專利名稱：胚胎干細(xì)胞系及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胚胎干細(xì)胞系及其制備方法，更具體地說，涉及通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入去核的人卵母細(xì)胞、培養(yǎng)所得的核移植卵母細(xì)胞以形成胚泡、并培養(yǎng)分離自所述胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)而制備的胚胎干細(xì)胞系，及其制備方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞通常指能分化成組成身體的所有類型的成熟功能細(xì)胞的未分化細(xì)胞。例如，造血干細(xì)胞能分化成多種血球細(xì)胞(corpuscularcell)。從胚胎衍生的胚胎干細(xì)胞(ES cell)具有分化和發(fā)育成形成身體的所有類型的器官、組織和細(xì)胞的多能性。
1981年構(gòu)建的小鼠ES細(xì)胞系已經(jīng)為培育人ES細(xì)胞提供了技術(shù)和范例。已經(jīng)利用小鼠畸胎癌，即在相近育種(closely bred)的小鼠品系的生殖腺出現(xiàn)的腫瘤，研究了ES細(xì)胞的發(fā)育(Evans & Kaufman，Nature，292154-156(1981))。
Bongso等人報(bào)道了對從衍生自體外受精的人胚胎分離的細(xì)胞進(jìn)行短期培養(yǎng)和維持的方法(Bongso等，Human Reproduction，92110-2117(1994))。Bongso等人分離的細(xì)胞具有在多能干細(xì)胞中預(yù)期的形態(tài)學(xué)；然而，由于沒有使用合適的飼養(yǎng)層(feeder layer)，它們顯然不能被長期培養(yǎng)。
從獼猴和絨猴的胚泡中已經(jīng)制備靈長類ES細(xì)胞。靈長類ES細(xì)胞是二倍體的，很類似于人ES細(xì)胞。
盡管就表型而言，來自猴和人類的ES細(xì)胞與小鼠的ES細(xì)胞有些不同，但是從猴和人制備的ES細(xì)胞的研究已經(jīng)提示多能干細(xì)胞可以衍生自人胚泡(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927844-7848(1995))。
1998年Thomson等人培育的人多能ES細(xì)胞特有的特征如下列所示(Thomson等，Science，2821145-1147(1998))(1)表達(dá)階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)、腫瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)、腫瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)和堿性磷酸酶；(2)高端粒酶活性；(3)當(dāng)注射入小鼠時(shí)，分化成三種類型的胚盤細(xì)胞；(4)依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞；和(5)對人白血病抑制因子(hLIF)無應(yīng)答。
Thomson等人從由一對在進(jìn)行不育治療的夫婦捐贈(zèng)的胚泡獲得上述ES細(xì)胞。具體地說，通過免疫手術(shù)(immunosurgically)除去已知抑制ES細(xì)胞形成的滋養(yǎng)外胚層，將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)鋪在衍生自小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，在短期的附著和擴(kuò)展后，將ICM重鋪在另一飼養(yǎng)層上。就培養(yǎng)基或培養(yǎng)系統(tǒng)而言，Thomson的方法并不明顯異于小鼠ES細(xì)胞方案；并仍然獲得相對較高的成功率。
人多能ES細(xì)胞的分離和在哺乳動(dòng)物中體細(xì)胞核移植(SCNT)的突破(Solter，Nat.Rev.Genet.，1199-207(2000))已經(jīng)提高了實(shí)施人SCNT以生產(chǎn)實(shí)際上不受限制的未分化細(xì)胞的來源以用于研究的可能性，這種可能性在組織修復(fù)和移植藥物中具有潛在應(yīng)用。這個(gè)被稱為“治療性克隆”的概念利用了將體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞中(Lanza等，Nat.Med.，5975-977(1999))。以前對這種治療性克隆的研究涉及牛ES樣細(xì)胞的生產(chǎn)(Cibelli等，Nat.Biotechnol.，16642-646(1998))和來自被克隆胚泡的ICM的小鼠ES細(xì)胞的生產(chǎn)(Munsie等，Curr.Biol.，10989-992(2000)；Wakayama等，Science，292740-743(2001))，以及直至8至10細(xì)胞期的克隆人胚胎的發(fā)育(Cibelli等，J.Regen.Med.，225-31(2001))。
盡管一些報(bào)道指出使用非人哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞可建立ES細(xì)胞系，但仍未報(bào)道利用核移植技術(shù)從人卵母細(xì)胞培育出ES細(xì)胞系。
發(fā)明概述然而，經(jīng)過深入研究和開發(fā)工作，本發(fā)明人通過培養(yǎng)核移植的人卵母細(xì)胞已經(jīng)成功建立ES細(xì)胞系。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞制備的核移植卵母細(xì)胞中衍生的ES細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備ES細(xì)胞系的方法，包括步驟(1)培養(yǎng)人體細(xì)胞以制備核供體細(xì)胞；(2)將人卵母細(xì)胞去核以制備受體卵母細(xì)胞；(3)通過將所述核供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入所述受體卵母細(xì)胞并使核供體細(xì)胞的細(xì)胞核與受體卵母細(xì)胞融合來制備核移植卵母細(xì)胞；
(4)將所述核移植卵母細(xì)胞進(jìn)行重新編程(reprogramming)、激活和體外培養(yǎng)以形成胚泡；和(5)從所述胚泡分離ICM并在未分化狀態(tài)培養(yǎng)ICM以建立ES細(xì)胞系。
本發(fā)明另外的目的是提供適于體外培養(yǎng)通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備的核移植卵母細(xì)胞的培養(yǎng)基。
本發(fā)明另一個(gè)目的是還提供分化自ES細(xì)胞系的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞(neuro progenitor)，其中該ES細(xì)胞系衍生自通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備的核移植卵母細(xì)胞。
本發(fā)明另外目的是還提供一種制備分化自ES細(xì)胞系的神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，該ES細(xì)胞系衍生自通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備的核移植卵母細(xì)胞，所述方法包括步驟(1)培養(yǎng)ES細(xì)胞系以形成胚狀體；(2)在存在適于所述胚狀體的細(xì)胞分化成神經(jīng)祖細(xì)胞的活性物質(zhì)時(shí)培養(yǎng)所述胚狀體；和(3)選擇表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞的標(biāo)記的細(xì)胞并培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞以獲得神經(jīng)祖細(xì)胞。
附圖簡述通過下列本發(fā)明的說明書連同所跟隨的附圖將說明本發(fā)明的上述和其它目的及特征，其中

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的衍生自核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞的未分化集落的照片(Ax100，Bx200)；圖2表示根據(jù)本發(fā)明從通過加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉和纖連蛋白混合物得到的未分化集落中分化的神經(jīng)祖細(xì)胞的熒光染色照片(x400)；圖3描述用持定吸液管(1)和切割吸液管(2)切割處理卵母細(xì)胞(3)的透明帶；圖4表示顯示用持定吸液管(1)和切割吸液管(2)除去卵母細(xì)胞的第一極體和細(xì)胞核(3)的照片；圖5提供顯示用持定吸液管(1)和轉(zhuǎn)移吸液管(4)將核供體細(xì)胞移植入去核的受體卵母細(xì)胞(3)的照片；圖6A至6D圖解概括衍生自根據(jù)本發(fā)明制備的核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞系的核型分析結(jié)果以及從一名女性獲得的體細(xì)胞的核型分析結(jié)果，所述體細(xì)胞提供用于建立所述ES細(xì)胞系的細(xì)胞核；圖7顯示在通過將根據(jù)本發(fā)明獲得的未分化細(xì)胞集落注射入免疫缺陷型小鼠的生殖腺中而形成的畸胎瘤之中所鑒定的三種類型的胚盤細(xì)胞(A軟骨，B腸道，C神經(jīng)管(A、B、Cx200))；和圖8提供確定來自根據(jù)本發(fā)明的ES細(xì)胞系的胚狀體的形成的照片(A、B、C內(nèi)胚層；D、E、F中胚層；G、H、I外胚層；Aα-1-胎蛋白；B細(xì)胞角蛋白；CHNF-2-α；DBMP-4；EMyo D；F結(jié)蛋白；G神經(jīng)絲；HS-100；和INCAM)。
發(fā)明詳述本文所用的術(shù)語“核移植(nuclear transfer)”指將體細(xì)胞(或稱為“核供體細(xì)胞”)的細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞(或稱為“受體卵母細(xì)胞”)的過程。通過核移植得到的細(xì)胞稱為“移植細(xì)胞核的卵母細(xì)胞”或“核移植卵母細(xì)胞”。本文所用的術(shù)語“體細(xì)胞”指具有兩組染色體(2n)并組成身體的任何細(xì)胞，但排除具有一組染色體(n)的生殖細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“自體核移植卵母細(xì)胞”指通過將體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞所得的移植細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，其中所述體細(xì)胞從期望接受衍生自移植細(xì)胞核的卵母細(xì)胞的干細(xì)胞或從所述干細(xì)胞分化的特定細(xì)胞或組織的人中分離。
因此，本發(fā)明的一個(gè)突出優(yōu)勢或好處歸于下列事實(shí)接受衍生自自體核移植卵母細(xì)胞的特定細(xì)胞或組織的人將不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥或遭受副作用，因?yàn)檫@樣的細(xì)胞或組織攜帶該人的遺傳特征。
術(shù)語“胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)”指衍生自胚胎的未分化細(xì)胞，其具有分化成各種類型成熟細(xì)胞的能力。本文中，“胚胎”指受精后直到八(8)周的受精卵或處于相應(yīng)發(fā)育期的核移植卵母細(xì)胞。通過所述受精卵或核移植卵母細(xì)胞的反復(fù)分裂可制備包含含有ICM和滋養(yǎng)外胚層的胚泡的胚胎。
術(shù)語“衍生自自體核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞系”或“自體核移植的ES細(xì)胞系”指從自體核移植卵母細(xì)胞分離的ICM衍生的干細(xì)胞系。
術(shù)語“神經(jīng)祖細(xì)胞”指可以分化成包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，例如星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膜細(xì)胞(schwann cell)、衛(wèi)星細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和小膠質(zhì)在內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供制備ES細(xì)胞系的方法，包括步驟(1)培養(yǎng)人體細(xì)胞以制備核供體細(xì)胞；(2)將人卵母細(xì)胞去核以制備受體卵母細(xì)胞；(3)通過將所述核供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入所述受體卵母細(xì)胞并使核供體細(xì)胞的細(xì)胞核與受體卵母細(xì)胞融合來制備核移植卵母細(xì)胞；
(4)將所述核移植卵母細(xì)胞進(jìn)行重新編程、激活和體外培養(yǎng)以形成胚泡；和(5)從所述胚泡分離ICM并在未分化狀態(tài)培養(yǎng)ICM以建立ES細(xì)胞系。
在下文詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明制備ES細(xì)胞系的方法。
步驟1核供體細(xì)胞的制備培養(yǎng)人體細(xì)胞以作為核供體細(xì)胞。
來自人的體細(xì)胞作為所述的核供體細(xì)胞，并將其細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞。
對于體細(xì)胞的類型或來源并沒有限制，只要它是來自于人，并且還可使用從為商業(yè)目的保藏人細(xì)胞的研究所獲得的體細(xì)胞。優(yōu)選示范性體細(xì)胞包括真皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞，等等。
如果根據(jù)本發(fā)明制備自體核移植卵母細(xì)胞，從期望接受衍生自所述核移植卵母細(xì)胞的干細(xì)胞或從所述干細(xì)胞分化的特定細(xì)胞或組織的個(gè)體中采集核供體細(xì)胞。
通過用Mather和Barnes法(Animal Cell Culture Methodsvol.57of Methods in Cell Biology(Mather & Barneseds.，Academic Press，1998))培養(yǎng)體細(xì)胞以建立細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，將子宮液體和含有P/S抗生素(青霉素10,000IU，鏈霉素10mg)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)加到體細(xì)胞。離心并洗滌該體細(xì)胞，并在含有人血清、非必需氨基酸(NEAAs)和P/S抗生素的DMEM培養(yǎng)基中在例如39℃、5％CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。
特別地，如果用卵丘細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，可以通過用透明質(zhì)酸酶處理卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物以分離卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞層、將胰蛋白酶-EDTA溶液加到所述卵丘細(xì)胞層并將所得溶液放置在例如飽和濕度下、39℃、5％CO2的環(huán)境中制備卵丘細(xì)胞。離心和洗滌后，在上述相同的條件下培養(yǎng)收集的卵丘細(xì)胞。
步驟2受體卵母細(xì)胞的制備本發(fā)明用到的受體卵母細(xì)胞指缺少其自身的細(xì)胞核并接受來自人體細(xì)胞的外源細(xì)胞核的卵母細(xì)胞。
可以通過從人卵巢收集超數(shù)排出的卵母細(xì)胞(superovulatedoocyte)或從為商業(yè)目的保藏人卵母細(xì)胞的研究所獲得卵母細(xì)胞并用本領(lǐng)域公知方法培養(yǎng)卵母細(xì)胞，從而制備成熟的卵母細(xì)胞(Yuzpe等，J.Reprod.Med.，34937-942(1989))。例如，通過在補(bǔ)充了5％人血清白蛋白(HSA)的購自瑞典歌德堡市Vitro Life公司的G1.2培養(yǎng)基中在例如5％CO2的條件下培養(yǎng)卵母細(xì)胞4小時(shí)，卵母細(xì)胞得到成熟。
然后，通過從卵母細(xì)胞周圍除去卵丘細(xì)胞并去除透明帶部分和含有第一極體的細(xì)胞質(zhì)，以制備去核的受體卵母細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，按如下實(shí)施去核過程。
將成熟卵母細(xì)胞置于含有透明質(zhì)酸酶的洗滌溶液中，物理除去卵丘細(xì)胞。然后，用G1.2培養(yǎng)基洗滌成熟卵母細(xì)胞。隨后，刺破卵母細(xì)胞的透明帶以在其中形成一個(gè)小孔。從所述小孔除去含有第一極體的、相當(dāng)于總細(xì)胞質(zhì)的10至15％的細(xì)胞質(zhì)部分，以使卵母細(xì)胞去核。去核后，用G1.2培養(yǎng)基洗滌去核的卵母細(xì)胞，并置于G1.2培養(yǎng)基中用于培養(yǎng)。
可以使用UV檢測器檢測用Hoechst 33342(Sigma Co.，St.Louis，MO，美國)染色的細(xì)胞質(zhì)，以確認(rèn)去核。
步驟3核移植卵母細(xì)胞的制備和電融合將步驟1制備的核供體細(xì)胞移植入步驟2中得到的去核受體卵母細(xì)胞，并通過電融合處理核移植卵母細(xì)胞。
通過將體細(xì)胞的細(xì)胞核或整個(gè)體細(xì)胞移植入受體卵母細(xì)胞，來實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞到受體卵母細(xì)胞的核移植。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，按如下實(shí)施核移植和電融合。
首先，用G1.2培養(yǎng)基洗滌去核的卵母細(xì)胞。在植物凝集素-P(PHA-P)溶液中，使用轉(zhuǎn)移吸液管(transfer pipette)將核供體細(xì)胞經(jīng)過透明帶中形成的小孔注射入去核的卵母細(xì)胞，以生成核移植卵母細(xì)胞。然后，用G1.2培養(yǎng)基洗滌得到的核移植卵母細(xì)胞，并置于相同的培養(yǎng)基中。
隨后，在細(xì)胞操作器(cell manipulator)的幫助下將核移植卵母細(xì)胞進(jìn)行電融合處理。將甘露醇溶液加入含有核移植卵母細(xì)胞的G1.2培養(yǎng)基。將所得的含有核移植卵母細(xì)胞的甘露醇溶液置于細(xì)胞操作器的兩電極之間，并放在適當(dāng)?shù)奈恢檬沟煤斯w細(xì)胞朝向(+)電極。用間隔例如1秒、每次10至15μs的0.75至2.00kV/cm范圍的直流電處理1至5次，進(jìn)行電融合核移植卵母細(xì)胞。
用甘露醇溶液和G1.2培養(yǎng)基洗滌融合的核移植卵母細(xì)胞。該步驟用到的甘露醇溶液通過將牛血清白蛋白(BSA)和甘露醇溶解在pH范圍7.2至7.4的4-(2-羥乙基)-1-甲呱丙嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液中制備。
步驟4核移植卵母細(xì)胞的重新編程、激活和體外培養(yǎng)為使步驟3中制備的核移植卵母細(xì)胞經(jīng)歷如同由于精子和卵母細(xì)胞之間的融合形成的普通受精卵母細(xì)胞一樣的發(fā)育過程，應(yīng)審慎選擇一些重要因素，如重新編程時(shí)間、激活方法和體外培養(yǎng)條件。
本發(fā)明提供有益于激活和培養(yǎng)核移植卵母細(xì)胞的獨(dú)特受精和發(fā)育方法。具體地說，將步驟3中電融合制備的核移植卵母細(xì)胞進(jìn)行重新編程、激活和體外培養(yǎng)以形成胚泡。
重新編程時(shí)間(reprogramming time)是指電融合和激活之間經(jīng)過的時(shí)間，重新編程的時(shí)長可影響核移植卵母細(xì)胞的發(fā)育能力(具體地說，胚泡形成率)。要求該重新編程時(shí)間允許體細(xì)胞的基因表達(dá)模式變成核移植卵母細(xì)胞發(fā)育所適宜的和必需的模式。所述的重新編程時(shí)間在染色質(zhì)重塑(chromatin remodeling)中起決定作用，且已知它可決定核移植卵母細(xì)胞在體內(nèi)和體外的發(fā)育能力。
本發(fā)明的重新編程時(shí)間可以是20小時(shí)或更低，優(yōu)選是6小時(shí)或更低，更優(yōu)選是3小時(shí)或更低，并且最優(yōu)選是約2小時(shí)。
重新編程后，可以通過各種化學(xué)、物理和機(jī)械刺激例如鈣離子載體、離子霉素、乙醇、Tyrode溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，美國)、嘌呤霉素等等來激活核移植卵母細(xì)胞。本發(fā)明中，優(yōu)選通過鈣離子載體處理核移植卵母細(xì)胞以用于激活。更優(yōu)選用鈣離子載體并隨后用6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)處理核移植卵母細(xì)胞。特別地，使用濃度范圍5至15μM的、優(yōu)選約10μM的鈣離子載體。此外，使用濃度范圍1.5至2.5mM的、優(yōu)選約2.0mM的6-DMAP。如果鈣離子載體和6-DMAP的濃度在以上各自范圍中，可以有效地激活核移植卵母細(xì)胞。優(yōu)選鈣離子載體和6-DMAP都溶于體外培養(yǎng)基中。
體外培養(yǎng)基的代表性實(shí)例是包含NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2、乳酸鈉、葡萄糖、酚紅、BSA、卡那霉素、必需氨基酸(EAAs)、NEAAs和谷氨酸鹽的G1.2培養(yǎng)基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)。
另外，為了核移植卵母細(xì)胞的有效體外培養(yǎng)，優(yōu)選在培養(yǎng)基中補(bǔ)充本領(lǐng)域已知的多種能量底物或采用使用了具有適于胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的不同組成的至少兩種培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。本發(fā)明中有用的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)可以是任何一種可商購的培養(yǎng)系統(tǒng)。優(yōu)選地，通過連續(xù)使用彼此具有不同組成的兩種培養(yǎng)基例如G 1.2和G 2.2培養(yǎng)基(VitroLife，Goteborg，瑞典)實(shí)施所述體外培養(yǎng)。
所述體外培養(yǎng)基優(yōu)選含有具有氨基酸的人改良的合成輸卵管液體(hmSOFaa)，稱其為“SNUnt-2培養(yǎng)基”。通過對具有氨基酸的改良合成輸卵管流體(mSOFaa)(Choi等，Theriogenology，581187-1197(2002))分別補(bǔ)充HSA和果糖而不是BSA和葡萄糖制備hmSOFaa。mSOFaa培養(yǎng)基已經(jīng)廣泛用于培養(yǎng)牛胚。
特別地，SNUnt-2培養(yǎng)基包含95至110mM NaCl、7.0至7.5mMKCl、20至30mM NaHCO3、1.0至1.5mM NaH2PO4、3至8mM乳酸鈉、1.5至2.0mM CaCl2·2H2O、0.3至0.8mM MgCl2·6H2O、0.2至0.4mM丙酮酸鈉、1.2至1.7mM果糖、6至10mg/ml人血清白蛋白、0.7至0.8μg/ml卡那霉素、1.5至3％EAAs、0.5至1.5％NEAAs、0.7至1.2mM L-谷氨酸鹽，以及0.3至0.7％的胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉混合物。優(yōu)選地，SNUnt-2培養(yǎng)基包含如表1所列的成分。
表1
*ITS1.0g/L胰島素、0.55g/L轉(zhuǎn)鐵蛋白和0.67mg/L亞硒酸鈉的混合物。
本發(fā)明的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)可采用不同培養(yǎng)基的任意組合。例如，在兩步培養(yǎng)系統(tǒng)中，在G 1.2培養(yǎng)基中進(jìn)行第一次培養(yǎng)，在SNUnt-2培養(yǎng)基中進(jìn)行第二次培養(yǎng)。
步驟5除去透明帶或其部分為了獲得衍生自步驟4中得到的胚泡的ES細(xì)胞，不得不從胚泡上除去透明帶或其部分?？梢酝ㄟ^用本領(lǐng)域已知的方法例如鏈霉蛋白酶處理、在酸性Tyrode溶液中溫育，或物理方法例如激光切割實(shí)施該除去過程。優(yōu)選使用溶于適宜培養(yǎng)基例如PBS、G2培養(yǎng)基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)或S2培養(yǎng)基(Scandinavian IVF Sciences，Goteborg，瑞典)中的鏈霉蛋白酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將鏈霉蛋白酶溶于等體積的PBS和S2培養(yǎng)基的混合物中。用0.1％鏈霉蛋白酶處理胚泡約1至2分鐘，優(yōu)選1至1.5分鐘，以除去其中的透明帶。
步驟6滋養(yǎng)層的去除和ICM的分離如上所述一旦從胚泡除去透明帶，便露出滋養(yǎng)層。優(yōu)選從ICM完全分離滋養(yǎng)層。使用本領(lǐng)域中一種已知方法，例如利用抗體的免疫手術(shù)法，或使用吸液管的機(jī)械方法從ICM分離滋養(yǎng)層。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過免疫手術(shù)法除去滋養(yǎng)層，其使用相應(yīng)于滋養(yǎng)層表面的抗原的抗體處理滋養(yǎng)層。更優(yōu)選地是聯(lián)合補(bǔ)體處理來實(shí)施免疫手術(shù)。如果這樣，可獨(dú)立或同時(shí)使用抗體和補(bǔ)體。在抗體和補(bǔ)體之間的優(yōu)選組合可包括抗胎盤堿性磷酸酶抗體(anti-AP)和幼兔補(bǔ)體，或抗人血清抗體和豚鼠補(bǔ)體。
用適宜的培養(yǎng)基例如SNUnt-2、G2.2或S2培養(yǎng)基稀釋抗體和補(bǔ)體。優(yōu)選地，可以用S2培養(yǎng)基以1∶20比例稀釋抗-AP；且以1∶1比例稀釋其它抗體和補(bǔ)體。
優(yōu)選用抗體并隨后用補(bǔ)體處理被除去透明帶的胚泡。優(yōu)選地，用抗體處理胚泡約30分鐘，用適宜的培養(yǎng)基洗滌，如NUnt-2、G2.2和S2培養(yǎng)基，然后用補(bǔ)體處理約30分鐘。
此外，通過用適宜的培養(yǎng)基例如NUnt-2、G2.2或S2洗滌胚泡，以從胚泡除去滋養(yǎng)層或其部分。如果這樣，可通過本領(lǐng)域已知的機(jī)械方法如使用小口徑的吸液管吸取含有滋養(yǎng)層的溶液除去滋養(yǎng)層。
通過這些步驟，從胚泡除去滋養(yǎng)層；并獲得ICM，即其中的剩余部分。
步驟7在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)ICMs由于當(dāng)在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)ICMs可維持它們的未分化狀態(tài)，所以將步驟6中分離的ICMs培養(yǎng)在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上。有時(shí)候，人們提出hLIF可用于替代飼養(yǎng)層維持ICMs的未分化形態(tài)。然而，不使用成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層而維持人細(xì)胞的未分化狀態(tài)實(shí)際上是不可能的。因此，不誘導(dǎo)ES細(xì)胞胚外分化和凋亡的條件通常要求在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。
優(yōu)選采用小鼠源和/或人源成纖維細(xì)胞用于制備成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。可單獨(dú)或混和使用它們。更優(yōu)選地使用從衍生自人自體核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞所分化的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層(該飼養(yǎng)層被稱為“自體飼養(yǎng)層”)。最優(yōu)選地使用從衍生自個(gè)體的自體核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞所分化的成纖維細(xì)胞。使用所述飼養(yǎng)層細(xì)胞可防止其它外源細(xì)胞污染ES細(xì)胞。
當(dāng)與鼠源成纖維細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)混和時(shí)，所述人源成纖維細(xì)胞能誘導(dǎo)ES細(xì)胞的最適生長和分化抑制。
成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的細(xì)胞密度可影響其穩(wěn)定性和能力。如果使用鼠和人成纖維細(xì)胞的混合物，則優(yōu)選保持人成纖維細(xì)胞處于例如2.5×104細(xì)胞/cm2的密度和鼠成纖維細(xì)胞處于例如7.0×104細(xì)胞/cm2的密度。如果只使用鼠成纖維細(xì)胞，則優(yōu)選使用密度范圍7.5×104至1.0×104細(xì)胞/cm2的相同細(xì)胞。優(yōu)選在向其中加入ES細(xì)胞之前6至48小時(shí)建立所述飼養(yǎng)層。
另外，優(yōu)選使用具有低傳代數(shù)的鼠或人成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的質(zhì)量可影響支持ES細(xì)胞的能力。優(yōu)選使用從胚胎分離的成纖維細(xì)胞。優(yōu)選從13.5天齡胎獲得鼠成纖維細(xì)胞，和優(yōu)選從胚胎或胎組織獲得人成纖維細(xì)胞?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域已知的細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)這些成纖維細(xì)胞。
在處理鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，關(guān)鍵是盡量減少胰蛋白酶的使用并阻止細(xì)胞過密。否則，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞不能支持未分化ES細(xì)胞的生長。不得不首先測試所制備的每批小鼠胚胎成纖維細(xì)胞以確定其是否適于支持和維持ES細(xì)胞。
在新的原始胚胎成纖維細(xì)胞和經(jīng)受過凍融處理的成纖維細(xì)胞之間，通常認(rèn)為前者是更適于支持ES細(xì)胞的恢復(fù)(renewal)。然而，即使在重復(fù)凍融后某些批次也表現(xiàn)出它們支持ES細(xì)胞的能力。
某些小鼠品種比其它品種可產(chǎn)生更適于支持ES細(xì)胞的胚胎成纖維細(xì)胞。例如，已經(jīng)證實(shí)從通過近親交配129/Sv或CBA品系或通過雜交129/Sv和C57/B16品系而生產(chǎn)的小鼠中衍生的成纖維細(xì)胞更適于支持ES細(xì)胞。
此外，優(yōu)選通過使用本領(lǐng)域已知的任意一種方法包括輻射和化學(xué)處理來抑制飼養(yǎng)層細(xì)胞的生長。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用絲裂霉素C處理所述細(xì)胞。
將由此制備的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)在包被了明膠，優(yōu)選0.1％明膠的培養(yǎng)皿上。
將成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層維持在ES培養(yǎng)基中。一種適宜的ES培養(yǎng)基是包含20％血清替代物、0.1mM β-巰基乙醇、1％NEAAs、2mM谷氨酸鹽、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素以及4ng/ml人重組成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基。
另外，所述ES培養(yǎng)基可補(bǔ)充能刺激干細(xì)胞生長或生存或者能抑制其分化的可溶性生長因子。所述生長因子的代表性實(shí)例是人多能干細(xì)胞因子、ES細(xì)胞恢復(fù)因子，等等。
可以將分離的ICM培養(yǎng)6天或更久，并從中產(chǎn)生細(xì)胞克隆。所述克隆一般包括未分化的干細(xì)胞?？梢酝ㄟ^用本領(lǐng)域中一種已知方法分離未分化的干細(xì)胞。優(yōu)選使用微量吸液管以分離未分化的干細(xì)胞。可用無Ca2+/Mg2+的PBS培養(yǎng)基或利于細(xì)胞解離的酶例如分散酶處理來補(bǔ)充所述的機(jī)械分離。
步驟8ES細(xì)胞的亞培養(yǎng)將步驟7中培養(yǎng)的ES細(xì)胞從飼養(yǎng)層上分開，并轉(zhuǎn)入新鮮的飼養(yǎng)層。然后，可以進(jìn)一步培養(yǎng)ES細(xì)胞使其以形態(tài)學(xué)未分化狀態(tài)繁殖。
如果這樣，優(yōu)選培養(yǎng)ES細(xì)胞5至7天。在培養(yǎng)的約第二天開始觀察到未分化的干細(xì)胞集落。所述干細(xì)胞的明顯特征是高細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例、清晰的核仁、稠密的克隆形成和可區(qū)別的細(xì)胞邊緣。
通過從干細(xì)胞集落分離未分化的干細(xì)胞團(tuán)，使得未分化干細(xì)胞開始繁殖?？梢酝ㄟ^用本領(lǐng)域中一種已知方法例如化學(xué)或機(jī)械方法實(shí)施所述分離。優(yōu)選地，通過用無Ca2+/Mg2+的PBS培養(yǎng)基洗滌、一種機(jī)械方法或其組合從所述集落分離干細(xì)胞。更優(yōu)選從所述集落機(jī)械分離干細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用無Ca2+/Mg2+的PBS培養(yǎng)基減少細(xì)胞間的附著力。在以上培養(yǎng)基溫育約15至20分鐘后，細(xì)胞自身開始逐步從飼養(yǎng)層分開，并最終以具有預(yù)期大小的細(xì)胞團(tuán)(clump)得以分離。如果證明所述細(xì)胞分離是不充分的，使用微量吸液管的尖銳邊緣的機(jī)械方法可以更有效地用于分離和切割所述細(xì)胞團(tuán)。
也可使用利用酶的化學(xué)方法。可單獨(dú)使用或組合機(jī)械方法使用酶，優(yōu)選分散酶。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在機(jī)械切割集落后，通過用分散酶處理，有可能從所述集落分離細(xì)胞團(tuán)。在含有Ca2+/Mg2+的PBS培養(yǎng)基中進(jìn)行集落切割。在微量吸液管尖銳邊緣的幫助下，可以將集落機(jī)械切割成細(xì)胞團(tuán)，每個(gè)細(xì)胞團(tuán)含有約100個(gè)細(xì)胞。一旦分離了細(xì)胞團(tuán)，就用較寬口徑的微量吸液管挑取細(xì)胞團(tuán)，用含有Ca2+/Mg2+的PBS培養(yǎng)基洗滌，并轉(zhuǎn)入新鮮的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。
需要確定在這些培養(yǎng)過程中干細(xì)胞是否維持它們的未分化狀態(tài)。可以通過檢查上述干細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特有特征鑒定未分化干細(xì)胞。也可通過檢測細(xì)胞標(biāo)記或測量特異于多能細(xì)胞的基因表達(dá)鑒定所述干細(xì)胞。
特異于多能干細(xì)胞或典型譜系的基因的代表性實(shí)例包括但不限于可用作干細(xì)胞標(biāo)記的堿性磷酸酶、Octamer-4(Oct-4)、SSEA-3和SSEA-4。特異于干細(xì)胞的其它示范性基因包括genesis、GDF-3和cripto。通過用本領(lǐng)域中一種已知方法，包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、分化基因表達(dá)法、微陣列分析等等，可分析這些基因的表達(dá)譜。
優(yōu)選地，可以通過與人多能干細(xì)胞標(biāo)記例如SSEA-4、生殖細(xì)胞腫瘤標(biāo)記-2(GCTM-2)抗原、TRA-1-60等等進(jìn)行免疫反應(yīng)鑒定干細(xì)胞。特別地，干細(xì)胞可表達(dá)作為轉(zhuǎn)錄因子的Oct-4并維持正常的二倍體核型。
可以通過定量測量特異于干細(xì)胞的、分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，或通過用酶聯(lián)免疫吸附測定法分析固定的細(xì)胞制備物而監(jiān)控干細(xì)胞的生長進(jìn)展和它們的分化或未分化狀態(tài)的維持狀況。特異于干細(xì)胞的蛋白質(zhì)的代表性實(shí)例是可溶類型的CD抗原和GCTM-2抗原，并且可以通過檢測細(xì)胞標(biāo)記或測量基因表達(dá)監(jiān)控這些蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，從衍生自核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞系分化神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞，其中通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備所述核移植卵母細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另外方面，提供了用于制備從衍生自核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞系分化的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，其中通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備所述核移植卵母細(xì)胞，所述方法包括步驟(1)培養(yǎng)ES細(xì)胞系以形成胚狀體；(2)在存在適于所述胚狀體的細(xì)胞分化成神經(jīng)祖細(xì)胞的活性物質(zhì)時(shí)培養(yǎng)所述胚狀體；和(3)篩選表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞并培養(yǎng)所篩選的細(xì)胞以獲得神經(jīng)祖細(xì)胞。
以下詳細(xì)描述從ES細(xì)胞系制備神經(jīng)祖細(xì)胞的發(fā)明方法。
步驟A胚狀體的制備將衍生自核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞(稱為“核移植胚胎干細(xì)胞”或“ntES細(xì)胞”)分化成神經(jīng)祖細(xì)胞的第一個(gè)步驟是通過培養(yǎng)所述ES細(xì)胞產(chǎn)生胚狀體。可以通過用本領(lǐng)域中一種已知方法(Zhang等，Nat.Biotechnol.，191129-1133(2001))從ES細(xì)胞制備所述胚狀體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過將培養(yǎng)的ntES細(xì)胞集落轉(zhuǎn)入含有補(bǔ)充了20％血清替代物的DMEM/F12培養(yǎng)基的非附著培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)3至5天獲得胚狀體。一般地，在培養(yǎng)開始后約一天開始出現(xiàn)漂浮的胚狀體(約40至60胚狀體/皿)。這時(shí)，優(yōu)選將所述胚狀體轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)皿，同時(shí)除去任何剩余飼養(yǎng)細(xì)胞。然后，將所述胚狀體置于包被了聚鳥氨酸/層粘連蛋白的附著培養(yǎng)皿中。
步驟B通過一種活性物質(zhì)誘導(dǎo)分化成神經(jīng)祖細(xì)胞本發(fā)明中可以使用的、用于誘導(dǎo)步驟A中得到的胚狀體分化成神經(jīng)祖細(xì)胞的代表性活性物質(zhì)包括但不限于視黃酸；抗壞血酸；煙堿；N-2添加物(100X，17502-048；Gibco，Grand Island，NY，美國)；B-27添加物(50X，17504-044，Gibco，Grand Island，NY，美國)；以及胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉和纖連蛋白的混合物(ITSF)。通過在補(bǔ)充了這些活性物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體并誘導(dǎo)它們的擴(kuò)展和分化，可制備分化自ntES細(xì)胞的神經(jīng)祖細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將步驟A制備的胚狀體另外培養(yǎng)1天，隨即在補(bǔ)充了ITSF，即胰島素(約25μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(約100μg/ml)、亞硒酸鈉(約30nM)和纖連蛋白(約5μg/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)5至10天，從而誘導(dǎo)ntES細(xì)胞分化成神經(jīng)祖細(xì)胞。
步驟C選擇和培養(yǎng)表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞通過在步驟B中得到的分化細(xì)胞中選擇表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記例如巢蛋白的細(xì)胞并且培養(yǎng)它們，可以得到分化自ntES細(xì)胞的神經(jīng)祖細(xì)胞。
另外，可以將得到的神經(jīng)祖細(xì)胞分化成所希望的特定類型的神經(jīng)細(xì)胞。可以通過常規(guī)方法例如化學(xué)誘導(dǎo)等實(shí)現(xiàn)分化成神經(jīng)細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇對神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記呈現(xiàn)陽性信號的細(xì)胞；通過在補(bǔ)充了N-2添加物、層粘連蛋白和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)5至7天誘導(dǎo)所選擇的細(xì)胞的擴(kuò)展；并然后將它們在只補(bǔ)充了N-2添加物和層粘連蛋白的DMEM/F12培養(yǎng)基中另外培養(yǎng)8至14天。
眾所周知ES細(xì)胞能分化成幾乎任何類型的細(xì)胞。因此，本發(fā)明的ES細(xì)胞系可以是提供各種類型細(xì)胞的良好來源。例如，通過在適于細(xì)胞分化的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，ES細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化成造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、β細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞等等。所述的培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域中眾所周知的。
因此，本發(fā)明的ES細(xì)胞系可以具有眾多的治療和診斷用途。特別地，所述的ES細(xì)胞系可用于多種疾病的細(xì)胞移植療法，所述疾病例如糖尿病、帕金森氏癥、阿耳茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、大腦性麻痹和癌癥。另外，衍生自自體核移植卵母細(xì)胞的ES細(xì)胞系可有利地用于細(xì)胞移植療法中，因?yàn)樵谥委熯^程之中和之后不出現(xiàn)免疫排斥副作用。
下列實(shí)施例是用來進(jìn)一步說明本發(fā)明而不是限制其范圍。
除非另外指明，這些實(shí)施例所用的G1.2培養(yǎng)基或G1 ver.3培養(yǎng)基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)補(bǔ)充了5％HSA。
實(shí)施例1卵母細(xì)胞和核供體細(xì)胞的制備通過身體和心理檢查，仔細(xì)篩選志愿的卵母細(xì)胞提供者，并施用卵泡刺激素(FSH)以誘導(dǎo)超數(shù)排卵。
在對提供者施用人絨膜促性腺激素(hGG)后約36小時(shí)，回收卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)并用恒溫箱于37℃、5％CO2和飽和濕度下在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)40分鐘。用0.1％(w/v)透明質(zhì)酸酶(Sigma Co.，St.Louis，MO，美國)將所述的COC處理1小時(shí)，以分散卵丘細(xì)胞。
通過從COC分離所述卵丘細(xì)胞獲得卵母細(xì)胞。通過開口吸液管分離所得到的卵丘細(xì)胞，并用G1.2培養(yǎng)基洗滌。選擇這些形式上的直徑范圍在10至12mm的卵丘細(xì)胞作為核供體細(xì)胞。
實(shí)施例2卵母細(xì)胞的去核和細(xì)胞融合將實(shí)施例1中得到的卵母細(xì)胞之一在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)1至2小時(shí)，以便誘導(dǎo)其細(xì)胞核的成熟。此后，如下述實(shí)施去核、核移植及其電融合。
(2-1)卵母細(xì)胞的去核和來自體細(xì)胞的核移植用G1.2培養(yǎng)基將卵母細(xì)胞洗滌一次。將所述卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入透明質(zhì)酸酶溶液，其通過將1ml G1.2培養(yǎng)基與111μl溶液混合制得，其中0.05g透明質(zhì)酸酶溶解于5ml G1.2培養(yǎng)基中，并調(diào)整透明質(zhì)酸酶濃度至0.1％(w/v)。剝?nèi)ヂ涯讣?xì)胞上的任何殘留的卵丘細(xì)胞，用G1.2培養(yǎng)基洗滌3次并置于相同的培養(yǎng)基中。然后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞松弛素B溶液，其通過將補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS)的G1.2培養(yǎng)基與在二甲基亞砜中溶解細(xì)胞松弛素直至濃度7.5μg/ml的1μl溶液混和而制備。通過顯微操作器切割卵母細(xì)胞的透明帶以形成小孔，并通過從小孔除去含有第一極體的、相當(dāng)于總細(xì)胞質(zhì)的10至15％的細(xì)胞質(zhì)部分使卵母細(xì)胞去核。
圖3顯示通過持定吸液管(holding pipette)(1)和切割吸液管(incision pipette)(2)對卵母細(xì)胞(3)的透明帶的切割處理。圖4顯示從卵母細(xì)胞除去第一極體和細(xì)胞核的去核過程，其中通過位于卵母細(xì)胞下面的持定吸液管(1)持定具有豎直方位開口的卵母細(xì)胞，然后通過切割吸液管(2)輕壓卵母細(xì)胞，以將其去核。用G1.2培養(yǎng)基將所述的去核的卵母細(xì)胞洗滌三次并置于相同的培養(yǎng)基中。
隨后，用持定吸液管和轉(zhuǎn)移吸液管將補(bǔ)充了1％BSA的4μl PBS液滴中的核供體細(xì)胞移植入通過混合400μl G1.2培養(yǎng)基與100μlPHA-P溶液而制備的4μl溶液液滴中的去核卵母細(xì)胞，其中在10mlG1.2培養(yǎng)基中溶解5mg PHA-P制備所述PHA-P溶液。用礦物油包被含有核供體細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞的液滴，以防止液滴的蒸發(fā)。
圖5描述用于將核供體細(xì)胞移植入去核卵母細(xì)胞的過程。如圖5所示，將去核卵母細(xì)胞(3)固定在持定吸液管(1)，通過小孔將轉(zhuǎn)移吸液管(transfer pipette)(4)刺入卵母細(xì)胞(3)，并隨后將核供體細(xì)胞注射入去核的卵母細(xì)胞(3)以獲得核移植卵母細(xì)胞。用G1.2培養(yǎng)基洗滌該核移植卵母細(xì)胞三次，并置于相同的培養(yǎng)基。
(2-2)通過電融合制備核移植卵母細(xì)胞通過BTX-電細(xì)胞操作器(BTX Inc.，San Diego，CA，美國)將核移植卵母細(xì)胞進(jìn)行電融合。
制備20μl甘露醇溶液液滴(其通過將0.1mM MgSO4、0.05％BSA和0.28mM甘露醇溶于0.5mM HEPES緩沖液(pH 7.2)進(jìn)行制備)、20μl含有10μl G1.2培養(yǎng)基和10μl上述甘露醇溶液的混和液滴以及20μlG1.2培養(yǎng)基液滴。
首先，將實(shí)施例(2-1)得到的核移植卵母細(xì)胞在20μl混和溶液液滴中溫育1分鐘。然后，將核移植卵母細(xì)胞通過開口吸液管轉(zhuǎn)入20μl甘露醇溶液液滴并在其中溫育1分鐘。隨后，將核移植卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入具有上述組分的甘露醇溶液，并置于連接BTX電細(xì)胞操作器的兩電極之間，并放在適當(dāng)?shù)奈恢檬沟煤斯w細(xì)胞朝向(+)電極。通過施加間隔1秒的、每次15μs的1kV/cm的兩次直流電，使核移植卵母細(xì)胞電融合。
將融合的核移植卵母細(xì)胞在20μl混和溶液液滴中溫育1分鐘，轉(zhuǎn)入20μl G1.2培養(yǎng)基液滴中并隨后用G1.2培養(yǎng)基洗滌三次。
實(shí)施例3核移植卵母細(xì)胞的重新編程、激活和體外培養(yǎng)由于在實(shí)施例2中得到的核移植卵母細(xì)胞缺乏作為正常胚胎發(fā)育中一個(gè)主要因素的精子介導(dǎo)的激活，因此需要人工刺激代替。因此為確定用于人工胚胎形成的最適條件，根據(jù)如表2至4所示的多種條件重新編程、激活和體外培養(yǎng)核移植卵母細(xì)胞。
首先，為檢查重新編程時(shí)間對胚泡形成率的影響，分別設(shè)定重新編程時(shí)間為約2、4、6和20小時(shí)，同時(shí)如表2所示提供用于激活和體外培養(yǎng)的相同條件。結(jié)果，當(dāng)重新編程時(shí)間約2小時(shí)，可得到最高的胚泡形成率。
表2
*鈣離子載體A23187然后，為尋找胚泡形成的最適激活條件，如表3所示，在G1.2培養(yǎng)基中用鈣離子載體A23187(5或10μM；Sigma Co.，St.Louis，MO，美國)或離子霉素(5或10μM，Sigma Co.，St.Louis，MO，美國)將進(jìn)行了約2小時(shí)重新編程時(shí)間的核移植卵母細(xì)胞處理5分鐘。用G1.2培養(yǎng)基將所述核移植卵母細(xì)胞洗滌幾次，轉(zhuǎn)入含有2.0mM6-DMAP(Sigma Co.，St.Louis，MO，美國)的G1.2培養(yǎng)基，并隨后于37℃、5％CO2、5％O2和90％N2下培養(yǎng)4小時(shí)。在這些激活步驟后，根據(jù)相同條件體外培養(yǎng)該核移植卵母細(xì)胞。如表3所示，當(dāng)用10μM鈣離子載體和2.0mM 6-DMAP連續(xù)處理卵母細(xì)胞，可觀測到最高的胚泡形成率。
表3
*鈣離子載體A23187最后，如下確定最適的體外培養(yǎng)條件用G1.2培養(yǎng)基劇烈洗滌經(jīng)受上述最適重新編程和激活條件的核移植卵母細(xì)胞，并在10μl G1.2培養(yǎng)基或SUNnt-2培養(yǎng)基液滴中于37℃、5％CO2、5％O2和90％N2環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)。所述培養(yǎng)后，將核移植卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入新鮮的SNUnt-2培養(yǎng)基或G2.2培養(yǎng)基并另外培養(yǎng)6天。體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基的代表性實(shí)例是G2.2培養(yǎng)基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)，包含丙氨酸、丙氨酰谷氨酸鹽、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、氯化鈣、泛酸鈣、氯化膽堿、胱氨酸、葉酸、葡萄糖、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、人血清白蛋白、肌醇、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、硫酸鎂、甲硫氨酸、煙堿、青霉素G、苯丙氨酸、氯化鉀、脯氨酸、鹽酸吡哆醛、核黃素、絲氨酸、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、乳酸鈉、丙酮酸鈉、硫胺、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸和水。
如表4所示，當(dāng)先將卵母細(xì)胞在G1.2培養(yǎng)基中并隨后在SNUnt-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可檢測到最高的胚泡形成率。
表4
*鈣離子載體A23187基于以上結(jié)果，通過將卵母細(xì)胞設(shè)定2小時(shí)重新編程、用10μM鈣離子載體和2.0mM 6-DMAP的系列處理進(jìn)行激活、以及在G1.2培養(yǎng)基和SNUnt-2培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，獲得了核移植卵母細(xì)胞的最適胚胎形成。
根據(jù)以上最適條件，對其它66個(gè)核移植卵母細(xì)胞進(jìn)行重新編程、激活和體外培養(yǎng)從而產(chǎn)生19個(gè)胚泡(相當(dāng)于29％)。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)育成胚泡的核移植卵母細(xì)胞的百分比與在牛(約25％)(Kwun等，Mol.Reprod.Dev.，65167-174(2003))和豬(約26％)(Hyun等，Biol.Reprod，691060-1068(2003)；Kuhholzer等，Biol.Reprod，641635-1698(2004))中已建立的SCNT法中所觀察到的百分比相當(dāng)。
實(shí)施例4除去透明帶和滋養(yǎng)層，分離ICM用0.1％鏈霉蛋白酶(Sigma Co.，St.Louis，MO，美國)將實(shí)施例3得到的胚泡處理1分鐘以除去其透明帶。然后，用100％抗人血清抗體(Sigma Co.，St.Louis，MO，美國)處理20分鐘，并在37℃、5％CO2中暴露于10μl豚鼠補(bǔ)體(Life Technologies，Rockville，MD，美國)30分鐘以除去其滋養(yǎng)層并從其分離ICM。
實(shí)施例5培養(yǎng)ICM將實(shí)施例4得到的ICM在包被了0.1％明膠的組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)皿含有用絲裂霉素C失活的原代小鼠(C57BL品種)胚胎成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層(7.5×104細(xì)胞/cm2)。將包含20％血清替代物、0.1mMβ-巰基乙醇、1％NEAAs、2mM谷氨酸鹽、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(Life Technologies，Rockville，MD，美國)和4ng/ml bFGF(Life Technologies，Rockville，MD，美國)用作培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)ICM中的ES細(xì)胞的早期，將培養(yǎng)基補(bǔ)充hLIF(100單位/ml；Chemicon，Temecula，CA，美國)。進(jìn)行培養(yǎng)超過6天直到出現(xiàn)未分化的ntES細(xì)胞集落。在所述集落形成后，每五或七天用微量吸液管從集落機(jī)械分離ntES細(xì)胞。
如此從通過將女性體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備的核移植卵母細(xì)胞中分離的ntES細(xì)胞被稱為“hntES”，并根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約于2003年12月29日保藏在韓國細(xì)胞系研究聯(lián)盟(Korean Cell Line ResearchFoundation，KCLRF；地址首爾國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所，28，Yongon-dong，Chongno-gu，首爾110-744，大韓民國)，保藏號為KCLRF-BP-00092。
試驗(yàn)實(shí)施例1通過核型分析鑒定實(shí)施例5中得到的人ntES細(xì)胞用含有0.1mM Ca2+和0.1mM Mg2+的PBS洗滌實(shí)施例5中得到的未分化ntES細(xì)胞集落，用檸檬酸鹽-丙酮-甲醛(混合體積比是25∶65∶8)于4℃固定1小時(shí)，并用含有0.1mM Ca2+和0.1mM Mg2+的PBS再次洗滌。通過AP試劑盒(Sigma Co.，St.Louis，MO，美國)確定ntES細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。另外，為了鑒定ntES細(xì)胞上的特異表面抗原，通過用購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，美國)的單克隆抗體Oct-4(SC-5279)、購自Developmental Studies Hybridoma Bank(lowa City，IA，美國)的SSEA-1(MC480)、SSEA-3(MC631)和SSEA-4(MC813-70)、以及購自Chemicon(Temecula，CA，美國)的TRA-1-60和TRA-1-80作為一級抗體，來實(shí)施免疫組化分析。通過用含有生物素化二級抗體和親和素-辣根過氧化物酶綴合物的Vectastatin ABC試劑盒(Vector laboratory，Burlingame，CA，美國)檢測所述的一級抗體。
對于基因組DNA和人短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)標(biāo)記，使用STRAMP FLSTR PROFILER試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國)和ABI 310遺傳自動(dòng)分析儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國)實(shí)施DNA指紋分析。結(jié)果如圖6A至6D所示。
如圖6A至6D所示，觀察到從根據(jù)以上實(shí)施例1至5制備的核移植卵母細(xì)胞衍生的ntES細(xì)胞的核型與核供體細(xì)胞的核型相同。該結(jié)果表明本發(fā)明的ntES細(xì)胞已經(jīng)真正地衍生自通過將女性體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞而制備的核移植卵母細(xì)胞而不是衍生自激活的單性生殖的卵母細(xì)胞。
試驗(yàn)實(shí)施例2通過畸胎瘤分析法鑒定人ntES細(xì)胞從培養(yǎng)皿分離實(shí)施例5中得到的未分化ntES細(xì)胞的100個(gè)集落，用1ml注射器注入SCID小鼠(韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所，韓國)的睪丸并培養(yǎng)8周。將由此形成的畸胎瘤進(jìn)行石蠟固定并通過免疫組化分析法進(jìn)行檢測，以檢查是否形成三種真皮細(xì)胞。結(jié)果如圖7所示。
如圖7所示，發(fā)現(xiàn)實(shí)施例5中得到的ntES細(xì)胞在睪丸中形成三種真皮細(xì)胞(軟骨(A)內(nèi)胚層；腸道(B)中胚層；神經(jīng)管(C)外胚層)。該結(jié)果表明所述ntES細(xì)胞是具有分化成各種組織能力的多能ES細(xì)胞。
試驗(yàn)實(shí)施例3通過免疫組化分析檢查胚狀體形成用0.1％胰蛋白酶/1mM EDTA處理實(shí)施例5中得到的人ntES細(xì)胞集落，以分離ntES細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)入塑料培養(yǎng)皿。在缺乏hLIF和bFGF的DMEM/DMEM F12培養(yǎng)基中將人ntES細(xì)胞培養(yǎng)14天。為了石蠟固定，將所述ntES細(xì)胞轉(zhuǎn)入溶解于PBS的1％低融點(diǎn)溫度的瓊脂糖并冷卻至42℃。通過溶解于PBS的4％多聚甲醛固定所得到的含有ntES細(xì)胞的固態(tài)瓊脂糖，并包埋在石蠟中。將每個(gè)石蠟包埋細(xì)胞的6mm切片置于載玻片上并進(jìn)行免疫組化分析。使用購自Zemed(South San Francisco，CA，美國)的α-1-胎蛋白(18-0003)、細(xì)胞角蛋白(18-0234)、結(jié)蛋白(18-0016)、神經(jīng)絲(18-0171)和S-100(18-0046)和購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，美國)的HNF-2-alpha(SC-6556)、BMP-4(SC6896)、Myo D(SC-760)和NCAM(SC-7326)作為一級抗體。生物素化的抗兔、抗小鼠或抗山羊抗體被用作二級抗體，并通過鏈霉親和素綴合的辣根過氧化物酶和二氨基聯(lián)苯胺呈色檢測所述反應(yīng)。結(jié)果如圖8所示。
如圖8所示，根據(jù)實(shí)施例5中得到的ntES細(xì)胞表達(dá)內(nèi)胚層的標(biāo)記蛋白(即，α-1-胎蛋白(A)、細(xì)胞角蛋白(B)和HNF-2-α(C))、中胚層的標(biāo)記蛋白(即，BMP-4(D)、Myo D(E)和結(jié)蛋白(F))和外胚層的標(biāo)記蛋白(即，神經(jīng)絲(G)、S-100(H)和NCAM(I))的事實(shí)，確定所述ntES細(xì)胞可形成胚狀體。該結(jié)果表明本發(fā)明中得到的細(xì)胞落入ES細(xì)胞的范圍內(nèi)。
實(shí)施例6分化成神經(jīng)祖細(xì)胞(6-1)未分化的ES細(xì)胞的擴(kuò)展將實(shí)施例5中得到的人未分化ntES細(xì)胞于37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)在未激活細(xì)胞分裂的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，所述飼養(yǎng)層包含在用2％明膠包被的培養(yǎng)平板中。該培養(yǎng)基由DMEM/F12(1∶1)、20％敲除(knock-out)血清替代物、0.1mM NEAA、0.1mM β-巰基乙醇、1mM L-谷氨酸鹽、100U/ml青霉素G、100μg/ml鏈霉素和4ng/mlbFGF組成；并每日更換。
(6-2)胚狀體的形成收集以上培養(yǎng)的ntES細(xì)胞集落并于37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)在非附著培養(yǎng)皿上。除其中省去4ng/ml bFGF之外，該培養(yǎng)基與實(shí)施例(6-1)中的相同。一天后，所述集落開始長成漂浮的胚狀體(約50胚狀體/皿)。此時(shí)，將胚狀體轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)皿，同時(shí)完全除去任何剩余的飼養(yǎng)細(xì)胞。在另外培養(yǎng)4天后，將由此形成的胚狀體置于包被了聚鳥氨酸/層粘連蛋白的附著皿上。
(6-3)選擇巢蛋白陽性細(xì)胞在附著皿上培養(yǎng)1天后，將處于分化過程中的胚狀體轉(zhuǎn)入補(bǔ)充了胰島素(25μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(100μg/ml)、亞硒酸鈉(30nM)和纖連蛋白(5μg/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基，并于37℃培養(yǎng)6天。將得到的細(xì)胞在用含0.01M PBS、1％BSA和5mM EDTA的溶液將抗巢蛋白抗體(Chemicon，Temecula，CA，美國)稀釋了1000倍的溶液中于37℃培養(yǎng)40分鐘。用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌所述細(xì)胞，用藻紅蛋白(PE)綴合的二級抗體(Chemicon，Temecula，CA，美國)處理30分鐘，并然后用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌三次，從而選擇巢蛋白陽性細(xì)胞。
(6-4)巢蛋白陽性細(xì)胞的擴(kuò)展將實(shí)施例(6-3)中選擇的巢蛋白陽性細(xì)胞在補(bǔ)充了N-2添加物、層粘連蛋白(1ng/ml)和bFGF(10ng/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)6天以擴(kuò)展這些細(xì)胞。
(6-5)分化成神經(jīng)祖細(xì)胞將實(shí)施例(6-4)中擴(kuò)展的巢蛋白陽性細(xì)胞在補(bǔ)充了N-2添加物、層粘連蛋白(1ng/ml)但缺乏bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)10天以誘導(dǎo)它們分化成神經(jīng)祖細(xì)胞。
圖2顯示從核移植卵母細(xì)胞分化的神經(jīng)祖細(xì)胞，其中通過將女性體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備所述核移植卵母細(xì)胞。
當(dāng)就以上具體實(shí)施方案描述本發(fā)明時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明進(jìn)行各種修飾和改動(dòng)，這也落入所附權(quán)利要求所限定的本涉及微生物或其它生物材料的保藏證明國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約國際表格原始保藏的接受按照細(xì)則7.1公布收件人黃禹錫首爾國立大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院San 56-1，Shillim-dong，Gwanak-gu，首爾151-742，韓國
表格BP/4(KCLRF表格17)單頁
權(quán)利要求
1.一種從通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備的核移植卵母細(xì)胞衍生的胚胎干細(xì)胞系。
2.權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞系，其是保藏號為KCLRF-BP-00092的細(xì)胞系。
3.一種制備胚胎干細(xì)胞系的方法，包括步驟(1)培養(yǎng)人體細(xì)胞以制備核供體細(xì)胞；(2)將人卵母細(xì)胞去核以制備受體卵母細(xì)胞；(3)通過將所述核供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入所述受體卵母細(xì)胞并使核供體細(xì)胞的細(xì)胞核與受體卵母細(xì)胞融合來制備核移植卵母細(xì)胞；(4)將所述核移植卵母細(xì)胞進(jìn)行重新編程、激活和體外培養(yǎng)以形成胚泡；和(5)從所述胚泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并在未分化狀態(tài)培養(yǎng)所述內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以建立胚胎干細(xì)胞系。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞系是保藏號為KCLRF-BP-00092的細(xì)胞系。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(4)的重新編程進(jìn)行多至20小時(shí)的時(shí)間。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(4)的重新編程進(jìn)行多至6小時(shí)的時(shí)間。
7.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(4)的重新編程進(jìn)行多至3小時(shí)的時(shí)間。
8.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(4)的重新編程進(jìn)行約2小時(shí)的時(shí)間。
9.權(quán)利要求3所述的方法，其中通過用鈣離子載體并隨后用6-二甲基氨基嘌呤處理核移植卵母細(xì)胞來實(shí)施步驟(4)中的激活。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述鈣離子載體的濃度范圍是5μM到15μM。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述鈣離子載體的濃度是約10μM。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述6-二甲基氨基嘌呤的濃度范圍是1.5mM到2.5mM。
13.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述6-二甲基氨基嘌呤的濃度是約2.0mM。
14.權(quán)利要求3所述的方法，其中通過連續(xù)使用至少兩種彼此具有不同組成的培養(yǎng)基實(shí)施步驟(4)中的體外培養(yǎng)。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中通過連續(xù)使用兩種彼此具有不同組成的培養(yǎng)基實(shí)施體外培養(yǎng)。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中通過連續(xù)使用G1.2培養(yǎng)基和SNUnt-2培養(yǎng)基實(shí)施體外培養(yǎng)。
17.權(quán)利要求3所述的方法，其中通過對核移植卵母細(xì)胞進(jìn)行多至20小時(shí)的重新編程、用濃度范圍5μM至15μM的離子載體并隨后用濃度范圍1.5mM至2.5mM的6-二甲基氨基嘌呤處理、以及在G1.2培養(yǎng)基和SNUnt-2培養(yǎng)基中連續(xù)體外培養(yǎng)核移植卵母細(xì)胞實(shí)施步驟(4)。
18.權(quán)利要求3所述的方法，其中通過包括以下步驟的過程從步驟(5)中的胚泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(1)從胚泡除去透明帶或其部分；和(2)通過從得到的胚泡除去滋養(yǎng)層分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。
19.權(quán)利要求3所述的方法，其中在步驟(5)中將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在包含從權(quán)利要求1所述胚胎干細(xì)胞系分化的細(xì)胞的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。
20.一種從衍生自核移植卵母細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞系所分化的神經(jīng)祖細(xì)胞，其中通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞而制備所述核移植卵母細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20所述的神經(jīng)祖細(xì)胞，其中所述胚胎干細(xì)胞系是保藏號為KCLRF-BP-00092的細(xì)胞系。
22.一種制備權(quán)利要求20所述的神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括步驟(1)培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞系以形成胚狀體；(2)在存在適于所述胚狀體的細(xì)胞分化成神經(jīng)祖細(xì)胞的活性物質(zhì)時(shí)培養(yǎng)所述胚狀體；和(3)選擇表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞并培養(yǎng)選擇的細(xì)胞以獲得所述神經(jīng)祖細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是保藏號為KCLRF-BP-00092的細(xì)胞系。
24.權(quán)利要求22所述的方法，其中步驟(2)中使用的活性物質(zhì)選自視黃酸、抗壞血酸、煙堿、N-2添加物、B-27添加物、以及胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉和纖連蛋白的混合物。
25.一種用于實(shí)施權(quán)利要求3所述的步驟(4)中的體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包含95至110mM NaCl、7.0至7.5mM KCl、20至30mM NaHCO3、1.0至1.5mM NaH2PO4、3至8mM乳酸鈉、1.5至2.0mM CaCl2·2H2O、0.3至0.8mM MgCl2·6H2O、0.2至0.4mM丙酮酸鈉、1.2至1.7mM果糖、6至10mg/ml人血清白蛋白、0.7至0.8μg/ml卡那霉素、1.5至3％必需氨基酸、0.5至1.5％非必需氨基酸、0.7至1.2mM L-谷氨酸鹽，以及0.3至0.7％的胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉的混合物。
26.權(quán)利要求25所述的培養(yǎng)基，其包含99.1至116mM NaCl、7.2mM KCl、25mM NaHCO3、1.2mM NaH2PO4、5mM乳酸鈉、1.7mMCaCl2·2H2O、0.5mM MgCl2·6H2O、0.3mM丙酮酸鈉、1.5mM果糖、8mg/ml人血清白蛋白、0.75μg/ml卡那霉素、2％必需氨基酸、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酸鹽，以及0.5％的胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉的混合物。
全文摘要
一種從通過將人體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞制備的核移植卵母細(xì)胞上衍生的胚胎干細(xì)胞系，可分化成各種希望的細(xì)胞類型。
文檔編號C12N5/02GK1922307SQ200480039480
公開日2007年2月28日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者盧圣一, 黃禹錫, 李柄千, 姜成根, 劉英俊, 李有振, 金淳雄, 權(quán)大基, 權(quán)喜善, 古子敏, 樸乙淳, 黃尹英, 文信容, 吳善京, 安圭里, 尹賢洙, 樸鐘爀, 金順鐘, 崔陽圭 申請人:財(cái)團(tuán)法人 首爾大學(xué)校 產(chǎn)學(xué)協(xié)力財(cái)團(tuán)