專利名稱：一種在小鼠胚胎細(xì)胞中基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用類轉(zhuǎn)錄激活子核酸酶快速基因編輯的方法，具體涉及一種在小鼠細(xì)胞中基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃的完成，后基因組時(shí)代的生物研究迫切需要有效的手段來(lái)進(jìn)行基因功能的分析。由于生理和遺傳層面同人類較高的一致性，基因敲除小鼠模型成為了破譯人類基因功能及尋找人類疾病治療手段的有力工具?；虼虬屑夹g(shù)是構(gòu)建基因敲除小鼠的主要傳統(tǒng)手段?；虼虬芯褪峭ㄟ^同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某 一基因?yàn)槟康牡囊豁?xiàng)技術(shù)。傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)的限制因素之一是周期長(zhǎng)且難度大的打靶載體構(gòu)建過程。其次，由于動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)自發(fā)的同源重組發(fā)生率只有10_5-10_6，將打靶載體電轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞之后，要花費(fèi)大量時(shí)間和人力物力篩選發(fā)生目的同源重組的胚胎干細(xì)胞。而且ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中對(duì)培養(yǎng)條件要求苛刻，稍有不慎將會(huì)引起其不可逆的分化，而使其失去生殖系轉(zhuǎn)移能力，不能在后續(xù)操作中產(chǎn)生突變子代。再次，顯微注射的ES細(xì)胞僅有一定的概率成功整合成為能夠形成配子的生殖系細(xì)胞。并且要求ES細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)及未分化的狀態(tài)。另外，如果已有現(xiàn)成的目的基因被靶向的ES細(xì)胞，但與欲研究的小鼠品系不同，則將需要花費(fèi)大量的時(shí)間進(jìn)行回交，以稀釋ES細(xì)胞原有的遺傳背景。人工鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFN)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)基因組定點(diǎn)修飾的技術(shù)。ZFN是一種由靶向特定DNA序列的鋅指蛋白和具有非特異性作用的FokI核酸內(nèi)切酶切割結(jié)構(gòu)域組成的重組蛋白。一對(duì)人工設(shè)計(jì)的，識(shí)別特定的DNA序列的ZFN與目標(biāo)DNA序列(通常為相鄰兩段各18-24bp，間隔4_7bp)結(jié)合之后，它們的FokI核酸內(nèi)切酶將形成二聚體，從而切割DNA雙鏈,形成雙鏈斷裂(double strand break, DSB)。該損傷主要通過易錯(cuò)性的非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)以及高保真性的同源重組(homologous recombination,HR)進(jìn)行修復(fù)。其中非同源末端連接通過造成目的基因的移碼，可被用來(lái)對(duì)目的基因進(jìn)行基因敲除。通過在受精卵階段顯微注射編碼ZFN的DNA或相應(yīng)mRNA，已實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠，大鼠，斑馬魚等模式生物的基因敲除。盡管ZFN技術(shù)在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域有著廣闊的前景，然而根據(jù)需要構(gòu)建對(duì)特定DNA序列有高度特異性和親和力的ZFN是一項(xiàng)勞動(dòng)量大，周期長(zhǎng)，成功率低的工作，這已經(jīng)成為阻礙該ZFN大規(guī)模應(yīng)用的瓶頸。ZFN的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域由若干個(gè)鋅指模塊組成，每個(gè)鋅指模塊識(shí)別特定的3個(gè)連續(xù)堿基，因此相鄰的3 6個(gè)鋅指模塊可識(shí)別DNA上連續(xù)的9 ISbp個(gè)堿基。這種三連體識(shí)別模式意味著在可供靶向的DNA序列選擇上有更小的靈活性。盡管已有數(shù)百種鋅指模塊，但是并沒有涵蓋所有可能的堿基排列組合。同時(shí)由于相鄰鋅指模塊間的相互作用會(huì)影響其堿基識(shí)別的特異性(context dependence),因此ZF在構(gòu)建過程中要經(jīng)過大量的優(yōu)化才能實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的特異性結(jié)合。另外由于ZF相對(duì)較低的DNA結(jié)合特異性，ZFN在細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)會(huì)由于脫靶效應(yīng)(Off Target Effect)造成較高的細(xì)胞毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的克服現(xiàn)有技術(shù)在構(gòu)建基因敲除小鼠技術(shù)中存在的周期長(zhǎng)，工作量大，難度高，效率低等不足，提供了通過在小鼠受精卵顯微注射體外轉(zhuǎn)錄的靶向目標(biāo)基因的TALEN信使RNA，實(shí)現(xiàn)快速構(gòu)建基因敲除小鼠的方法。本發(fā)明涉及一種利用類轉(zhuǎn)錄激活子核酸酶快速構(gòu)建靶向性基因組DNA改變的基因修飾小鼠的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種在小鼠胚胎細(xì)胞中基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法，通過在小鼠胚胎細(xì)胞中引入特定核算序列構(gòu)建基因定點(diǎn)突變小鼠，包括以下步驟(I)在小鼠目標(biāo)基因組序列中確定目標(biāo)靶序列；
·
(2)按所述目標(biāo)靶序列的順序，構(gòu)建能夠識(shí)別并切割目標(biāo)基因的TALEN核酸序列；(3)將所述TALEN核酸序列導(dǎo)入小鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)；所獲得的小鼠胚胎細(xì)胞用于體外培養(yǎng)或直接植入母鼠，表達(dá)TALEN并切割目標(biāo)基因組，從而篩選目標(biāo)基因突變的小鼠。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明方法省略了體外進(jìn)行ES細(xì)胞篩選的過程，整個(gè)操作過程只需直接將核酸導(dǎo)入胚胎中，不需要將ES細(xì)胞引入胚胎，避免了因ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)因培養(yǎng)條件不符合要求時(shí)導(dǎo)致的不可逆分化。其中，所述小鼠目標(biāo)基因組序列包括編碼基因的基因組序列、低度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列、高度重復(fù)序列、低拷貝序列、基因間的轉(zhuǎn)錄活躍序列或非轉(zhuǎn)錄序列。其中，所述小鼠胚胎細(xì)胞包括小鼠單細(xì)胞受精卵或多細(xì)胞小鼠胚胎。其中，所述步驟(3)是將所述TALEN核酸序列在體外轉(zhuǎn)錄為mRNA并純化后，通過顯微注射導(dǎo)入小鼠胚胎細(xì)胞。所述TALEN核酸序列可以通過質(zhì)粒構(gòu)建、人工合成等方法獲得。其中，所述步驟(3)中，切割目標(biāo)基因組所形成的DNA斷裂位點(diǎn)通過非同源末端連接修復(fù)或通過同源重組修復(fù)。其中，所述目標(biāo)基因突變包括堿基插入、缺失、改變、移碼突變或敲除。其中，所述目標(biāo)基因突變的小鼠是指通過選取目標(biāo)基因發(fā)生突變的小鼠與野生型小鼠雜交，再選取上述雜交所得的同窩雜合子小鼠進(jìn)行自交，然后從上述所得新生小鼠中篩選目標(biāo)基因突變的純合子小鼠。本發(fā)明還提供一種小鼠胚胎細(xì)胞，所述細(xì)胞是按權(quán)利要求1-7所述方法制備獲得。本發(fā)明還提供一種純合子小鼠，是含有按權(quán)利要求1-7所述方法制備獲得的小鼠胚胎細(xì)胞。即，將按權(quán)利要求1-7所述方法制備獲得的小鼠胚胎細(xì)胞用于體外培養(yǎng)或直接植入母鼠，表達(dá)TALEN并切割目標(biāo)基因組，篩選獲得目標(biāo)基因突變的小鼠；再將其與野生型小鼠雜交，再選取上述雜交所得的同窩雜合子小鼠進(jìn)行自交，然后從上述所得新生小鼠中篩選目標(biāo)基因突變的純合子小鼠。本發(fā)明米用類轉(zhuǎn)錄激活子核酸酶(Transcription Activator-Like EffectorNuclease, TALEN)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因序列的特異性切割。TALEN由TAL effectors及其融合的FokI核酸酶組成。其中，TALE(TAL effectors)是由12個(gè)或以上特異性識(shí)別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”及其兩側(cè)的N-末端與C-末端序列組成。TAL effectors的DNA識(shí)別模塊由34個(gè)氨基酸組成，每個(gè)TAL effectors的DNA識(shí)別模塊與DNA結(jié)合的特異性是由第12位和第13位氨基酸殘基決定的，被稱作重復(fù)可變的di-residues (RVDs)位點(diǎn)。RVDs與A、G、C、T四種堿基有著恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G。因此，欲使TALeffectors識(shí)別并結(jié)合某一特定核酸序列，只須將TAL effectors的DNA識(shí)別模塊按照目標(biāo)DNA序列串聯(lián)克隆即可。在實(shí)際操作中一般在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰(間隔15 20個(gè)堿基)的祀序列(一般十幾個(gè)堿基)分別進(jìn)行TAL effectors識(shí)別模塊的構(gòu)建。所構(gòu)建的TALEN在細(xì)胞內(nèi)識(shí)別并切割特定的目標(biāo)基因序列,形成雙鏈斷裂(double strand break,DSB) ο該損傷通過易錯(cuò)性的非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)進(jìn)行修復(fù)后，將有2/3的概率造成目的基因的移碼，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的敲除。另外，可通過在TALEN對(duì)基因組產(chǎn)生切割的細(xì)胞(或胚胎)中引入兩端帶有同源臂中間包含外源核酸序列的DNA片段，使斷裂的基因組DNA以外源DNA片段為模板進(jìn)行同源修復(fù)，這樣使得在對(duì)目的基因進(jìn)行敲除的同時(shí)，將所需的核酸序列引入目的基因的基因組中，形成定點(diǎn)敲入(Knockin)的細(xì)胞(或胚胎)。
本發(fā)明在小鼠胚胎中基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法，例如，在小鼠胚胎中實(shí)施基因敲除方法，包括步驟如下(I)在目標(biāo)小鼠基因N端編碼序列中尋找合適的靶序列。(2)按照上述靶序列的順序，組裝相應(yīng)的TALEN識(shí)別模塊，然后連入TALEN表達(dá)質(zhì)粒。(3)將上述質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄成mRNA,并進(jìn)行純化。(4)將上述體外轉(zhuǎn)錄的mRNA顯微注射入人工受精形成的小鼠受精卵。(5)將上述受精卵植入假孕母鼠輸卵管內(nèi)。(6)提取上述步驟所得子代小鼠的基因組DNA進(jìn)行基因型鑒定。(7)將目標(biāo)基因發(fā)生移碼突變的小鼠分別與野生型小鼠雜交。(8)將上述雜交所得同窩的雜合子小鼠進(jìn)行自交。(9)鑒定上述自交所得小鼠的基因型，篩選目標(biāo)基因移碼突變的純合子小鼠。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括與現(xiàn)有技術(shù)ZFN介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)相比，本發(fā)明采用的TALEN的DNA識(shí)別模塊與單個(gè)堿基有著明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，模塊的排列組合方式不影響彼此的DNA識(shí)別與結(jié)合能力，從而成功解決了常規(guī)ZFN方法不能識(shí)別任意目標(biāo)DNA序列，以及識(shí)別特性經(jīng)常受上下游序列影響的問題，使得本發(fā)明在TALEN的串聯(lián)DNA識(shí)別模塊的構(gòu)建過程中免去了 ZFN構(gòu)建過程中相應(yīng)的復(fù)雜而昂貴的優(yōu)化篩選過程。本發(fā)明很大程度上降低了 TALEN的構(gòu)建成本，便于普通實(shí)驗(yàn)室能夠自己構(gòu)建靶向目基因的TALEN。此外，因TALeffectors的堿基識(shí)別特異性，使TALEN在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出更低的毒性。與傳統(tǒng)的在小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)通過同源重組對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行敲除或改變相比，本發(fā)明避免周期長(zhǎng)且難度大的打靶載體構(gòu)建過程。其次，本發(fā)明中的顯微注射TALEN信使RNA所得子代小鼠，如實(shí)施例所述，其中一條等位基因發(fā)生堿基缺失的概率高達(dá)80%，優(yōu)選地，通過進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和提高實(shí)驗(yàn)技能，突變率可達(dá)到90%以上。而現(xiàn)有技術(shù)及文獻(xiàn)表明，通過小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)同源重組及后繼篩選，發(fā)生定點(diǎn)敲除的概率不超過10%。篩選出的ES細(xì)胞還需經(jīng)過胚胎顯微注射而產(chǎn)生嵌合體小鼠。嵌合體小鼠如果發(fā)生生殖系轉(zhuǎn)移(germline transmission)才有可能得到特定基因敲除的雜合子小鼠。而由于ES細(xì)胞在篩選過程中培養(yǎng)條件的變化而發(fā)生不可逆的分化，很可能突變的ES細(xì)胞分化的子代細(xì)胞不能進(jìn)入生殖系而得不到敲除小鼠。本發(fā)明通過注射單細(xì)胞期的胚胎，不存在ES細(xì)胞分化的問題，因此通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)是一般能夠得到基因敲除的小鼠品系。本發(fā)明通過注射較高濃度的TALEN信使RNA實(shí)現(xiàn)了很高的突變效率，這在節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間以及人力物力的投入方面有很大的意義。而且，這種高突變效率也將有助于該技術(shù)在產(chǎn)卵較少、生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)且單個(gè)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的大型動(dòng)物中的應(yīng)用。再次，本發(fā)明直接向人工受精的小鼠受精卵中顯微注射TALEN信使RNA，避免了周期長(zhǎng)、勞動(dòng)量大、篩選發(fā)生目的同源重組小鼠胚胎干細(xì)胞的過程。另外，本發(fā)明中構(gòu)建TALEN質(zhì)粒的環(huán)節(jié)只需要I 3周，從顯 微注射到鑒定出目標(biāo)基因發(fā)生移碼的雜合子小鼠只需要I個(gè)月左右，而傳統(tǒng)的通過在小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組構(gòu)建基因敲除小鼠的周期通常需要至少一年的時(shí)間。本發(fā)明方法極大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，有利于研究的聞效推進(jìn)。本發(fā)明通過在小鼠胚胎中進(jìn)行靶向任意基因組DNA并使其發(fā)生改變從而快速構(gòu)建基因敲除小鼠方法，通過向小鼠受精卵中直接引入識(shí)別并切割目標(biāo)基因的類轉(zhuǎn)錄激活子且含有核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN)的編碼 DNA、mRNA、各種人工病毒顆?；虻鞍祝ㄟ^DNA雙鏈斷裂(double strand break, DSB)以及由此引起的非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)修復(fù)來(lái)造成目標(biāo)基因的移碼，從而獲得目標(biāo)基因敲除的FO代雜合子或純合子小鼠。本發(fā)明克服了通過向小鼠受精卵注射人工鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFN)不能識(shí)別任意目標(biāo)DNA序列，且識(shí)別特性經(jīng)常受上下游序列影響的問題，以及由此帶來(lái)的ZFN構(gòu)建過程中復(fù)雜而昂貴的優(yōu)化篩選過程。與傳統(tǒng)的通過在小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)用同源重組打靶載體對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行敲除相t匕，本發(fā)明具有無(wú)需構(gòu)建同源重組打靶載體、無(wú)需進(jìn)行ES打靶細(xì)胞篩選，突變體比例高，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)成本和周期大大減少等優(yōu)點(diǎn)。


圖I為一個(gè)典型的人工TALEN蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為攜帶識(shí)別四種不同堿基的單個(gè)重復(fù)單元的載體示意圖。
圖3為構(gòu)建識(shí)別二連核苷酸(AT)的雙單元載體的示意圖。圖4為以雙單元載體為起始材料，通過3輪酶切連接反應(yīng)組裝其中一側(cè)TALE重復(fù)模塊過程的示意圖。圖5為最終TALEN表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。圖6為顯微注射Lpr-TALEN所得新生小鼠所對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物T7E1酶切電泳圖。圖7為顯微注射L印r-TALEN所得新生小鼠堿基缺失情況示意圖。圖8為顯微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠所對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物T7E1酶切電泳圖。圖9為顯微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠堿基缺失情況示意圖。圖10為Paklipl同源重組打靶載體示意圖。
具體實(shí)施例方式結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。如按照Sambrook等人,分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)所記載人,或按照廠商的建議條件。本發(fā)明在小鼠胚胎細(xì)胞中基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法，是一種進(jìn)行靶向任意基因組DNA并使其發(fā)生改變的方法，該方法包括向小鼠細(xì)胞中引入識(shí)別并切割目標(biāo)基因的類轉(zhuǎn)錄激活子核酸酶(TALEN)的編碼核酸、蛋白或人工修飾的病毒等生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)最終通過轉(zhuǎn)變成為能夠識(shí)別特異DNA序列并具有對(duì)識(shí)別序列附近的DNA分子進(jìn)行切割的蛋白質(zhì)分子。然后，將細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)或者直接將其轉(zhuǎn)入適宜的母鼠輸卵管或者子宮中，使類轉(zhuǎn)錄激活子核酸酶表達(dá)并使得在切割位點(diǎn)附近的目標(biāo)基因組DNA發(fā)生雙聯(lián)斷裂，接著對(duì)該DNA斷裂位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)。其中，修復(fù)方式包括·(a)非同源末端連接修復(fù)。非同源末端連接修復(fù)導(dǎo)致基因突變(堿基插入、缺失)被引入到目的基因組序列中。(b)同源重組修復(fù)。同源重組修復(fù)使供體外源DNA序列引入到目標(biāo)基因組DNA序列中，導(dǎo)致內(nèi)源目標(biāo)基因序列的改變。本發(fā)明中，小鼠細(xì)胞是小鼠胚胎細(xì)胞。小鼠胚胎包括小鼠單細(xì)胞受精卵或多細(xì)胞小鼠胚胎。本發(fā)明在小鼠胚胎細(xì)胞中基因定位突變的構(gòu)建方法，包括基因突變或基因敲除，其步驟包括(I)在小鼠目標(biāo)基因組序列中尋找合適的靶序列。(2)按照上述靶位點(diǎn)的堿基序列，構(gòu)建相應(yīng)的TALEN質(zhì)粒/核酸序列。(3)將上述TALEN質(zhì)粒DNA或其相應(yīng)mRNA或相應(yīng)蛋白質(zhì)序列或相應(yīng)人工病毒顆粒導(dǎo)入小鼠細(xì)胞。(4)將上述細(xì)胞植入適宜的母鼠輸卵管或者子宮內(nèi)。(6)提取上述步驟所得新生小鼠的基因組DNA進(jìn)行鑒定。(7)選取目標(biāo)基因發(fā)生移碼突變或敲除的小鼠與野生型小鼠雜交。(8)選取上述雜交所得的同窩雜合子小鼠進(jìn)行自交。(9)提取上述步驟所得新生小鼠的基因組DNA，篩選目標(biāo)基因發(fā)生移碼突變或敲除的純合子小鼠。所述小鼠目標(biāo)基因組序列為編碼基因的基因組序列、低度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列、高度重復(fù)序列、低拷貝序列、基因間的轉(zhuǎn)錄活躍序列或非轉(zhuǎn)錄序列。實(shí)施例I在小鼠細(xì)胞中Lpr基因敲除的構(gòu)建
I、TALE靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，即確定目標(biāo)靶序列以L印r基因?yàn)楸緦?shí)施例中的小鼠目標(biāo)基因組序列。登陸網(wǎng)頁(yè)TAL EffectorNucleotide Targeter 2.O (https://boglab. pip. iastate. edu/node/add/talen-old),按照操作說(shuō)明，將目的基因L印r的第三個(gè)外顯子(由于未能在L印r的第一二個(gè)外顯子中找到滿足條件的靶位點(diǎn))序列粘貼入相應(yīng)文本框，勾選有關(guān)參數(shù)的選擇框。設(shè)定擬被TALE模塊識(shí)別的堿基數(shù)量Otepeat Array Length)范圍，優(yōu)選地，本實(shí)施例中設(shè)定為15-20 ;設(shè)定間隔區(qū)域(Spacer)堿基數(shù)量，優(yōu)選地，本實(shí)施例中設(shè)定為15_20。經(jīng)篩選得到了若干候選革巴位點(diǎn)。進(jìn)一步地，本實(shí)施例選擇的祀位點(diǎn)序列(SEQ ID NO. I)如以下所示LeftGCACTTAACCTGGCATAT|CCAATCTCTCCCTGGAA|ATTTAAGTTGTTTTGTGGCGTGAATTGGACCGTATA|GGTTAGAGAGGGACCTT|TAAATTCAACAAAACACCRight本實(shí)施例中，由于所用的TALEN質(zhì)粒系統(tǒng)中位于TALE結(jié)合位點(diǎn)3’端用來(lái)識(shí)別堿基T的最后O. 5個(gè)TALE模塊已經(jīng)被預(yù)先整合進(jìn)pCS2_FokI載體，因此，勾選選項(xiàng)“Requirea T atposition N”,從而使候選序列TALE結(jié)合位點(diǎn)3’端均為T。 2、TALE模塊的組裝，即構(gòu)建能夠識(shí)別并切割目標(biāo)基因的TALEN質(zhì)粒根據(jù)上述靶位點(diǎn)序列進(jìn)行TALE模塊組裝。如圖I所示的一個(gè)典型的人工TALEN蛋白的結(jié)構(gòu)，位于中部的是重復(fù)的DNA結(jié)合模塊，其左側(cè)和右側(cè)分別是來(lái)自TALE氮端的136個(gè)氨基酸和來(lái)自TALE碳端的63個(gè)氨基酸，更右側(cè)的是FokI核酸酶的切割結(jié)構(gòu)域。一個(gè)典型的天然存在的重復(fù)單元是由34個(gè)氨基酸組成，其中第12和第13位是決定DNA結(jié)合的特異性重復(fù)可變的di-residues (RVDs)位點(diǎn)。優(yōu)選地，本實(shí)施例中使用的質(zhì)粒系統(tǒng)采用了一種“替代重復(fù)單元”，使得在不影響蛋白編碼的情況下“替代重復(fù)單元”的兩端分別有SpeI和NheI這兩個(gè)同尾酶酶切位點(diǎn)。該同尾酶體系使得通過重復(fù)的酶切以及連接反應(yīng)進(jìn)行TALE模塊的構(gòu)建成為可能。模塊組裝的起始材料為攜帶識(shí)別單個(gè)堿基的TALE模塊的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒是在PMD18-T (TAKARA)的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。四個(gè)攜帶識(shí)別單個(gè)堿基的TALE模塊質(zhì)粒分別被命名為PA，pT，pC，pG，其相應(yīng)編碼的重復(fù)可變二連氨基酸分別是NI，NG, HD和NN，如圖2所示的攜帶識(shí)別四種不同堿基的單個(gè)重復(fù)單元的載體示意圖。每個(gè)載體分別攜帶一個(gè)單個(gè)替代TALE單元，后者分別帶有編碼NI，NG, NN, HD的RVD，從而分別識(shí)別堿基A，T，G，C。 靶向目標(biāo)DNA序列的TALE模塊可以通過一系列使用Nhel+HindlII以及Spel+HindHI的酶切-鏈接反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行構(gòu)建。圖3所示為一個(gè)通過使用同尾的限制性內(nèi)切酶NheI和SpeI，以及另外一個(gè)內(nèi)切酶HindIII，將兩個(gè)單個(gè)單元載體(A，T)通過一輪酶切連接反應(yīng)構(gòu)建成識(shí)別二連核苷酸(AT)的雙單元載體的示例，其中S，N, H分別代表Spel，NheI以及Hindlll。以在識(shí)別單個(gè)堿基的TALE模塊質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建識(shí)別5’ -AT-3’雙堿基的TALE重復(fù)模塊為例說(shuō)明了 TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建過程(I)用Nhel+Hindlll雙酶切pA載體，37°C反應(yīng)2小時(shí)。切膠回收含有TALE模塊的線性化載體(此處為2. 8kb)。(2)用Spel+Hindlll雙酶切pT載體，37°C反應(yīng)2小時(shí)。切膠回收含有TALE模塊的DNA片段(此處為102bp)。(3)使用T4Ligase對(duì)步驟(I)和⑵中回收的DNA片段和載體進(jìn)行連接，16°C連接2小時(shí)。(4)將步驟(3)中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 α或類似的感受態(tài)，涂于氨芐抗性LB平板，放入37 °C恒溫培養(yǎng)箱過夜。
(5)挑取步驟(4)中的克隆進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，用Spel+Hindlll進(jìn)行酶切，用2%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳。釋放的DNA片段大小約為204bp(102bpX2)的，即為陽(yáng)性克隆。(6)重復(fù)步驟(I) (4)中的方法繼續(xù)TALE模塊的組裝。最終得到的包含全部所需TALE模塊的質(zhì)粒pMD-TALE。按上述方法構(gòu)建的4種堿基任意兩兩組合可得到16個(gè)質(zhì)粒，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行組裝能夠有效縮短所需要的時(shí)間。圖4為以雙單元載體為起始材料，通過3輪酶切連接反應(yīng)組裝其中一側(cè)TALE重復(fù)模塊過程的示意圖。通過pMD18-T載體上多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的測(cè)序引物(M13-47和RV-M)從兩個(gè)方向?qū)MD-TALE載體進(jìn)行測(cè)序，以確認(rèn)TALE模塊拼接無(wú)誤。
用NheI酶切pCS2_FokI載體，其中用來(lái)結(jié)合左側(cè)和右側(cè)TALE模塊的分別被命名為pCS2-PEAS和pCS2-PERR，并對(duì)其進(jìn)行去磷酸化以防止其發(fā)生自連。其中pCS2_PEAS經(jīng)過了 E484A，R487S點(diǎn)突變改造，pCS2_PERR進(jìn)行了 D483R點(diǎn)突變改造，從而使兩者只能形成異源二聚體，而不能形成同源二聚體，以此提高對(duì)靶位點(diǎn)識(shí)別的特異性，降低非特異性識(shí)別造成的脫靶效應(yīng)。如圖5所示的最終TALEN表達(dá)載體的構(gòu)建，即，用Spel+Nhel雙酶切pMD-TALE質(zhì)粒，將所釋放片段連入已用NheI線性化并去磷酸化的pCS2-FokI載體，其中左右兩個(gè)TALE分別連入PCS2-PEAS和pCS2-ERR。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌，涂于氨芐抗性LB平板，37 °C培養(yǎng)過夜，并挑取克隆。通過使用SP6引物進(jìn)行測(cè)序確定TALE模塊在pCS2_TALEN載體中的插入方向。3、體外轉(zhuǎn)錄TALEN mRNA并進(jìn)行顯微注射取相同摩爾數(shù)(質(zhì)量，如果TALE模塊數(shù)相等的話)的上述步驟中TALE模塊插入方向正確的PCS2-PEAS和pCS2-ERR質(zhì)粒，進(jìn)行混合，通過TALEN編碼區(qū)下游的NotI位點(diǎn)進(jìn)行線性化，使用SP6 mMESSAGE mMACHINE Kit試劑盒對(duì)線性化的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄所得mRNA用試劑盒所提供的LiCl溶液進(jìn)行沉淀，使用顯微注射用TE重懸并將濃度稀釋為20ng/y I。使用顯微注射儀器將上述mRNA溶液注射入體外受精小鼠受精卵的原核部分，構(gòu)建形成特定的小鼠胚胎細(xì)胞(受精卵)。體外培養(yǎng)1-2小時(shí)后將存活的受精卵移植入假孕母鼠的輸卵管。4、新生小鼠的基因型鑒定新生小鼠出生2周后，剪取腳趾，抽提基因組DNA。在靶向切割序列上游設(shè)計(jì)PCR引物Pl (SEQ ID NO. 2)，下游設(shè)計(jì)PCR引物P2 (SEQID NO. 3)，以待鑒定小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，變性，緩慢退火，加入可識(shí)別并在非匹配的位點(diǎn)進(jìn)行切割的HEndonuclease I，進(jìn)行瓊脂凝膠電泳。圖6為顯微注射L印r-TALEN所得新生小鼠所對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物T7E1酶切電泳圖。如圖6所示，其中每個(gè)泳道600bp左右條帶為Paklipl鑒定引物P1，P2擴(kuò)增所得產(chǎn)物，其中泳道I，2，3，4，6，7中約250和350bp處為經(jīng)T7EI切割產(chǎn)生的條帶，其中條帶的強(qiáng)度與堿基缺失的數(shù)量成正比。Pl 引物序列TGCAAGGATTTCCAGAATCC
P2 引物序列GAATGCAGGCAGAACACAAC將第1，2，3，4，6，7號(hào)小鼠PCR產(chǎn)物分別連入pMD18T載體，分別挑取若干克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序，其中每只小鼠均有一定比例的克隆存在堿基缺失。圖7為顯微注射Lepr-TALEN所得新生小鼠堿基缺失情況示意圖，如圖7所示，其中帶有灰色陰影的序列為TALEN左右兩側(cè)靶序列，其中折線所占據(jù)的位置分別為各小鼠所缺失的堿基。選取缺失非3的整數(shù)倍堿基的雜合型小鼠，分別與野生型小鼠雜交，并將所得到的同窩小鼠進(jìn)行自交，即可得到目的基因Lepr敲除的純合子小鼠。實(shí)施例2在小鼠細(xì)胞中Paklipl基因敲除與敲入的構(gòu)建I、靶向Paklipl敲入位點(diǎn)的TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證
以Paklipl基因?yàn)楸緦?shí)施例中的小鼠目標(biāo)基因組序列。登陸網(wǎng)頁(yè)TALEffectorNucleotide Targeter 2.O (https://boglab. pip. iastate. edu/node/add/talen-old)，按照操作說(shuō)明，將目的基因Paklipl的第一個(gè)外顯子序列粘貼入相應(yīng)文本框，勾選有關(guān)參數(shù)的選擇框。設(shè)定擬被TALE模塊識(shí)別的堿基數(shù)量(Repeat Array Length)范圍，優(yōu)選地，本實(shí)施例中設(shè)定為15-20 ;設(shè)定間隔區(qū)域(Spacer)堿基數(shù)量，優(yōu)選地，本實(shí)施例中設(shè)定為15-20。由于Paklipl第一個(gè)外顯子長(zhǎng)度較短，未在其中找到滿足條件的靶位點(diǎn)，進(jìn)而提交了第二個(gè)外顯子序列，經(jīng)篩選得到了若干候選靶位點(diǎn)。進(jìn)一步地，本實(shí)施例選擇的靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO. 4)如以下所示LeftCCAACAGTCGCTATGT|AGTCTCTGGCAGCAA|AGATGAGACGATTCACGGTTGTCAGCGATACA|TCAGAGACCGTCGTT|TCTACTCTGCTAAGTGRight接下來(lái)按照實(shí)施例I中的思路進(jìn)行TALE模塊的組裝，構(gòu)建能夠識(shí)別并切割目標(biāo)基因的TALEN質(zhì)粒，進(jìn)而體外轉(zhuǎn)錄TALEN mRNA并進(jìn)行顯微注射。當(dāng)新生小鼠出生2周后，剪取腳 止，抽提基因組DNA。在靶向切割序列上游設(shè)計(jì)PCR引物Ρ3 (SEQ ID NO. 5)，下游設(shè)計(jì)PCR引物Ρ4 (SEQID NO. 6)，以待鑒定小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，變性，緩慢退火，加入可識(shí)別并在非匹配的位點(diǎn)進(jìn)行切割的HEndonuclease I，進(jìn)行瓊脂凝膠電泳。圖8為顯微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠所對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物T7E1酶切電泳圖，如圖8所示，其中每個(gè)泳道800bp左右條帶為Paklipl鑒定引物P3，P4擴(kuò)增所得產(chǎn)物，其中2，4，5號(hào)小鼠所對(duì)應(yīng)的泳道中約200和600bp處為經(jīng)T7E1切割產(chǎn)生的條帶，其中條帶的強(qiáng)度與堿基缺失的數(shù)量成正比。P3 引物序列TTGGCCCTTCTTGGTCCCTC。P4 引物序列TCCCACAGGCTTGTGCTCAC。將第2，4，5號(hào)小鼠PCR產(chǎn)物分別連入pMD18T載體，分別挑取若干克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序，其中三者分別有一定比例的克隆存在堿基缺失。圖9為顯微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠堿基缺失情況示意圖，如圖9所示，其中帶有灰色陰影的序列為TALEN左右兩側(cè)靶序列，其中折線所占據(jù)的位置分別為各小鼠所缺失的堿基。通過以上實(shí)驗(yàn)證明針對(duì)該靶點(diǎn)的TALEN質(zhì)粒是有效的，為接下來(lái)開展TALEN輔助下的同源重組奠定了基礎(chǔ)。2、以靶位點(diǎn)兩側(cè)序列為同源重組引導(dǎo)序列構(gòu)建敲入載體
圖10為Paklipl同源重組打靶示意圖。用引物對(duì)P5(SEQ ID NO. 7)，P6 (SEQ IDNO. 8)擴(kuò)增靶位點(diǎn)左側(cè)序列HRDSl和用引物對(duì)P7 (SEQ ID NO. 9)，P8(SEQ ID NO. 10)擴(kuò)增靶位點(diǎn)右側(cè)序列HRDS2，連入T載體，得到質(zhì)粒pHRDSl+2，同時(shí)通過設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)引入酶切位點(diǎn)使得HRDSl和HRDS2之間引入AscI酶切位點(diǎn)。然后以pEGFP-ACN載體為模板，用引物對(duì)P9(SEQ ID NO. 11), PlO (SEQ ID NO. 12)擴(kuò)增得到帶有pA的EGFP編碼序列，并通過AscI酶切位點(diǎn)連入之前構(gòu)建好的pHRDSl+2，PCR確定插入方向。將鑒定正確并線性化的DNA片段與Pakl ipI-TALEN mRNA顯微共注射入小鼠受精卵的細(xì)胞核部分。得到小鼠后，使用分別與HRDSl和EGFP互補(bǔ)的一對(duì)引物鑒定并篩選發(fā)生目的敲入的小鼠。P5 引物序列ATGCAGATCTAGTCCGACATGTCAAGATGGP6 引物序列ATCCGGCGCGCCATACATAGCGACTGTTGGAGGP7 引物序列ATCCGGCGCGCCTCTGGCAGCAAAGATGAGACP8 引物序列ATCGGTCGACAACCTCAGGATAAGGAGCAC P9 引物序列GTATGGCGCGCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTPlO 引物序列CAGAGGCGCGCCTGAATTCGCCCTTATCGGCG。
權(quán)利要求
1.一種在小鼠胚胎細(xì)胞中基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)在小鼠目標(biāo)基因組序列中確定目標(biāo)靶序列； (2)按所述目標(biāo)靶序列的順序，構(gòu)建能夠識(shí)別并切割目標(biāo)基因的TALEN核酸序列； (3)將所述TALEN核酸序列導(dǎo)入小鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)； 所獲得的小鼠胚胎細(xì)胞用于體外培養(yǎng)或直接植入母鼠，表達(dá)TALEN并切割目標(biāo)基因組，從而篩選目標(biāo)基因突變的小鼠。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述小鼠目標(biāo)基因組序列包括編碼基因的基因組序列、低度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列、高度重復(fù)序列、低拷貝序列、基因間的轉(zhuǎn)錄活躍序列或非轉(zhuǎn)錄序列。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述小鼠胚胎細(xì)胞包括小鼠單細(xì)胞受精卵或多細(xì)胞小鼠胚胎。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)是將所述TALEN核酸序列在體外轉(zhuǎn)錄為mRNA并純化后，通過顯微注射導(dǎo)入小鼠胚胎細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，切割目標(biāo)基因組所形成的DNA斷裂位點(diǎn)通過非同源末端連接修復(fù)或通過同源重組修復(fù)。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因突變包括堿基插入、缺失、改變、移碼突變或敲除。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因突變的小鼠是指通過選取目標(biāo)基因發(fā)生突變的小鼠與野生型小鼠雜交，再選取上述雜交所得的同窩雜合子小鼠進(jìn)行自交，然后從上述所得新生小鼠中篩選目標(biāo)基因突變的純合子小鼠。
8.—種小鼠胚胎細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是按權(quán)利要求1-7所述的方法制備獲得。
9.一種純合子小鼠，其特征在于，所述純合子小鼠含有按權(quán)利要求1-7所述方法制備獲得的小鼠胚胎細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開一種在小鼠胚胎細(xì)胞中基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法，通過在小鼠胚胎細(xì)胞中引入特定核算序列構(gòu)建基因定點(diǎn)突變小鼠，包括以下步驟在小鼠目標(biāo)基因組序列中確定目標(biāo)靶序列；按所述目標(biāo)靶序列的順序，構(gòu)建能夠識(shí)別并切割目標(biāo)基因的TALEN核酸序列；將所述TALEN核酸序列導(dǎo)入小鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)；所獲得的小鼠胚胎細(xì)胞用于體外培養(yǎng)或直接植入母鼠，表達(dá)TALEN并切割目標(biāo)基因組，從而篩選目標(biāo)基因突變的小鼠。本發(fā)明具有無(wú)需構(gòu)建同源重組打靶載體、無(wú)需進(jìn)行ES打靶細(xì)胞篩選，突變體比例高，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)成本和周期大大減少等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102839156SQ20121029100
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者李大力, 邱中偉, 劉明耀 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)