液體陽離子交換劑的制作方法
【專利摘要】本申請涉及從水溶液中除去具有一個或多個正電荷的有機化合物的方法，其包含步驟a)提供含有有機化合物的水溶液和包含液體陽離子交換劑的疏水性有機溶液，其中所述液體陽離子交換劑是疏水性的且其中所述液體陽離子交換劑具有一個或多個負電荷和負的總電荷，b)使所述水溶液與所述有機溶液接觸，和c)從所述水溶液中分離出所述有機溶液。
【專利說明】液體陽離子交換劑
[0001 ] 本申請涉及從水溶液中除去具有一個或多個正電荷的有機化合物的方法，其包含步驟a)提供含有有機化合物的水溶液和包含液體陽離子交換劑的疏水性有機溶液，其中所述液體陽離子交換劑是疏水性的，b)使所述水溶液與所述有機溶液接觸，和c)從所述水溶液中分離出所述有機溶液，其中所述有機化合物是式M3+-A-COOR1的化合物，以及涉及相應的反應混合物。
[0002]由再生原料出發(fā)以生物技術(shù)生產(chǎn)精細化學品(其傳統(tǒng)上由化石燃料合成)時的根本問題在于將該一次性獲得的通常為存在于大體積水相中的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到有機相中。進行這種轉(zhuǎn)移一方面由此以濃縮制成的中間體或最終產(chǎn)物和任選以使得在隨后的反應步驟中的合成加工能夠在有機溶液中進行，另一方面以通過去除所需產(chǎn)物改進水相中的反應收率或使該反應能夠完全在工業(yè)上有意義的范圍內(nèi)進行。從大體積的水溶液中直接熱濃縮通常以低濃度存在的產(chǎn)物通常是不合適的。
[0003]化合物在包含不混溶的親水性水相和疏水性有機相的兩相體系中的分配決定性地取決于各化合物的物理化學性質(zhì)。具有高比例的未取代烴或僅由未取代烴構(gòu)成的化合物主要富集在疏水相中，而具有高比例極性基團，如含雜原子的官能團的化合物，且非常特別是帶電荷的化合物主要或幾乎僅存在于水相中，這使得轉(zhuǎn)移到有機相中變得困難。
[0004]通常借助分配系數(shù)，例如根據(jù)能斯特方程
a=c粗1/c粗2 描述一種化合物在達到平衡后在所提及的兩相體系中的分配。一種具體的分配系數(shù)是Kow,也稱作P-值，其表征化合物在辛醇相與水相之間的分配平衡:
Kow = P = c 辛醇/C 水。
[0005]工業(yè)上非常需要的帶正電荷的有機化合物的一個實例是12-氨基月桂酸(ALS)及其衍生物，特別是甲酯(ALSME)。ALS是聚合物生產(chǎn)中的重要原材料，例如用于生產(chǎn)管道系統(tǒng)和尼龍。傳統(tǒng)上，ALS由化石原材料起始以具有低收率的工藝經(jīng)由十二內(nèi)酰胺來制備，其通過三聚化丁二烯、隨后氫化形成環(huán)十二烷、隨后氧化成環(huán)十二酮、與羥基月桂酸甘油酯(Hydroxylaurin)反應并隨后進行貝克曼重排來合成。在DE10200710060705中描述了 ALS或ALSME的一種有前途的生物技術(shù)生產(chǎn)途徑。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)教導了通過使包含生物制劑的水性反應混合物與包含有機溶劑的有機相接觸獲得帶正電荷的有機化合物。因此，例如，DE10200710060705描述了通過用乙酸乙酯振搖從水性反應混合物中獲得產(chǎn)物ALSME。Asano等人(2008)公開了用甲苯從包含合成ALS的酶的水性反應溶液中萃取ALS。
[0007]因此，本發(fā)明的目的在于開發(fā)從水性反應混合物中除去具有至少一個正電荷的帶正電的有機化合物，尤其是ω-氨基羧酸的方法，由此期望的是反應混合物和用作萃取劑的疏水性有機相之間的分配平衡的盡可能有利的位置，即該分配平衡應盡可能遠地位于疏水性有機相側(cè)。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于開發(fā)使用疏水性有機相作為萃取劑從包含生物制劑的水溶液中除去具有至少一個正電荷的有機化合物，尤其是ω-氨基羧酸的方法，其中分配平衡盡可能遠地位于疏水性有機相側(cè)。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于開發(fā)使用疏水性有機溶液作為萃取劑從水溶液中除去具有至少一個正電荷的有機化合物，尤其是ω-氨基羧酸的方法，其盡可能少地不利影響和/或減慢生物技術(shù)相關(guān)的微生物，特別是大腸桿菌的生長和/或由此盡可能少地減少可分化和/或可存活的和/或呼吸活性的和/或代謝-和合成活性細胞的數(shù)量。
[0010]最后，本發(fā)明的目的在于找出使用疏水性有機相作為萃取劑從包含生物制劑的水溶液中除去具有至少一個正電荷的有機化合物，尤其是ω-氨基羧酸的方法，其中考慮到總收率或更快的進程或在連續(xù)工藝的情況下，盡可能長的生物制劑可用性，整體優(yōu)化對于基于生物工程合成方法的收率、總轉(zhuǎn)化率和快速可完成性而言決定性的性質(zhì)，特別是有機相對生物制劑的毒性和該化合物在有機萃取劑中的容納性，特別是對于所述具有至少一個正電荷的有機化合物是在生物制劑的催化活性參與下合成的該合成方法的產(chǎn)物或中間體的情況而言。
[0011]通過本申請的主題，和特別是也通過所附獨立權(quán)利要求的主題實現(xiàn)這些和其它目的，其中由從屬權(quán)利要求得到實施方案。
[0012]第一方面通過從水溶液中除去具有一個或多個正電荷的有機化合物的方法解決作為本發(fā)明的基礎的目的，所述方法包括下列步驟
a)提供含有有機化合物的水溶液和包含液體陽離子交換劑的疏水性有機溶液，
其中所述液體陽離子交換劑是疏水性的，
b)使所述水溶液和所述有機溶液接觸,和
c)從所述水溶液中分離出所述有機溶液，
其中所述有機化合物是式I的化合物，
NH3a-COOR1 (I),
其中R1是氫、甲基、乙基或負電荷且A是未取代的具有至少3個、優(yōu)選至少8個碳原子的直鏈烷基，
且其中所述液體陽離子交換劑是脂肪酸。
[0013]在第一方面的第一實施方案中，所述問題通過根據(jù)權(quán)利要求1之一的方法得以解決，其中步驟b)中的溫度為28至70，優(yōu)選30至37°C。
[0014]在第二實施方案(其也是第一方面的第一實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過根據(jù)權(quán)利要求1-2之一的方法得以解決，其中步驟b)中的pH-值為6至8，優(yōu)選6.2至7.2。
[0015]在第三實施方案(其也是第一方面的第一至第二實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過其中液體陽離子交換劑與有機化合物的物質(zhì)的量的比為至少I的方法得以解決。
[0016]在第三實施方案(其也是第一方面的第一至第三實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過其中有機溶液與水溶液的體積比為1:10至10:1的方法得以解決。
[0017]在第四實施方案(其也是第一方面的第一至第三實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過其中所述液體陽離子交換劑是具有多于12個，優(yōu)選具有14至22個，還更優(yōu)選16至18個碳原子的脂肪酸的方法得以解決。
[0018]在第五實施方案(其也是第一方面的第一至第四實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過其中所述液體陽離子交換劑是不飽和脂肪酸，優(yōu)選油酸或芥酸的方法得以解決。
[0019]在第六實施方案(其也是第一方面的第一至第五實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過其中所述水溶液此外包含具有催化活性的生物制劑的方法得以解決。
[0020]在第七實施方案(其也是第一方面的第一至第六實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過其中所述其中所述生物制劑是細胞，優(yōu)選是細菌細胞且所述細胞更優(yōu)選具有重組的烷烴單加氧酶、重組的轉(zhuǎn)氨酶以及優(yōu)選此外具有至少一種選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和AlkL-基因產(chǎn)物或其變體的酶的方法得以解決。
[0021]在第八實施方案(其也是第一方面的第一至第七實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過其中所述有機化合物的存在對催化活性起不利作用的方法，優(yōu)選通過所述有機化合物是對細胞有毒的化合物的方法得以解決。
[0022]在第九實施方案(其也是第一方面的第一至第八實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過其中所述有機溶液此外包含至少一種有機溶劑，優(yōu)選脂肪酸和/或脂肪酸酯的方法得以解決。
[0023]在第十實施方案(其也是第一方面的第一至第九實施方案的一個實施方案)中，所述問題通過根據(jù)權(quán)利要求12的方法得以解決，其中所述有機溶液包含20至80體積％，優(yōu)選25至75體積％的油酸作為液體陽離子交換劑，并包含月桂酸甲酯作為溶劑，且所述有機化合物是12-氨基月桂酸甲酯，且在所述水溶液中存在具有重組的烷烴單加氧酶、重組的轉(zhuǎn)氨酶以及優(yōu)選此外具有至少一種選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和AlkL-基因產(chǎn)物或其變體的酶的細菌細胞。
[0024]在第二方面中，作為本發(fā)明的基礎的問題通過包含水溶液和疏水性有機溶液的反應混合物得以解決，
其中所述疏水性有機溶液包含脂肪酸，優(yōu)選具有多于12個碳原子的脂肪酸，更優(yōu)選不飽和脂肪酸作為陽離子交換劑，
且其中所述水溶液是式(I)化合物 NH3 a-COOR1 (I),
其中R1是氫、甲基、乙基或負電荷且A是未取代的具有至少3個、優(yōu)選至少8個碳原子的直鏈烷基。
[0025]在第二方面的一個實施方案中，作為本發(fā)明的基礎的問題通過根據(jù)第一方面的反應混合物得以解決，其中所述水溶液此外包含具有重組的烷烴單加氧酶、重組的轉(zhuǎn)氨酶以及優(yōu)選此外具有至少一種選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和AlkL-基因產(chǎn)物或其變體的酶的細胞
第二方面的其它實施方案包含第一方面的所有實施方案。
[0026]在第四方面中通過從水溶液中除去具有一個或多個正電荷的有機化合物的方法實現(xiàn)作為本發(fā)明的基礎的目的，其包含步驟:
a)提供含有有機化合物的水溶液和包含液體陽離子交換劑的疏水性有機溶液，
其中所述液體陽離子交換劑是疏水性的，
且其中所述液體陽離子交換劑具有一個或多個負電荷和總負電荷，` b)使所述水溶液和所述有機溶液接觸,和c)從所述水溶液中分離出所述有機溶液。
[0027]在本發(fā)明的第四方面的第二實施方案(其也是本發(fā)明的第一實施方案的一個實施方案)中，該方法包含步驟:
d)后處理所述有機溶液，優(yōu)選通過將所述有機化合物反萃到另一水溶液中。
[0028]在本發(fā)明的第四方面的第三實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第二實施方案的一個實施方案)中，根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟b)中的溫度為28至70°C，優(yōu)選30至37°C。
[0029]在本發(fā)明的第四方面的第四實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第三實施方案的一個實施方案)中，根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟b)中的pH-值為3至8，優(yōu)選6至8，特別優(yōu)選6.2 至 7.2。
[0030]在本發(fā)明的第四方面的第五實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第四實施方案的一個實施方案)中，在該方法中的液體陽離子交換劑與有機化合物的物質(zhì)的量的比為至少I。
[0031]在本發(fā)明的第四方面的第六實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第五實施方案的一個實施方案)中，有機溶液與水溶液的體積比為1:10至10:1。
[0032]在本發(fā)明的第四方面的第七實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第六實施方案的一個實施方案)中，所述有機化合物具有至少一個帶正電荷的式(I)的取代基
-N+R2R3R4(I)
或者，如果選自R2、R3和R4的至少一個取代基是氫，則為其非質(zhì)子化形式，
其中R2、R3和R4彼此獨立地選自氫、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、芐基、羥基、取代或未取代的和/或直鏈或支鏈或環(huán)狀的烷基或烯基。
[0033]在本發(fā)明的第四方面的第八實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第七實施方案的一個實施方案)中，所述有機化合物具有式(II)
Z-A-N+R2R3R4(II)
或者，如果選自R2、R3和R4的至少一個取代基是氫，則為其非質(zhì)子化形式，
其中R2、R3和R4彼此獨立地選自氫、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、芐基、羥基、取代或未取代的和/或直鏈或支鏈或環(huán)狀的烷基或烯基，
其中A是包含至少三個碳原子的烴鏈，優(yōu)選是未取代的烯基，
且其中Z選自-C00H、-COOR5, -C0H、-CH2OH且包括其非質(zhì)子化形式，
其中R5選自氫、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、芐基、羥基、取代或未取代的和/或直鏈或支鏈或環(huán)狀的烷基或烯基。
[0034]在本發(fā)明的第四方面的第九實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第八實施方案的一個實施方案)中，所述有機化合物具有式III
NH3a-COOR1(III)，
或其非質(zhì)子化形式，其中R1是氫、甲基或乙基且A是具有至少三個碳原子的未取代的
直鏈亞烷基。
[0035]在本發(fā)明的第四方面的第十實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第九實施方案的一個實施方案)中，所述液體陽離子交換劑具有至少一個含有至少六個碳原子的烷基或烯基以及包含選自-C00H、-OSO2H, -OPO (OH) 2_和-OPO (OH) O-及其非質(zhì)子化形式的端位取代基。
[0036]在本發(fā)明的第四方面的第十一實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第十實施方案的一個實施方案)中，所述液體陽離子交換劑是不飽和脂肪酸，優(yōu)選油酸。[0037]在本發(fā)明的第四方面的第十二實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第十一實施方案的一個實施方案)中，所述水溶液此外包含具有催化活性的生物制劑。
[0038]在本發(fā)明的第四方面的第十三實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第十二實施方案的一個實施方案)中，所述生物制劑是細胞，優(yōu)選細菌細胞。
[0039]在本發(fā)明的第四方面的第十四實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第十三實施方案的一個實施方案)中，所述有機化合物的存在對催化活性具有不利作用。
[0040]在本發(fā)明的第四方面的第十五實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第十四實施方案的一個實施方案)中，所述有機溶液此外包含至少一種有機溶劑，優(yōu)選脂肪酸和/或脂肪酸酯。
[0041]在本發(fā)明的第四方面的第十六實施方案(其也是本發(fā)明的第一至第十五實施方案的一個實施方案)中，所述有機溶液包含20至80體積％，優(yōu)選25至75體積％的油酸作為液體陽離子交換劑并包含月桂酸甲酯作為溶劑，且所述有機化合物是12-氨基月桂酸甲酯，且在所述水溶液中存在具有參與12-氨基月桂酸甲酯合成的催化活性的細菌細胞。
[0042]在第五方面中，通過包含含生物制劑的水溶液和含液體陽離子交換劑的疏水性有機溶液的生物反應器解決作為本發(fā)明的基礎的目的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，如本文所用的術(shù)語“生物反應器”被理解為是指在其中可在受控條件下培養(yǎng)生物技術(shù)上有用的微生物和/或可用于生物技術(shù)方法，優(yōu)選用于合成有機化合物的所有容器。
[0043]在第五方面的第二實施方案(其也是本發(fā)明的第三方面的第一實施方案的一個實施方案)中，所述液體陽離子交換劑是脂肪酸，優(yōu)選油酸。
[0044]在第五方面的第三實施方案(其也是本發(fā)明的第三方面的第一至第二實施方案的一個實施方案)中，所述疏水性有機溶液此外包含脂肪酸酯，優(yōu)選月桂酸甲酯。
[0045]在第五方面的第四實施方案(其也是本發(fā)明的第二方面的第一至第三實施方案的一個實施方案)中，所述疏水性有機溶液包含油酸作為陽離子交換劑并包含25至75體積％的月桂酸甲酯作為溶劑。
[0046]在第五實施方案(其也是本發(fā)明的第五實施方案的第一至第四實施方案的一個實施方案)中，所述有機化合物是根據(jù)本發(fā)明的第一方面的實施方案之一的化合物。
[0047]在第六方面中，通過制備具有一個或多個正電荷的有機化合物的方法實現(xiàn)作為本發(fā)明基礎的目的，其中所述有機化合物對細胞而言是有毒的，所述方法包括在包含液體陽離子交換劑和任選有機溶劑的疏水性有機溶液存在下，在水溶液中，培養(yǎng)參與有機化合物合成的細胞，優(yōu)選催化該合成的至少一個步驟的細胞。
[0048]在本發(fā)明的第六方面的第二實施方案中，所述有機化合物是12-氨基月桂酸或12-氨基月桂酸甲酯，所述有機溶劑是月桂酸甲酯。
[0049]第四、五、六方面的其它實施方案包含本發(fā)明第一和第二方面的所有實施方案。
[0050]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果這種有機溶液包含液體陽離子交換劑，則可以令人驚訝地提高將具有一個或多個正電荷的有機化合物從水溶液移除到疏水性有機溶液中的效率。不希望與任何理論相關(guān)聯(lián)，但本發(fā)明的發(fā)明人推測，所述液體陽離子交換劑的一個或多個負電荷與所述有機化合物的一個或多個正電荷以離子方式相互作用，且這種相互作用導致掩蔽至少一個正電荷，這提高了有機相中的溶解度。
[0051]在一個優(yōu)選實施方案中，本文所用的術(shù)語“液體陽離子交換劑”是指可溶于疏水性有機溶劑中的化合物，其由于一個或多個負的永久電荷而能與至少一個陽離子形成離子相互作用。通常，液體陽離子交換劑包含至少一個飽和或不飽和的烴鏈，其可以是直鏈或支鏈，以及帶負電的基團，例如羧基。在一個優(yōu)選實施方案中，所述液體離子交換劑是脂肪酸，在一個更優(yōu)選的實施方案中是不飽和脂肪酸，例如油酸。在一個優(yōu)選實施方案中，該液體離子交換劑是二(2-乙基己基)磷酸(也被稱作DEHPA或D2EHPA)。
[0052]在一個優(yōu)選實施方案中，該液體離子交換劑不僅具有負的總電荷，而且完全沒有正電荷。在一個優(yōu)選實施方案中，術(shù)語離子交換劑或其它分子的“總電荷”，如本文中所使用的，被理解為是指與該分子共價鍵合的所有官能團的電荷總和。例如，月桂酸在PH7時具有一個負電荷作為總電荷，不取決于水溶液中存在的其它分子或抗衡離子如鉀離子的存在。
[0053]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本文所用的術(shù)語“接觸”被理解為是指兩相直接且尤其沒有物理屏障，如膜的間隔而彼此相對暴露。在最簡單的情況中通過將兩相置于同一容器中并以合適的方式例如通過攪拌將它們彼此混合來進行所述接觸。
[0054]在一個優(yōu)選實施方案中，所述有機化合物具有正的總電荷。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述有機化合物沒有負電荷。在一個優(yōu)選實施方案中，所述有機化合物是ω-氨基羧酸。
[0055]在一個優(yōu)選實施方案中，本文所用的術(shù)語“具有電荷”是指如此指出的化合物在pHO至14，優(yōu)選2至12，2至6，8至12，3至10，6至8，最優(yōu)選在pH 7的水溶液中具有相應電荷。在一個優(yōu)選實施方案中，其是永久存在的電荷。在另一優(yōu)選的實施方案中，本文所用的術(shù)語“具有電荷”是指相應的官能團或化合物在PH 7主要具有相應電荷，即至少50，更優(yōu)選90，還更優(yōu)選99%。
[0056]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，可將術(shù)語“包含”按“包括”的意義理解，即非封閉地。在此意義上，包含A的混合物可具有除A外的其它成分。表述“一個或多個”電荷是指至少一個相應電荷。
[0057]在一個優(yōu)選實施方案中，本文所用的術(shù)語“疏水性”被理解為是指一種液體在水相存在下形成與水相清晰分界的其自身的液相的性質(zhì)。后者可以是連續(xù)液相或乳狀液。在另一優(yōu)選的實施方案中，本文所用的術(shù)語“疏水性”被理解為是指化合物基本上不溶于水的性質(zhì)。最后，如本文所用，該術(shù)語在另一優(yōu)選的實施方案中如此理解，即是指如此提及的化合物具有十進對數(shù)大于0，更優(yōu)選大于0.5，還更優(yōu)選大于I和最優(yōu)選大于2白勺 P—{IXJ.Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals andPhysical Chemistry, Wiley Series in Solution Chemistry 卷 2, John Wiley & Sons,Chichester, 1997)。
[0058]在本發(fā)明的另一實施方案中，所述液體離子交換劑對生物技術(shù)相關(guān)的微生物沒有或僅有適度毒效。本文所用的術(shù)語“毒效”在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中被理解為是指化合物在與相應的微生物接觸時降低它們的生長速率、降低它們的代謝活性、提高它們的能量消耗、降低它們的光學密度或能生長的細胞的數(shù)量和/或直接導致它們死亡和溶解的性質(zhì)。在一個優(yōu)選實施方案中，在毒性化合物的情況中，在低濃度下，優(yōu)選在1000，更優(yōu)選100,還更優(yōu)選50或25,最優(yōu)選5 mg/L的濃度下就已實現(xiàn)這些效應的至少一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多可常規(guī)用于研究毒性的方法。這些包括例如經(jīng)由O2-電極或微生物樣品的對比析出和集落形成單位(cfus)的隨后計數(shù)測量相應微生物的呼吸。在一個優(yōu)選實施方案中，“適度毒效”被理解為是指位于生長期的微生物在該化合物存在下進一步生長和/或是代謝活性的，但程度低于在不存在相應化合物的相同條件下培養(yǎng)的對照物的情況，和/或具有延長的停滯期。
[0059]水溶液和有機溶液的接觸在合適的條件下進行，特別經(jīng)過足以使所述有機化合物從水相充分轉(zhuǎn)移到有機相中，理想地甚至建立相應平衡的時期。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在常規(guī)實驗范圍內(nèi)確定該時間和條件。
[0060]在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述具有一個或多個正電荷的有機化合物是端位胺化的脂肪酸，特別優(yōu)選12-氨基月桂酸或其酯或這兩種化合物的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，在包含酯酶活性的生物體系存在下，脂肪酸的酯可以部分以相應的酸的形式存在，并且就此而言，這兩種化合物在這方面被視為等效。因此，如本文所用，在一個特別優(yōu)選的實施方案中脂肪酸或脂肪酸衍生物還包括相應的酯，優(yōu)選甲酯，反之亦然。
[0061]在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本文所用的術(shù)語“亞烷基”是式-(CH2)n-的基團，即是具有兩個開放的，優(yōu)選端位的取代基的鏈烷。這兩個取代基可以是例如氨基和羧基。在一個優(yōu)選實施方案中，η至少為3，還更優(yōu)選至少為6，還更優(yōu)選為11。在“取代的亞烷基鏈”中，至少一個氫原子被非氫原子的取代基或烷基殘基，優(yōu)選非氫原子的原子替代。在一個具體實施方案中，與此相反，本文所用的術(shù)語“未取代的亞烷基”是指沒有這種取代基的式-(CH2)n -的烴鏈。
[0062]步驟b)中的溫度不僅取決于液體陽離子交換劑的性質(zhì)，而且，特別對于隨著反應進程在水相中發(fā)生水溶液與有機溶液的接觸的情況而言，還取決于可能的在水相中發(fā)生的反應的溫度要求。特別對于生物制劑，如活細胞在水相中具有催化活性的情況而言，該溫度必須適合保持這種活性。在一個優(yōu)選實施方案中，步驟b)中的溫度為O至100°C，更優(yōu)選20 至 80°C，28 至 70°C，30 至 37°C，35 至 40°C。
[0063]步驟b)中的pH-值必須考慮可能的同時進行的反應的要求，原材料、產(chǎn)物、中間體或試劑的穩(wěn)定性。在一個優(yōu)選實施方案中，所述PH-值為3至8，更優(yōu)選6至8，還更優(yōu)選
6.2 至 7.2。
[0064]為了將有機化合物盡可能完全地從水相轉(zhuǎn)移到有機相中，需要足量的液體陽離子交換劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在至少一個步驟中，在連續(xù)工藝中在整個反應進程范圍合計的液體陽離子交換劑與有機化合物的物質(zhì)的量的比為至少1，即每分子有機化合物使用至少I分子液體陽離子交換劑。在還更優(yōu)選的實施方案中，該比率大于2、3、5、10、15或20，優(yōu)選1.5至3。
[0065]有機溶液與水溶液的體積比與陽離子交換劑/有機化合物物質(zhì)的量的比一起，對高效過程均是重要的。在一個具體實施方案中，其為100:1至1:100，更優(yōu)選20:1至1:20，還更優(yōu)選10:1至1:10,4:1至1:4,3:1至1:3或最優(yōu)選1:2至2:1。
[0066]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使用脂肪酸作為液體陽離子交換劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本文所用的術(shù)語“脂肪酸”被理解為是指具有至少6，優(yōu)選8，還更優(yōu)選10，最優(yōu)選12個碳原子的羧酸，優(yōu)選鏈烷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，它們是直鏈脂肪酸，在另一實施方案中是支鏈脂肪酸。在一個優(yōu)選實施方案中，它們是飽和脂肪酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，它們是不飽和脂肪酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，其是含有雙鍵，優(yōu)選在9位的具有至少12個碳原子的直鏈脂肪酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，其是單不飽和脂肪酸，其中雙鍵在9位和/或11位。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述液體陽離子交換劑是選自油酸、棕櫚油酸和鱈油酸和二十碳烯酸(Icosensjiure)的不飽和脂肪酸。在最優(yōu)選的實施方案中，其是油酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，其是具有6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26.27、28、29、30 個碳原子，優(yōu)選多于12個，還更優(yōu)選多于14個碳原子，還更優(yōu)選具有14至28，14至22，最優(yōu)選16至18個碳原子的脂肪酸。
[0067]在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用不同脂肪酸的混合物作為液體離子交換劑，例如以大豆油或球薊油形式存在的不同脂肪酸的混合物。在需要時，其包括事前的水解，如果所述脂肪酸作為酯存在的話。
[0068]在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，使用兩種液體陽離子交換劑的組合，優(yōu)選其中至少一種是脂肪酸。
[0069]本發(fā)明的一個特別的優(yōu)點在于本發(fā)明的方法與生物技術(shù)方法和其中所用的生物制劑的相容性。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本文所用的術(shù)語“具有催化活性的生物制齊IJ”被理解為是指在從整個細胞到所分離的分子的所有提純階段中由細胞合成的生物催化齊U。在一個優(yōu)選實施方案中，其是表達具有催化活性的酶的細胞。該細胞可以是原核的，包括古生菌，或真核的，優(yōu)選選自假單胞菌、棒狀桿菌和大腸桿菌。在一個更優(yōu)選的實施方案中，該制劑是細菌細胞，還更優(yōu)選是革蘭氏陰性細菌細胞，最優(yōu)選是大腸桿菌。在另一個優(yōu)選的實施方案中，其是真核細胞，更優(yōu)選是真菌細胞，還更優(yōu)選是酵母細胞，最優(yōu)選是酵母屬或假絲酵母屬、畢赤酵母屬，特別是熱帶假絲酵母。在具體實施方案中，術(shù)語“細胞”在本申請中與術(shù)語“微生物”同義并可互換使用。此外，該細胞可以是經(jīng)分離的細胞或培養(yǎng)物的混合物。
[0070]用作生物制劑的細胞可以是活的，或者可以是其制品，例如是細胞的膜部分或細胞溶質(zhì)部分或粗提物。
[0071]如果所述生物制劑是在各種提純階段中分離的分子，這可以是由細胞產(chǎn)生的所有催化活性分子。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，其是選自肽、多肽、碳水化合物、核酸或其混合形式的分子。在一個還更優(yōu)選的實施方案中，其是催化有效的多肽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，其是固定化分子。
[0072]合成生物技術(shù)方法所需的催化功能是多種多樣的。在一個優(yōu)選實施方案中，本文所用的術(shù)語“催化活性”是合成活性，即催化包含形成至少一個新的共價鍵的化學反應。在另一個優(yōu)選的實施方案中，其是轉(zhuǎn)運活性，即一個分子將另一分子從一個隔室轉(zhuǎn)運至另一隔室的能力，例如將物質(zhì)從水性介質(zhì)經(jīng)過細胞膜吸收到細胞內(nèi)部。
[0073]在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述生物制劑是在液體陽離子交換劑存在下用于催化的活細胞，優(yōu)選地，以合成具有一個或多個正電荷的有機化合物，所述有機化合物隨后或同時借助液體陽離子交換劑被移除進入到疏水性有機相中。
[0074]在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述有機化合物的存在對催化活性具有不利影響。在一個實施方案中，這會降低存在的活性的量，其可以以酶的較低kMt意義表述。在另一實施方案中，在酶的提高的Km的意義上可涉及具有催化活性的制劑的親合力。在另一實施方案中，可改變催化活性的特異性，例如以優(yōu)選使其轉(zhuǎn)化或優(yōu)選轉(zhuǎn)化非所需底物分子的底物分子的方式。在另一實施方案中，所述有機化合物對作為生物制劑的細胞具有毒效。[0075]在另一實施方案中，所述有機化合物是降低基本共底物或輔酶的可用性的有機化合物。例如如果所述有機化合物抑制相應的再生反應，則可以是這樣的情況。
[0076]除液體陽離子交換劑外，所述疏水性有機相此外可包含疏水性溶劑。這可用于提高液體陽離子交換劑在疏水相中的吸收能力和防止不想要的行為，例如絮凝。在一個優(yōu)選實施方案中，所述溶劑是在水溶液中進行的反應的原料，最優(yōu)選是在水溶液中進行的酶催化反應的底物。在一個優(yōu)選實施方案中，其是脂肪酸酯。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，該溶劑是充當液體陽離子交換劑的脂肪酸的脂肪酸酯，優(yōu)選甲酯。
[0077]如果存在，疏水性有機相的溶劑的比例在一個優(yōu)選實施方案中為I至99體積百分t匕(體積％)。在一個優(yōu)選實施方案中，該溶劑比例為10至90，還更優(yōu)選20至80，最優(yōu)選25至75體積％。
[0078]在該方法的最優(yōu)選實施方案中，該機化合物是如DE10200710060705中所公開的在水相中由重組的大腸桿菌-菌株通過月桂酸甲酯的端位碳原子的逐步氧化制成的12-氨基月桂酸和/或12-氨基月桂酸甲酯，且該疏水相包含25至75%油酸作為液體陽離子交換劑，其溶解在作為反應底物的月桂酸甲酯中。
[0079]本發(fā)明的教導不僅可使用精確的這里所述生物大分子的氨基酸-或核酸序列進行，而且也可以使用這種大分子可通過刪除、加成或取代一個或多于一個氨基酸或核酸而得到的變體。在一個優(yōu)選的實施方案中，在此處使用的術(shù)語核酸序列或氨基酸序列的"變體"，與在下文中使用的術(shù)語"同源物"意義相同或可互換，表示另外的核酸序列或氨基酸序列，其具有相對于相應的原始野生型-核酸序列或-氨基酸序列70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性，這里用作與同一性意義相同，其中優(yōu)選不同于形成催化活性中心的氨基酸或者對于結(jié)構(gòu)或折疊而言必要的氨基酸被刪除或取代或者后者僅被保守取代，例如谷氨酸代替天門冬氨酸或亮氨酸代替纈氨酸?，F(xiàn)有技術(shù)描述了可以使用的算法，以計算兩個序列的同源性的程度，例如Arthur Lesk (2008), Introduction tobioinformatics,第三版。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，氨基酸-或核酸序列的變體，優(yōu)選除了上述序列同源性而外，基本上具有與野生型分子或原始分子相同的酶活性。例如，作為蛋白酶的酶活性多肽的一個變體具有該多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，催化肽鍵水解的能力。在一個具體的實施方案中，術(shù)語"基本上相同的酶活性"表示，明顯高于本底活性和/或與考慮相同底物的野生型多肽具有的Km和/或kMt-值相差少于3、優(yōu)選2、還更優(yōu)選I個數(shù)量級的考慮野生型-多肽的底物的活性。在另一優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語核酸序列或氨基酸序列的"變體"包含至少一個氨基酸-或核酸序列的活性部分/或片段。在另一優(yōu)選的實施方案中，如這里所使用的術(shù)語"活性部分"表示，具有比該氨基酸序列的全長小的長度或編碼比該氨基酸序列的全長小的長度的氨基酸序列或核酸序列，其中具有比野生型-氨基酸序列更小的長度的所述氨基酸序列或被編碼的氨基酸序列基本上具有與野生型多肽或其變體相同的酶活性，例如作為醇脫氫酶、單加氧酶或轉(zhuǎn)氨酶。在一個具體的實施方案中，術(shù)語核酸的"變體"包括其互補鏈，優(yōu)選在嚴格的條件下，鍵接在野生型-核酸上的核酸。該雜交反應的嚴格性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是易于確定的，且通常取決于探針長度、洗滌時的溫度和鹽濃度。一般而言，較長的探針需要較高的溫度用于水解，而對較短的樣品低的溫度就足夠了。是否發(fā)生水解，通常取決于變性DNA融合在存在于其周圍的互補鏈上的能力，而且在熔點以下。雜交反應的嚴格性和相應的條件詳細描述在Ausubel等1995中。在一個優(yōu)選的實施方案中，如這里使用的術(shù)語核酸的〃變體〃包括與原始的核酸編碼相同氨基酸序列或編碼在遺傳密碼的簡并范圍內(nèi)該氨基酸序列的變體的任意核酸序列。
[0080]可用于產(chǎn)生式(I)的有機化合物的合適的多肽，尤其是烷烴單加氧酶、AlkL、轉(zhuǎn)氨酶、醛脫氫酶和丙氨酸脫氫酶描述于現(xiàn)有技術(shù)中，例如在DE10200710060705、EP11004029中或在 PCT/EP2011/053834 中。
[0081]在最優(yōu)選的實施方案中，所述烷烴單加氧酶是AlkB-型的烷烴單加氧酶。AlkB是得色惡臭假單胞菌熱AlkBGT-體系的氧化還原酶，其因其羥化酶活性而眾所周知。這依賴于兩種另外的多肽，AlkG和AlkT。AlkT被表征為FAD-依賴性紅氧還蛋白還原酶(紅氧還蛋白-Reductase),其將電子從NADH傳遞到AlkG上。AlkG是紅氧還蛋白，是含鐵的氧化還原蛋白，其作為AlkB的直接電子供體起作用。在一個優(yōu)選的實施方案中，將這里所使用的術(shù)語"alkB-型的烷烴單加氧酶"理解為膜結(jié)合的烷烴單加氧酶。在另一優(yōu)選的實施方案中，將同一術(shù)語"alkB-型的烷烴單加氧酶〃愚》%實有與惡臭假單胞菌Gpol (數(shù)據(jù)庫編碼:CAB54050.1)的AlkB的序列愈加優(yōu)選地至少75、80、85、90、92、94、96、98或99%的序列同源性的多肽。在另一優(yōu)選的實施方案中，將該術(shù)語理解為非細胞色素-依賴性單加氧酶。在另一優(yōu)選的實施方案中，將術(shù)語"alkB-型的烷烴單加氧酶〃5理解為非細胞色素-依賴性單加氧酶，其使用至少一種紅氧還蛋白或同源物作為電子供體。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，將該術(shù)語理解為膜結(jié)合的非細胞色素-依賴性烷烴單加氧酶，其具有愈加優(yōu)選地至少60、70、80、80、85、90、92、94、96、98或99%效]惡臭假單胞菌Gpol的AlkB的序列，其至少需要AlkG (CAB54052.1)作為電子供體，但優(yōu)選AlkG與還原酶AlkT (CAB54063.1)的組合，其中AlkG和/或AlkT也可以是各自多肽的同源物。這里所使用的術(shù)語〃序列〃可涉及多肽的氨基酸序列和/或編碼它們的核酸序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，這里使用的"alkB-型的烷烴單加氧酶"是非細胞色素-依賴性氧化還原酶，即未包含細胞色素作為輔因子的氧化還原酶。
[0082]此外通過下列附圖和非限制性實施例說明本發(fā)明，它們可以揭示本發(fā)明的其它特征、實施方案、方面和優(yōu)點。
[0083]圖1顯示用于證實LSME沒有毒效的對照實驗，其用大腸桿菌W3110-菌株研究并與作為陰性對照的磷酸鉀緩沖液(Kpi)進行比較。
[0084]圖2以該菌株在不存在液體陽離子交換劑的情況下和存在不同液體陽離子交換劑的情況下在O h、4 h和24 h后可形成的cfus數(shù)的形式顯示菌株大腸桿菌W3110的存活力。
[0085]圖3借助大腸桿菌-W3110菌株在ALSME 0.2%、用氨調(diào)節(jié)的DEHPA( “D2EHPNH32%”)或在存在ALSME 0.2%的DEHPA/LSME混合物(2%/98%) ( “D/L”)存在下的活細胞數(shù)的變化顯示使用液體陽離子交換劑對毒性的影響。
[0086]圖4顯示不同液體陽離子交換劑對生產(chǎn)氨基月桂酸甲酯的大腸桿菌菌株的OTR的影響。如實施例4中所述進行該實驗。
[0087]圖5顯示不同液體陽離子交換劑對具有合適基因變異的大腸桿菌菌株產(chǎn)生的氨基月桂酸甲酯收率的影響。如實施例4中所述進行該實驗。
[0088]實施例1:研究與液體陽離子交換劑組合使用的溶劑LSME的毒性用此實驗表明LSME對生物技術(shù)相關(guān)微生物相對較低的毒性，這使LSME成為適用于本發(fā)明的方法的有機溶劑。
[0089]在能夠進行CFU的測定之前，在板LB (10 g/L酪蛋白的胨、5 g/L酵母提取物、10g/L NaCl)上用大腸桿菌BW3110劃線并溫育24小時。在第二天晚上，該預先劃線的板接種預培養(yǎng)物。這種預培養(yǎng)物具有50毫升LB培養(yǎng)基體積并溫育過夜大約16小時。在第二天，將該預培養(yǎng)物用3%葡萄糖(w/v)以0.2的OD6tltl轉(zhuǎn)接種在200毫升M9培養(yǎng)基(Na2HP04 6.79g/L ；KH2P04 3.0 g/L ; NaC I 0.5 g/L ；NH4C1 I g/L; I mL/L 痕量元素溶液，pH 7.4。痕量元素溶液:HCl 37% (= 455.8 g/L) 36.50 g/L ；MnC12*7H20 1.91 g/L ；ZnS04*7H20 1.87g/L ;Na-EDTA*2H20 (Titriplex III) 0.84 g/L ；H3B03 0.30 g/L ;Na2Mo04*2H20 0.25 g/L ；CaC12*2H20 4.70 g/L ;FeS04*7H20 17.80 g/L ;CuC12*2H20 0.15 g/L)中并溫育大約20小時。在溫育主培養(yǎng)物后，收獲細胞，在5258 g和4°C下離心10分鐘并以30的OD6c?再懸浮在10毫升pH-值7.4的50 mM Kp1-緩沖液(或25 mM HEPES緩沖液pH-值7.4，如果用ALSME進行CFU測定)中。所用的這兩種緩沖液都含有5%葡萄糖(w/v)。然后將細菌懸浮液轉(zhuǎn)移到搖瓶中并加入各自的底物溶液。在通過振搖燒瓶進行充分混合后，吸移出懸浮液并置于900毫升預先裝入的無菌鹽水中。這相當于在時間點h的取樣。然后在250轉(zhuǎn)/分鐘和30°C下培養(yǎng)該制劑。經(jīng)22小時測定CFUs。首先在時間點和t22取樣。對于某些制劑，添加另一取樣時間點tu,且此外,涂上(ausplattieren)另一個額外的稀釋系列以使偏差最小化。
[0090]OD600為60。將細胞再懸浮在10毫升Kpi緩沖液中，然后在燒瓶中與5毫升LSME98% (w/w)混合。每種制劑 涂上一個稀釋級。每毫升的CFU數(shù)在6小時內(nèi)保持恒定。在22小時后，可記錄到僅30.3%的活細胞計數(shù)降低百分比。
[0091]實施例2:與各種液體陽離子交換劑對生物技術(shù)相關(guān)微生物的毒性相關(guān)的對比實驗
此實施例表明，相對于其它液體陽離子交換劑如DEHPA以及支鏈和直鏈飽和脂肪酸，直鏈脂肪酸毒性較低。
[0092]首先，在100暈升振蕩燒瓶中用相應菌株的低溫培養(yǎng)物接種包含20暈升LB培養(yǎng)基的預培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物在37°C和在以200轉(zhuǎn)/分鐘搖振下培養(yǎng)過夜，并在第二天用于接種相同的主培養(yǎng)物至0.2的0D。主培養(yǎng)物(各30毫升LB培養(yǎng)基)隨后在相同條件下進一步溫育。在0.4至0.5的OD下，在每種情況下用相同體積(30毫升)的溶劑覆蓋主培養(yǎng)物，然后進一步溫育。
[0093]為了測定Cfu (集落形成單位)數(shù)，在下列實驗中取樣0.1毫升-樣品并在無菌
0.9% NaCl溶液中稀釋。將合適的稀釋級涂在LB瓊脂板上。在34°C下溫育過夜后，計數(shù)形成的集落并測定cfus。
[0094]實驗1:作為液體陽離子交換劑的DE2HPA與飽和脂肪酸之間的毒性比較
將50% DEHPA和月桂酸(15%)——各自溶解在LSME中并負載等摩爾或25摩爾％的ALSME——作為液體陽離子交換劑與大腸桿菌BL21 (DE3)菌株接觸，并研究這兩種化合物對菌株形成集落的能力的影響，以cfus表述。在初步實驗中表明，所用菌株極好耐受月桂酸甲酯-其由于缺乏電荷而不能充當液體陽離子交換劑。
[0095]表1:
【權(quán)利要求】
1.從水溶液中除去有機化合物的方法，包括步驟 a)提供含有所述有機化合物的水溶液和包含液體陽離子交換劑的疏水性有機溶液， 其中所述液體陽離子交換劑是疏水性的， b)使所述水溶液和所述有機溶液接觸,和 c)從所述水溶液中分離出所述有機溶液， 其中所述有機化合物是式I的化合物，
NH3+-A-COOR1 (I), 其中R1是氫、甲基、乙基或負電荷且A是未取代的具有至少3個、優(yōu)選至少8個碳原子的直鏈烷基， 且其中所述液體陽離子交換劑是脂肪酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)中的溫度為28至70，優(yōu)選30至37°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2之一的方法，其中步驟b)中的pH-值為6至8，優(yōu)選6.2至7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的方法，其中液體陽離子交換劑與有機化合物的物質(zhì)的量的比為至少I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的方法，其中有機溶液與水溶液的體積比為1:10至10:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的方法，其中所述液體陽離子交換劑是具有多于12個，優(yōu)選具有14至22個，還更優(yōu)選16至18個碳原子的脂肪酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6之一的方法，其中所述液體陽離子交換劑是不飽和脂肪酸，優(yōu)選油酸或芥酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7之一的方法，其中所述水溶液此外包含具有催化活性的生物制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述生物制劑是細胞，優(yōu)選細菌細胞且所述細胞還更優(yōu)選具有重組的烷烴單加氧酶、重組的轉(zhuǎn)氨酶以及優(yōu)選此外具有至少一種選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和AlkL-基因產(chǎn)物或其變體的酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求8至9之一的方法，其中所述有機化合物的存在對催化活性起不利作用，優(yōu)選其中所述有機化合物是對所述細胞有毒的化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10之一的方法，其中所述有機溶液此外包含至少一種有機溶劑，優(yōu)選脂肪酸和/或脂肪酸酯。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述有機溶液包含20- 80體積％，優(yōu)選25 - 75體積％的油酸作為陽離子交換劑，和月桂酸甲酯作為溶劑，且所述有機化合物是12-氨基月桂酸甲酯，和在所述水溶液中存在細菌細胞，所述細胞具有重組的烷烴單加氧酶、重組的轉(zhuǎn)氨酶以及優(yōu)選此外具有至少一種選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和AlkL-基因產(chǎn)物或其變體的酶。
13.包含水溶液和疏水性有機溶液的反應混合物， 其中所述疏水性有機溶液包含脂肪酸，更優(yōu)選具有多于12個碳原子的脂肪酸，還更優(yōu)選不飽和脂肪酸作為液體陽離子交換劑， 且其中所述水溶液是式(I)的化合物，
NH3+-A-COOR1 (I), 其中R1是氫、甲基、乙基或負電荷且A是未取代的具有至少3個、優(yōu)選至少8個碳原子的直鏈烷基。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的反應混合物，其中所述水溶液此外包含具有重組的烷烴單加氧酶、重組的轉(zhuǎn)氨酶以及優(yōu)選此外具有至少一種選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和AlkL-基因產(chǎn)物或其變體的酶的細胞。`
【文檔編號】B01J39/04GK103459033SQ201180070167
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月16日
【發(fā)明者】F.埃爾哈特, T.哈斯, M.羅斯, D.德米克利, M.佩特, A.舒貝特, J.C.普費弗, T.塔克, H.黑格, A.普費尼希, M-D.普日比斯基-弗羅伊恩德 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限公司