是CHO細胞系。
21.產(chǎn)生權利要求1的蛋白的方法，其包括培養(yǎng)用權利要求18的DNA分子轉染的細胞系和純化由其編碼的多肽。
22.在哺乳動物中刺激紅細胞生成的方法，其包括給所述哺乳動物施用權利要求1的蛋白。
23.權利要求22的方法，其中所述哺乳動物是靈長類動物。
24.權利要求23的方法，其中所述靈長類動物是人。
25.在哺乳動物中刺激紅細胞生成的方法，其包括給所述哺乳動物施用權利要求16的藥物組合物。
26.權利要求25的方法，其中所述哺乳動物是靈長類動物。
27.權利要求沈的方法，其中所述靈長類動物是人。
28.權利要求22的方法，其中當靜脈內(nèi)或皮下施用時，在所述哺乳動物中所述蛋白的半衰期為天然人EPO的至少3倍。
29.權利要求觀的方法，其中當靜脈內(nèi)或皮下施用時，在所述哺乳動物中所述蛋白的半衰期為天然人EPO的至少4倍。
30.重組融合蛋白，其包含(a)具有臨近其C末端的半胱氨酸殘基的促紅細胞生成素肽部分；和(b)包含鉸鏈區(qū)的免疫球蛋白肽部分，其中位于最靠近所述促紅細胞生成素肽部分處的所述鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基與所述促紅細胞生成素肽部分的所述半胱氨酸殘基相隔至少12個氨基酸。
31.權利要求30的融合蛋白，其中促紅細胞生成素肽部分是完整的人促紅細胞生成素分子。
32.權利要求30的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白肽部分是包含所述鉸鏈區(qū)和CH2和 CH3結構域的人IgG Fc片段。
33.權利要求32的融合蛋白，其中所述IgGFc片段是IgGl片段。
34.權利要求32的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)直接偶聯(lián)至所述促紅細胞生成素肽部分。
35.權利要求32的融合蛋白，其在所述鉸鏈區(qū)和所述促紅細胞生成素肽部分之間包含肽連接體。
36.權利要求30的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)的長度為至少9個氨基酸。
37.權利要求36的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)在從所述鉸鏈區(qū)的N末端開始測量的第 6位氨基酸處具有非半胱氨酸殘基。
38.權利要求37的融合蛋白，其中所述非半胱氨酸殘基是中性氨基酸。
39.權利要求38的融合蛋白，其中所述非半胱氨酸殘基是甘氨酸。
40.權利要求36的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)是在從所述鉸鏈區(qū)的N末端開始測量的第6位氨基酸處具有非半胱氨酸殘基的Fc片段變體。
41.權利要求34的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)具有SEQ.I. D. No. 5中所示的氨基酸序列，或與其具有至少90%序列同一性并且在從所述鉸鏈區(qū)的N末端開始測量的第6位氨基酸處具有非半胱氨酸殘基的序列。
42.權利要求30的融合蛋白，其中當給哺乳動物施用時，所述蛋白的半衰期為以相同方式給所述哺乳動物施用的天然人促紅細胞生成素的至少3倍。
43.權利要求42的融合蛋白，其中當給哺乳動物施用時，所述蛋白的半衰期為以相同方式給所述哺乳動物施用的天然人促紅細胞生成素的至少4倍。
44.權利要求42的融合蛋白，其中所述哺乳動物是人。
45.包含第一和第二融合蛋白的二聚體，所述融合蛋白中的每一個為權利要求30中所定義的，其中所述第一融合蛋白的所述鉸鏈區(qū)通過二硫鍵結合至所述第二融合蛋白的所述鉸鏈區(qū)。
46.包含多個經(jīng)連接的融合蛋白的多聚體蛋白構建體，所述融合蛋白中的每一個為權利要求30中所定義的。
47.包含SEQ.I. D. No. 1中所示的核酸序列的重組DNA分子。
48.包含一對多肽的二聚體，所述多肽中的每一個具有SEQ.I. D. No. 2中所示的氨基酸序列。
全文摘要
描述了包含連接至免疫球蛋白肽部分的人促紅細胞生成素肽部分的重組融合蛋白。所述融合蛋白具有相比天然發(fā)生的或重組的天然人促紅細胞生成素而言延長的體內(nèi)半衰期。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期為天然人促紅細胞生成素的至少3倍。所述融合蛋白還展現(xiàn)出相比天然人促紅細胞生成素而言增強的紅細胞生成生物活性。在一個實施方案中，所述融合蛋白包含人促紅細胞生成素(EPO)分子的完整肽序列和人免疫球蛋白IgG1的Fc片段的肽序列。在所述融合蛋白中的Fc片段包含人免疫球蛋白IgG1的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結構域。所述EPO分子可直接連接至Fc片段以避免外來肽連接體，并當在體內(nèi)施用時減少免疫原性應答的風險。在一個實施方案中，所述鉸鏈區(qū)是在第6位氨基酸處具有非半胱氨酸殘基的人Fc片段變體。本發(fā)明還涉及編碼所述融合蛋白的核酸和氨基酸序列，以及用于產(chǎn)生所述融合蛋白的經(jīng)轉染的細胞系和方法。本發(fā)明進一步包括包含所述融合蛋白的藥物組合物，和使用所述融合蛋白和/或所述藥物組合物(例如在需要治療的受試者中刺激紅細胞生成)的方法。
文檔編號C12P21/02GK102516399SQ201210004888
公開日2012年6月27日 申請日期2007年1月25日 優(yōu)先權日2006年1月27日
發(fā)明者劉龍斌, 張瑞, 徐靜, 杜勇, 王海濤 申請人:諾瓦根控股公司