專利名稱：耐氯菌株s616及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物及其篩選方法。
背景技術(shù)：
高鹽度難降解有機(jī)廢水，如石油開采、化工、制藥等廢水已經(jīng)成為環(huán)保水處理領(lǐng)域的世界性技術(shù)難題。而鹽酸法黃姜皂素生產(chǎn)廢水在高濃度含鹽難降解有機(jī)物廢水中具代表性。一方面，這類廢水成分復(fù)雜，難降解的有機(jī)物多，廢水的可生化性差；另一方面，廢水中的鹽含量高，氯離子濃度大，其混合廢水中氯離子濃度可達(dá)20000mg/L。目前，含鹽有機(jī)廢水采用非生物方法和生物方法，非生物方法由于其處理費(fèi)用高、處理效果不好，企業(yè)無法接受，生化法一直是水處理工藝中的首先方法，主要采用A-B兩段接觸氧化法，傳統(tǒng)活性污泥法，SBR法，生物濾池，厭氧濾池等，但是上述生物法大多只能處理含鹽量為3％以下的廢水，而對(duì)高鹽廢水(含鹽量5％，甚至20％)難以處理，因此需要特殊的微生物。近年來，國(guó)外已報(bào)道了有關(guān)選育耐鹽(NaCl)菌處理高鹽有機(jī)廢水的報(bào)道，而對(duì)皂素廢水這類高濃度有機(jī)物含量、高鹽(CaCl2)、含難降解物質(zhì)(皂素)復(fù)雜的廢水，至今還屬于研究之薄弱領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株可處理含高濃度氯離子廢水的耐氯菌株S616及其篩選方法。
本發(fā)明所提供的耐氯菌株S616，為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616CCTCCNO.M205146，已于2005年12月9日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏號(hào)CCTCC NO.M205146。
所述的一株耐氯菌株S616的菌落形態(tài)幼齡菌菌落呈車輪狀，乳白色不透明；老齡菌呈土灰色、邊緣不齊；生理特征細(xì)胞常呈對(duì)或鏈狀排列，周生鞭毛，運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性，兼性厭氧，0.2～0.4μm×1.4～2.1μm，最適生長(zhǎng)pH值6.5～7.5，生長(zhǎng)溫度30-40℃；主要生化特征接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，水解酪朊、明膠和淀粉。
一株耐氯菌株S616的篩選方法，1).菌膠團(tuán)的破碎取皂素廢水處理系統(tǒng)中的厭氧活性污泥，按厭氧活性污泥∶無菌水＝2g∶100ml的配比，加入事先滅菌好的裝有無菌水的三角瓶?jī)?nèi)，并加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團(tuán)打碎，得泥水混合物，備用；2).耐氯離子優(yōu)勢(shì)菌種的分離利用無菌移液管吸取上述泥水混合物，按泥水混合物∶分離培養(yǎng)基＝0.5ml∶4.5ml的配比，加入分離培養(yǎng)基，30-40℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，待試管培養(yǎng)基變混濁，說明細(xì)菌已經(jīng)生長(zhǎng)，然后平板稀釋涂布，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，并于斜面培養(yǎng)基上保存；3).耐氯離子優(yōu)勢(shì)菌種的篩選；挑取上述分離出的單菌落，分別接種于篩選培養(yǎng)基內(nèi)，30-40℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐氯離子的菌株；經(jīng)過篩選，獲得一株編號(hào)為菌株S616的菌株，即耐氯菌株S616。
分離培養(yǎng)基CH3CH2COONa 30mmol，CH3CH2CH2COONa 30mmol，CH3CHOHCOONa30mmol，酵母菌2.0g，MgCl20.1g，NH4Cl 1.0g，K2HPO4 0.4g，刃天青0.002g，半胱氨酸0.5g，蒸餾水1000ml，pH＝7.0～7.3。
篩選培養(yǎng)基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水(COD濃度為1000mg/L)，pH＝7.5，微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
擴(kuò)大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
SC培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；瓊脂20g(固)；CaCl2的加入量為0-140g。
斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
以上培養(yǎng)基分別于121℃高壓滅菌30min后備用。
所述的一株堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616 CCTCC NO.M205146應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理方法為挑取堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616單菌落，于擴(kuò)大培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，按培養(yǎng)后的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)的體積比為(1-4)∶50取堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616接種于含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)中，30-40℃恒溫培養(yǎng)，pH值為7.0-8.0，反應(yīng)48-72小時(shí)。
本發(fā)明從皂素廢水處理系統(tǒng)中的活性污泥中分離、篩選到一株在高濃度氯離子條件下具有一定生長(zhǎng)能力的新菌株。并對(duì)其耐氯能力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在高濃度氯離子條件下，耐氯菌株S616的耐氯能力好，范圍廣，能在[Cl-]為3000-75000mg/L時(shí)具有較好的生長(zhǎng)能力。如果將其作為處理高鹽度的有機(jī)廢水的生物系統(tǒng)中的投加誘導(dǎo)菌，可以克服一般活性污泥的微生物受高氯離子的抑制、活性低、處理效率不高的缺點(diǎn)。由于在高氯離子(20000mg/L)環(huán)境中，傳統(tǒng)工藝的微生物受氯離子滲透壓的作用而使質(zhì)膜受損、代謝功能下降從而使處理效果降低，相比之下，如果生化系統(tǒng)中直接投加耐高氯離子并且具有良好降解性能的菌株，就能克服上述傳統(tǒng)工藝處理高濃度氯離子難降解有機(jī)廢水的缺點(diǎn)。
以含高鹽(CaCl2鹽)的難降解的高濃度有機(jī)廢水---皂素廢水為例，研究了其降解有機(jī)污染物的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株能有效去除皂素廢水中COD的能力，能在72小時(shí)之內(nèi)去除廢水中的COD約為60-70％。
本發(fā)明獲得的新菌株既可在含高濃度氯離子環(huán)境下生存、又可高效降解高濃度有機(jī)污染物。


圖1-1a是菌株S616菌株投影電鏡圖片圖1-1b是菌株S616菌株投影電鏡圖片圖1-2是菌株S616在液體不同氯離子濃度的SC培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況1-3是菌株S616的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(1核DNA，2擴(kuò)增產(chǎn)物，MMarker)圖1-4a是菌株S616在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4b是菌株S616在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4c是菌株S616在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4d是菌株S616在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率圖具體實(shí)施方式
一、一株耐氯菌株S616的篩選方法(一)、材料準(zhǔn)備1、菌源和實(shí)驗(yàn)廢水(1)菌源處理皂素廢水的生化系統(tǒng)中的活性污泥；(2)實(shí)驗(yàn)廢水(即混合皂素廢水)取自湖北省十堰市方坤置業(yè)有限公司皂素生產(chǎn)廢水；經(jīng)內(nèi)電解和CaO調(diào)配后，具體指標(biāo)為pH＝7.5-8.2，COD＝4000-17000mg/L，Cl-＝8000-30000mg/L，NH4-N 140-300mg/L。
2、培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基CH3CH2COONa 30mmol，CH3CH2CH2COONa 30mmol，CH3CHOHCOONa30mmol，酵母菌2.0g，MgCl20.1g，NH4Cl 1.0g，K2HPO4 0.4g，刃天青0.002g，半胱氨酸0.5g，蒸餾水1000ml，pH＝7.0～7.3。
篩選培養(yǎng)基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水(COD濃度為1000mg/L)，pH＝7.5，微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
擴(kuò)大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
SC培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；，瓊脂20g(固)；CaCl2的加入量為0-140g；當(dāng)CaCl2加入量為0g時(shí)，SC培養(yǎng)基內(nèi)[Cl-]＝3000mg/L。
斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
以上培養(yǎng)基分別于121℃高壓滅菌30min后備用。
3、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備國(guó)華SHA-B恒溫振蕩器，SHH150G光照生物培養(yǎng)箱，臥式壓力蒸汽滅菌器，WMX-1型微波密封消解COD速測(cè)儀，722S分光光度計(jì)，光學(xué)顯微鏡，pH計(jì)，超凈工作臺(tái)，鼓風(fēng)干燥箱，超薄切片機(jī)，日立H-7000FA投射顯微鏡，PTC200型PCR儀，電泳儀及電泳槽，凝膠紫外觀測(cè)儀等。
(二)、菌株的分離與篩選1).菌膠團(tuán)的破碎取2g皂素廢水處理系統(tǒng)中的厭氧活性污泥，加入事先滅菌好的裝有100ml無菌水的250ml的三角瓶?jī)?nèi)，并加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團(tuán)打碎，得泥水混合物，備用；2).耐氯離子優(yōu)勢(shì)菌種的分離利用無菌移液管吸取0.5ml上述泥水混合物，加入分離培養(yǎng)基4.5ml，30-40℃(最佳35℃)厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，待試管培養(yǎng)基變混濁，說明細(xì)菌已經(jīng)生長(zhǎng)，然后平板稀釋涂布，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，并于斜面培養(yǎng)基上保存；3).耐氯離子優(yōu)勢(shì)菌種的篩選挑取上述分離出的單菌落，分別接種于篩選培養(yǎng)基內(nèi)，30-40℃(最佳35℃)厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐氯離子的菌株；經(jīng)過篩選，獲得一株編號(hào)為菌株S616的菌株，即耐氯菌株S616。
菌株S616在加入不同濃度氯離子的液體SC培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況如附圖1-2所示。
二、耐氯微生物菌株鑒定1、對(duì)耐氯性能較強(qiáng)的菌株S616的鑒定對(duì)耐氯性能較強(qiáng)的菌株S616進(jìn)行了生理生化的鑒定以及16S rDNA分子的鑒定，從分子水平確定耐氯菌株的種屬。
16S rDNA序列分析主要按照以下步驟①細(xì)菌核DNA的提取1)用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)過夜，取1.5ml菌液于Eppendorf管內(nèi)，8,000rpm室溫離心5min，徹底除去上清。
2)加STE緩沖液1.5ml洗滌一次，離心棄上清，再加入0.6mlTE溶液，重懸細(xì)菌。
3)加30ul10mg/ml的溶菌酶，37℃水浴45min4)加65μl 10％的SDS，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃水浴2小時(shí)，至溶液變清。
5)加入等積體酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白層為止。
6)在上清液中加入1/10體積的3M的NaAc(pH5.2)。
7)加入等體積的異丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒纏繞挑出DNA細(xì)絲，在用70％的乙醇洗滌一次，自然涼干，并將DNA溶于100μl TE溶液中。
8)加入終濃度為50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> ②16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增P1正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’P2反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’在50μL反應(yīng)體積中，加入lμL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(終濃度為0.5μM)，1μLdNTP(每種NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR緩沖液。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min。
③PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。④16S rDNA的全序列測(cè)定和分析P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABI PRISM測(cè)序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373A DNA測(cè)序儀上測(cè)序。測(cè)得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。
2、16S rDNA序列測(cè)定本發(fā)明采用對(duì)16S rDNA序列測(cè)定和分析的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1425bp的擴(kuò)增帶(用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))，如圖1-3所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測(cè)定其全序列。
<110>中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)<120>耐氯菌株S616及其篩選方法<160>1425<210>1<211>1425bp<212>DNA
<213>堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1GCCTATGGTGCGGTCGCGCGAATCTGAGGGAGCTTGGTCCCAAAGATTAGCGGCGGACGG60GTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTA 120ATACCGGATAATCCCTTTCCTCACATGAGGAAAGGCTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACT 180TACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGA 240TGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAAACACGGCCCAAACTCC 300TACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCG 360CGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTATCGG 420AGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC 480AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGC 540AGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA 600CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA 660GAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC 720GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA 780GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCG 840CCTGGGGAGTACGACCGCaAGGTTGAAACTCaAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG 900GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC 960TGACAATCCTAGAGATAGGACGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGT 1020TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT 1080CTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA 1140GGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT 1200GGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAG 1260TTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA 1320GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT 1380TTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGC 1425三、菌株S616菌落形態(tài)、生理和生化特征見表1-1；細(xì)胞形態(tài)見圖1-1a、圖1-1b。
表1-1
菌株S616的菌落形態(tài)特征以及主要的生理特征

葡萄糖產(chǎn)酸+葡萄糖產(chǎn)氣-木糖 -阿拉伯糖 -果糖 -蔗糖 -麥芽糖-甘露醇+甘露糖-氧化酶-細(xì)胞色素C -接觸酶+精氨酸-水解酪朊 +水解明膠 +水解淀粉 +檸檬酸鹽 -NO3-還原-表中符號(hào)說明“+”90％以上的菌株為陽(yáng)性，“-”90％以上的菌株為陰性。
四、菌株S616為新的菌株將菌株S616的16S rDNA基因序列與國(guó)際GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行網(wǎng)上同源性比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌S616與Bacillus firmus(堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌)多個(gè)菌株的同源性高達(dá)98-99％以上。綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，可確定細(xì)菌S616為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，菌株S616命名為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616(即耐氯菌株S616)，查閱有關(guān)資料，尚無芽孢桿菌屬有關(guān)高濃度氯離子條件下難降解有機(jī)廢水以及對(duì)其耐氯能力研究的報(bào)道。堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616為新的菌株，已于2005年12月9日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏號(hào)CCTCC NO.M205146。
本實(shí)驗(yàn)分離、篩選出的菌株S616，具有較好降解高濃度氯離子難降解皂素廢水的功能。這就拓寬了人們對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含高濃度氯離子皂素廢水提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
五、耐氯菌株S616的應(yīng)用(一)、菌株S616對(duì)皂素廢水降解能力
取皂素生產(chǎn)混合廢水，稀釋3-5倍數(shù)，使其COD為5000mg/L，用CaCl2調(diào)節(jié)[Cl-]為2萬mg/L，取廢水50m1分別加入250ml的錐形瓶中，加入菌株S616的菌懸液1ml，35℃、140-160rpm、pH值＝7.0-7.5，搖床振蕩3天，計(jì)算菌株對(duì)廢水的COD的去除情況，菌株S616去除COD的效率好，為60-70％。降解因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1-4a、圖1-4b、圖1-4c、圖1-4d。
所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏55g；蒸餾水1000ml；瓊脂20g(固)；CaCl218.0g/L，pH＝7.0-7.5。
(二)、菌株S616降解皂素廢水的因素試驗(yàn)1)為了考察菌株在不同氯離子濃度下，對(duì)COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為9864.2、14980、21061、24780、30080mg/L。耐氯菌株S616去除效果結(jié)果如圖1-4a。
從圖1-4a可以看出，當(dāng)[Cl-]＝9864.2mg/L時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為3d，菌株S616對(duì)COD的去除率僅為42.96％，但是隨著廢水中氯離子濃度的升高，菌株S616對(duì)COD的去除率增加，當(dāng)廢水中氯離子濃度達(dá)到2萬mg/L時(shí)，菌株S616對(duì)COD的去除率可達(dá)78.89％，并且菌株S616對(duì)COD的去除率隨著廢水中氯離子濃度的繼續(xù)增加而變化不大，當(dāng)廢水中氯離子濃度高達(dá)3萬mg/L時(shí)，菌株S616對(duì)COD的去除率仍保持在70％。
2)為了考察菌株在不同COD濃度下(6610.4、7906.4、11209.6、13420.0、16196.2mg/L)，對(duì)COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為20000mg/L。耐氯菌株S616去除效果結(jié)果如圖1-4b。通過實(shí)驗(yàn)可知當(dāng)廢水中[Cl-]＝20000mg/L、COD濃度達(dá)到1萬mg/L時(shí)，菌株S616對(duì)COD的去除率較好，可達(dá)73.2％。
3)從圖1-4c和1-4d可以看出，菌株S616對(duì)COD的去除率隨pH的增加先增加后下降，其最高去除率在pH為7.5-8時(shí)，達(dá)到70％。離心處理后的廢水，發(fā)現(xiàn)pH為7-8時(shí)，濕菌體量明顯高于pH為9、10、11時(shí)，可見在pH在中性時(shí)，有利于菌株的生長(zhǎng)；當(dāng)接種量在1-4ml之間變化時(shí)，菌株S616對(duì)COD的去除率無明顯變化，基本為70％，當(dāng)接種量為1ml時(shí)，其去除率最好。這是因?yàn)榫甑纳L(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)菌懸液為1ml時(shí)，其需要的物質(zhì)容易得到滿足。
權(quán)利要求
1.一株耐氯菌株S616，其特征在于所述的菌株為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616CCTCC N0.M205146。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株耐氯菌株S616，其特征在于所述的一株耐氯菌株S616的菌落形態(tài)幼齡菌菌落呈車輪狀，乳白色不透明；老齡菌呈土灰色、邊緣不齊；生理特征細(xì)胞常呈對(duì)或鏈狀排列，周生鞭毛，運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性，兼性厭氧，0.2～0.4μm×1.4～2.1μm，最適生長(zhǎng)pH值6.5～7.5，生長(zhǎng)溫度30-40℃；主要生化特征接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，水解酪朊、明膠和淀粉。
3.如權(quán)利要求1所述的一株耐氯菌株S616的篩選方法，其特征在于1).菌膠團(tuán)的破碎取皂素廢水處理系統(tǒng)中的厭氧活性污泥，按厭氧活性污泥∶無菌水＝2g∶100ml的配比，加入事先滅菌好的裝有無菌水的三角瓶?jī)?nèi)，并加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團(tuán)打碎，得泥水混合物，備用；2).耐氯離子優(yōu)勢(shì)菌種的分離利用無菌移液管吸取上述泥水混合物，按泥水混合物∶分離培養(yǎng)基＝0.5ml∶4.5ml的配比，加入分離培養(yǎng)基，30-40℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，待試管培養(yǎng)基變混濁，說明細(xì)菌已經(jīng)生長(zhǎng)，然后平板稀釋涂布，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，并于斜面培養(yǎng)基上保存；3).耐氯離子優(yōu)勢(shì)菌種的篩選挑取上述分離出的單菌落，分別接種于篩選培養(yǎng)基內(nèi)，30-40℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐氯離子的菌株；經(jīng)過篩選，獲得一株編號(hào)為菌株S616的菌株，即耐氯菌株S616。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株耐氯菌株S616的篩選方法，其特征在于分離培養(yǎng)基CH3CH2COONa 30mmol，CH3CH2CH2COONa 30mmol，CH3CHOHCOONa 30mmol，酵母菌2.0g，MgCl20.1g，NH4Cl 1.0g，K2HPO40.4g，刃天青0.002g，半胱氨酸0.5g，蒸餾水1000ml，pH＝7.0～7.3。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株耐氯菌株S616的篩選方法，其特征在于篩選培養(yǎng)基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水，皂素廢水中COD濃度為1000mg/L，pH＝7.5；微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株耐氯菌株S616的篩選方法，其特征在于斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物。一株耐氯菌株S616，其特征在于所述的菌株為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616CCTCC NO.M205146。所述的一株耐氯菌株S616的菌落形態(tài)幼齡菌菌落呈車輪狀，乳白色不透明；老齡菌呈土灰色、邊緣不齊；生理特征細(xì)胞常呈對(duì)或鏈狀排列，周生鞭毛，運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性，兼性厭氧，(0.2～0.4)μm×(1.4～2.1)μm，最適生長(zhǎng)pH值6.5～7.5，生長(zhǎng)溫度30－40℃；主要生化特征接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，水解酪朊、明膠和淀粉。它既可在含高濃度氯離子環(huán)境下生存、又可高效降解高濃度有機(jī)污染物。
文檔編號(hào)C02F3/34GK1840654SQ20061001813
公開日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月10日
發(fā)明者信欣, 王焰新, 鮑建國(guó), 劉慧 , 楊雪芬, 李平 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)