卡那霉素適配體親和柱的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種卡那霉素適配體親和柱的制備方法，屬于親和層析和獸藥殘留分析領(lǐng)域。采用環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF作為固相載體，與氨基修飾卡那霉素適配體偶聯(lián)后，封閉載體中多余活性位點，填入微型小柱制成。所制備的適配體親和柱能夠和卡那霉素特異性結(jié)合，其加標回收率在90~100之間，至少可以重復(fù)使用五次。
【專利說明】卡那霉素適配體親和柱的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及親和層析及獸藥殘留檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及卡那霉素適配體親和柱 的制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 卡那霉素是廣譜氨基糖甙類抗生素，是用來作為一種水溶性的硫酸鹽，對許多革 蘭陰性細菌包括淋病，沙門氏菌和肺結(jié)核感染有療效，作為第二線抗生素的形式被廣泛應(yīng) 用于人畜共用藥?？敲顾剡^量可引起耳毒性和腎毒性?？敲顾乜梢栽趧游矬w內(nèi)積累， 通過食物鏈傳遞。
[0003] 目前，卡那霉素的分析方法中，常用的有高效液相色譜、毛細管電泳、液質(zhì)聯(lián)用等。 這些儀器分析方法對樣品純度要求較高，需要經(jīng)過一些前處理，傳統(tǒng)的前處理技術(shù)有液液 萃取、固相萃取等，步驟繁瑣、缺乏選擇性，容易受其他成分干擾，回收率不穩(wěn)定。建立高選 擇、快速有效的樣品前處理技術(shù)已成為卡那霉素檢測分析中需要解決的重要問題。 基于適配體親和層析是一種新型高效樣品前處理技術(shù)。它的原理是利用適配體對靶分 子選擇性吸附來實現(xiàn)對復(fù)雜樣品中靶分子的提取和凈化處理，這種吸附是可逆的。適配體 的親和層析結(jié)合常規(guī)儀器分析已成為獸藥殘留分析的一個發(fā)展方向，但目前尚未見適配體 親和柱的制備方法及其應(yīng)用報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種卡那霉素適配體親和柱的制備方法，所研制的親和柱 是將氨基修飾的卡那霉素適配體與環(huán)氧活化的瓊脂糖6FF偶聯(lián)填充于固相萃取柱中，用于 純化含卡那霉素的待測樣品。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種卡那霉素適配體親和柱的制備方法，其步驟：1活化： 取60mg的環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF在2. OmL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小時。用60mL 去離子水分三次洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液；2偶聯(lián)：將氨基修飾的卡那霉素適配 體溶于lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖液中。將步驟（1)溶脹凝膠懸浮于含適配體的 緩沖液中，在37°C的水浴中振搖16小時。反應(yīng)完后，再用3mL去離子水洗滌未反應(yīng)的適配 體，靜置5min后，移除清洗液；3封閉：將步驟（2)凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶液 中，在50°C的水浴中振搖4小時，反應(yīng)完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0· lmol/LpH4.0乙 酸緩沖液和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循環(huán) 3次；4裝柱：將步驟（3)的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱（內(nèi)徑5. 0 mm，容積I. OmL)，避 免產(chǎn)生氣泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液平衡小柱。
[0006] 氨基修飾的卡那霉素適配體為DNA合成公司商品化生產(chǎn)，卡那霉素適配體的序 列為：5'_ TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA TTT TTT -NH2-3'。
[0007] 本發(fā)明卡那霉素適配體親和柱的應(yīng)用方法，按下述步驟進行：a上樣：放掉柱內(nèi)溶 液，將提取的樣品用〇. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液溶解或稀釋，上樣。上樣時流速不超過 lmL/min，避免樣品流干。b淋洗：待樣品過柱后，用3 mL去離子水淋洗柱床、棄去。c洗脫： 用3mL甲醇洗脫，在50°C下氮氣吹干，用流動相定容待測。d再生：對于使用之后的凝膠，以 2?3 倍柱體積的含 0· 5mol/LNaCl 的 0· lmol/LpH8. 3Tris-HCl 和含 0· 5mol/LNaCl 的 0· Imol/ pH4. 5乙酸緩沖液交替沖洗2?3次。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明制備的適配體親和柱能夠與卡那霉素特異性結(jié)合，一 次凈化能除去絕大部分干擾物。制備的適配體親和柱最大結(jié)合容量約為450 ng卡那霉素。 采用的洗脫液為甲醇時，加標回收率在7(Γ110%之間。制備的適配體親和柱重復(fù)使用5次， 回收率不低于70%。

【具體實施方式】
[0009] 本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi) 容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0010] 實施例1卡那霉素適配體親和柱的制備 1活化：取60mg的環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF在2. OmL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小 時。用60mL去離子水分三次洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液；2偶聯(lián)：將氨基修飾的卡 那霉素適配體溶于lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖液中。將步驟（1)溶脹凝膠懸浮于 含適配體的緩沖液中，在37°C的水浴中振搖16小時。反應(yīng)完后，再用3mL去離子水洗滌未 反應(yīng)的適配體，靜置5min后，移除清洗液； 3封閉：將步驟（2)凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8.0乙醇胺溶液中，在50°C的水浴中振搖 4小時，反應(yīng)完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0· lmol/LpH4.0乙酸緩沖液和3mL含0.5mol/ LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循環(huán)3次； 4裝柱：將步驟（3)的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱（內(nèi)徑5. 0 mm，容積I. OmL)，避免 產(chǎn)生氣泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液平衡小柱。
[0011] 其中步驟2中氨基修飾的卡那霉素適配體為DNA合成公司商品化生產(chǎn)。
[0012] 本發(fā)明所述卡那霉素適配體親和柱的性能評價方法： 1、實施例1所制備的親和柱最大結(jié)合容量的測定：分別用IOmLlOO. Ong/mL (I. 0 Pg) 過卡那霉素親和柱。上樣液每毫升收集一管，用HPLC-MS/MS測定每管中卡那霉素含量。根 據(jù)下式計算：最大結(jié)合容量(即被吸附的卡那霉素總量）等于上樣總量減去洗下的卡那霉素 總量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1飛mL上樣液只測出卡那霉素，到5mL開始無吸附。因此，偶聯(lián)2. 5 nmol/ L卡那霉素適配體的親和柱最大結(jié)合容量約為450ng。
[0013] 2、實施例1所制備的親和柱加標回收率和重復(fù)性測定：分別上樣20mL的5ng/ mL、10ng/mL、20ng/mL三種不同濃度的卡那霉素，每種濃度作三組平行。收集洗漆液后用 HPLC-MS/MS測定回收率。結(jié)果見表1，經(jīng)測定回收率均達到70%以上，相對標準偏差少于 10%。
[0014] 表1制備的親和柱加標回收率和重復(fù)性

【權(quán)利要求】
1. 一種卡那霉素適配體親和柱的制備方法，其步驟：（1)活化：取60mg的環(huán)氧活 化瓊脂糖微球FF在2. OmL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小時，用60mL去離子水分三 次洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液；（2)偶聯(lián)：將氨基修飾的卡那霉素適配體溶于 lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖液中，將步驟（1)溶脹凝膠懸浮于含適配體的緩沖液 中，在37°C的水浴中振搖16小時，反應(yīng)完后，再用3mL去離子水洗滌未反應(yīng)的適配體，靜置 5min后，移除清洗液；（3)封閉：將步驟（2)凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶液中，在 50°C的水浴中振搖4小時，反應(yīng)完后，用3mL含0? 5mol/LNaCl的0? lmol/LpH4. 0乙酸緩沖液 和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循環(huán)3次；（4) 裝柱：將步驟（3)的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱，避免產(chǎn)生氣泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷 酸鹽緩沖液平衡小柱。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述卡那霉素適配體親和柱的制備方法，其特征在于：其中步驟（2) 中氨基修飾的卡那霉素適配體為DNA合成公司商品化生產(chǎn)，卡那霉素適配體的序列為：5'- TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA TTT TTT -NH2-3' 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述卡那霉素適配體親和柱的制備方法，其特征在于：本發(fā)明卡那 霉素適配體親和柱的應(yīng)用方法，按下述步驟進行：（a)上樣：放掉柱內(nèi)溶液，將提取的樣品 用0. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液溶解或稀釋，上樣，上樣時流速不超過lmL/min，避免樣品 流干；（b)淋洗：待樣品過柱后，用3 mL去離子水淋洗柱床、棄去；（c)洗脫：用3mL甲醇洗 脫，在50°C下氮氣吹干，用流動相定容待測；（d)再生：對于使用之后的凝膠，以2~3倍柱體 積的含 〇? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/LpH8. 3Tris-HCl 和含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/pH4. 5 乙 酸緩沖液交替沖洗2~3次。
【文檔編號】B01J20/281GK104383718SQ201410724019
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】廖且根, 羅林廣, 胡麗芳, 王冬根 申請人:江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標準研究所