專利名稱：包含功能性剪接供體位點和功能性剪接受體位點的反轉錄病毒載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及載體。
具體地說，本發(fā)明涉及用于包裝并表達反轉錄病毒顆粒中的遺傳物質的新系統(tǒng)。
更具體地講，本發(fā)明涉及能夠表達反轉錄病毒顆粒的新系統(tǒng)，它能夠將目的核苷酸序列(下文縮寫為“NOI”)或甚至多種NOI傳遞至一個或多個靶位點。
另外，本發(fā)明特別涉及可用于基因治療的新型反轉錄病毒載體。
基因治療可以包括以下的任何一種或多種形式例如在一個或多個靶位點諸如靶細胞中對一種或多種核苷酸序列進行加入、取代、缺失、補充、操作等。如果所述靶位點為靶細胞，則所述細胞可以為組織或器官的部分。在Molecular Biology(編輯Robert Meyers，Pub VCH，諸如第556—558頁)中可以找到關于基因治療的的一般內(nèi)容。
作為再一實例，基因治療也可以提供用于以下任何一種或多種目的的方法可以應用諸如基因的核苷酸序列以取代或補充缺陷基因；可以消除致病核苷酸序列，諸如基因或其表達產(chǎn)物；可以加入或引入核苷酸序列，諸如基因或其表達產(chǎn)物，以便例如產(chǎn)生更合適的表型；可以加入或引入核苷酸序列，諸如基因或其表達產(chǎn)物，例如用于選擇目的(即在非轉化細胞上選擇轉化細胞等)；可以在分子水平上操作細胞，以治療、治愈或預防疾病病癥—諸如癌癥(Schmidt—Wolf和Schmidt—Wolf，1994，Annals of Hematology 69，273—279)或其它疾病病癥，諸如免疫疾病、心血管疾病、神經(jīng)病、炎癥疾病或傳染??；可以操作抗原和／或將其引入以誘發(fā)免疫應答，諸如基因疫苗接種。
在最近數(shù)年中，已經(jīng)提出將反轉錄病毒用于基因治療。本質上說，反轉錄病毒是生活周期不同于裂解病毒的RNA病毒。在該方面，反轉錄病毒是通過DNA中間體復制的感染性實體。當反轉錄病毒感染細胞時，其基因組由反轉錄酶轉變?yōu)镈NA形式。所述DNA拷貝用作模板，以產(chǎn)生新的RNA基因組和感染性病毒顆粒裝配所必需的病毒編碼的蛋白。
有許多反轉錄病毒，實例包括鼠類白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉納米肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo—MLV)、FBR鼠類骨肉瘤病毒(FRB MSV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Mo—MSV)、艾貝爾遜鼠類白血病病毒(A—MLV)、鳥類髓細胞瘤病病毒—29(MC29)和鳥類成紅細胞增生病毒(AEV)。
在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress編輯JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758—763頁)中，可以找到詳細的反轉錄病毒一覽表。
在本領域中可以找到關于某些反轉錄病毒基因組結構的細節(jié)。作為實例，可以從NCBI Genbank中可以找到關于HIV的細節(jié)(即基因組登記號AF033819)。
所有野生型反轉錄病毒基本上均含有三種主要的編碼域—gag、pol、env，它們編碼必需的病毒體蛋白。然而，反轉錄病毒可以大致分為兩類即“簡單的”和“復雜的”。這些類別的區(qū)別在于其基因組結構。簡單的反轉錄病毒通常僅攜帶基本信息。相比之下反，復雜的反轉錄病毒也編碼得自多重剪接信息的另外的調(diào)節(jié)蛋白。
反轉錄病毒甚至可以進一步分為7組。其中5組代表具有致癌潛力的反轉錄病毒。其余2組是慢病毒和泡沫病毒。這些反轉錄病毒的綜述出現(xiàn)于“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press編輯JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第1—25頁)。
除人T細胞白血病病毒—牛白血病病毒群(TLV—BLV)外的所有致癌成員均為簡單的反轉錄病毒。HTLV、BLV和慢病毒以及泡沫病毒是復雜的反轉錄病毒。研究得最清楚的一些致癌反轉錄病毒是勞斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)和鼠類白血病病毒(MLV)和人T細胞白血病病毒(HTLV)。
慢病毒群甚至再分為“靈長類”和“非靈長類”慢病毒。靈長類慢病毒的實例包括人免疫缺陷病毒(HIV)(即人自身免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒群包括原型“慢病毒”維斯那／梅迪病毒(VMV)以及相關的山羊關節(jié)炎—腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和新近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒。
慢病毒科和其它類型反轉錄病毒之間的不同之處在于，慢病毒具有感染分裂細胞和非分裂細胞的能力(Lewis等1992 EMBO．J 113053—3058；Lewis和Emerman 1994 J．Virol．68510—516)。相比之下，諸如MLV的其它反轉錄病毒不能感染非分裂細胞，諸如構成例如肌肉、腦、肺和肝臟組織的細胞。
在感染過程中，反轉錄病毒最初附著于特定的細胞表面受體。在進入敏感性宿主細胞時，反轉錄病毒RNA基因組則由親代病毒內(nèi)攜帶的病毒編碼的反轉錄酶拷貝為DNA。該DNA被轉運到宿主細胞核，隨后在核內(nèi)整合入宿主基因組。在此階段，它通常被稱為原病毒。在細胞分裂期間，原病毒穩(wěn)定地存在宿主染色體上，并同其它細胞蛋白一樣被轉錄。原病毒編碼制造更多病毒所需的蛋白和包裝機器，病毒可以通過有時稱為“芽生”的過程離開細胞。
正如已經(jīng)表明的，每個反轉錄病毒基因組均包含稱為gag、pol和env的基因，它們編碼病毒體蛋白和酶。在原病毒中，這些基因兩端的側翼為稱為長末端重復序列(LTR)的區(qū)域。LTR負責原病毒的整合和轉錄。它們也作為增強子—啟動子序列而起作用。換句話說，LTR可以控制病毒基因的表達。反轉錄病毒RNA的包衣殼借助于位于病毒基因組5’端的psi序列而發(fā)生。
LTR本身是相同的序列，它們可以分為三種元件，這些元件稱為U3、R和U5。U3得自所述RNA 3’端特有的序列。R得自于所述RNA兩端重復的序列，而U5得自所述RNA 5’端特有的序列。在不同反轉錄病毒中，這三種元件的大小可以顯著變化。
為了易于理解，以下顯示RNA和DNA形式的所述反轉錄病毒的簡單的一般結構(未按比例制圖)，其中顯示了LTR的基本特征和gag、pol和env的相對定位。病毒體DNA 如上圖所示，傳染性反轉錄病毒RNA基因組的基本分子結構是(5’)R—U5—gag，pol，env—U3—R(3’)。在缺陷型反轉錄病毒載體基因組中，gag、pol和env可能不存在或沒有功能。該RNA兩端的R區(qū)是重復序列。U5和U3分別代表RNA基因組5’和3’端特有的序列。
病毒體RNA反轉錄為雙鏈DNA發(fā)生于細胞質中，涉及反轉錄酶從模板分子的5’末端至3’末端的兩次跳躍。這些跳躍的結果是位于病毒體RNA 5’和3’端的序列復制。然后這些序列在病毒DNA兩端發(fā)生串聯(lián)融合，形成包含R U5和U3區(qū)的長末端重復序列(LTR)。反轉錄完成時，病毒DNA易位到細胞核中，在此稱為前整合復合物(PIC)的反轉錄病毒基因組的線性拷貝，借助病毒體整合酶隨機插入染色體DNA中，形成穩(wěn)定的原病毒。整合入宿主細胞基因組中的可能位點的數(shù)目非常大并且分布非常廣。
原病毒轉錄的控制主要歸于病毒LTR的非編碼序列。轉錄起始位點位于左手邊LTR(未顯示)中U3和R之間的邊界，poly(A)添加(終止)位點位于右手邊LTR(未顯示)中R和U5之間的邊界。U3含有所述原病毒的大多數(shù)轉錄控制元件，它們包括對細胞轉錄激活蛋白和在某些情況下對病毒的轉錄激活蛋白應答的啟動子和多個增強子序列。某些反轉錄病毒具有任何一種或多種的以下基因諸如tat、rev、tax和rex，它們編碼參與基因表達調(diào)節(jié)的蛋白。
原病毒DNA的轉錄再產(chǎn)生全長病毒RNA基因組大小的RNA分子和通過RNA加工產(chǎn)生的亞基因組大小的RNA分子。通常，所有的RNA產(chǎn)物均用作產(chǎn)生病毒蛋白的模板。通過RNA轉錄物剪接和翻譯期間核糖體移碼的組合，完成RNA產(chǎn)物的表達。
RNA剪接是去除間插或“內(nèi)含子”RNA序列且將剩余的“外顯子”序列連接以提供用于翻譯的連續(xù)讀框的過程。反轉錄病毒DNA的最初轉錄物以幾種方式修飾，其方式非常類似于細胞mRNA。然而，與其中所有內(nèi)含子被有效剪接的大多數(shù)細胞mRNA不同，新合成的反轉錄病毒RNA必須轉變?yōu)閮蓚€群體。一個群體保持未剪接，以用作基因組RNA，而另一群體進行剪接，以提供亞基因組RNA。
全長未剪接的反轉錄病毒RNA轉錄物有兩個功能(ⅰ)它們編碼gag和pol基因產(chǎn)物，和(ⅱ)它們作為基因組RNA被包裝入子代病毒體顆粒中。亞基因組大小的RNA分子為其余的病毒基因產(chǎn)物提供mRNA。所有剪接的反轉錄病毒轉錄物均帶有第一外顯子，它跨越5’LTR的U5區(qū)。最后一個外顯子總是保留3’LTR編碼的U3和R區(qū)，盡管其大小不同。其余RNA結構的組成取決于剪接事件數(shù)和可變剪接位點的選擇。
在簡單反轉錄病毒中，一個群體的新合成的反轉錄病毒RNA保持未剪接，以用作基因組RNA并作為gag和pol的mRNA。另一群體進行剪接，將基因組RNA的5’部分融合至下游基因，最常見為env。用位于gag上游的剪接供體和pol3’末端附近的剪接受體完成剪接。在剪接供體和剪接受體之間、通過剪接去除的內(nèi)含子含有gag和pol基因。這一剪接事件產(chǎn)生包膜(Env)蛋白的mRNA。所述剪接供體通常位于gag上游，但在諸如ASLV的某些病毒中，剪接供體位于gag基因中的少數(shù)密碼子，產(chǎn)生第一Env翻譯產(chǎn)物，包括與Gag共同的少數(shù)氨基末端氨基酸殘基。Env蛋白在膜結合多核糖體上合成，并通過細胞的囊泡輸運轉運至質膜，在此它被加入病毒顆粒中。
復雜的反轉錄病毒既產(chǎn)生單剪接轉錄物，也產(chǎn)生多剪接轉錄物，它們不僅編碼env基因產(chǎn)物，而且編碼數(shù)組這些病毒獨特的調(diào)節(jié)蛋白和輔助蛋白。復雜的反轉錄病毒諸如慢病毒，尤其是HIV，提供了在反轉錄病毒感染期間可能發(fā)生的可變剪接復雜性的突出實例。例如，現(xiàn)在已知，HIV—1能夠通過亞適剪接，由最初的基因組轉錄物產(chǎn)生30種以上的不同mRNA。由于破壞競爭性剪接受體的突變可以引起剪接模式的變化，并且可以影響病毒的感染性，因此看來這種選擇過程受到調(diào)節(jié)(Purcell和Martin 1993 J Virol 676365—6378)。
在受感染細胞中，全長RNA和亞基因組大小RNA的相對比例是變化的，在反轉錄病毒基因表達期間，這些轉錄物水平的調(diào)節(jié)是潛在的控制步驟。對于反轉錄病毒基因的表達，未剪接RNA和剪接的RNA均必須轉運到胞質，并且必須維持剪接的和未剪接的RNA的合適比例，以有效地進行反轉錄病毒的基因表達。不同類別的反轉錄病毒已經(jīng)進化出對該問題的不同解決方法。僅使用全長和單剪接RNA的簡單反轉錄病毒，或者利用不定的有效剪接位點，或者通過在其基因組中加入幾種僅部分限定的順式作用元件，來調(diào)節(jié)這些種類的胞質比率。既指導單剪接RNA的合成、也指導多剪接RNA的合成的復雜反轉錄病毒，通過RNA上的序列與輔助基因之一(諸如HIV—1中的rev和HTLV—1中的rex)的蛋白產(chǎn)物相互作用，來調(diào)節(jié)不同基因組和亞基因組大小的RNA種類的轉運和可能的剪接。
關于結構基因gag、pol和env本身以及略微更詳細的細節(jié)，gag編碼病毒的內(nèi)部結構蛋白。Gag被蛋白水解加工為成熟蛋白MA(基質)、CA(殼體)和NC(核殼)。pol基因編碼反轉錄酶(RT)，RT含有DNA聚合酶和相關的RNA酶H兩者的活性，pol基因還編碼整合酶(IN)，IN介導基因組的復制。env基因編碼病毒體的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它們形成與細胞受體蛋白特異性相互作用的復合物。這種相互作用最終導致病毒膜與細胞膜的融合。
Env蛋白是覆蓋病毒顆粒并在允許病毒進入靶細胞中起主要作用的病毒蛋白。反轉錄病毒的包膜糖蛋白復合物包括兩種多肽一種外部的糖基化親水多肽(SU)和一種跨膜蛋白(TM)。這些蛋白一起形成病毒體表面上的寡聚“隆起(knob)”或“隆起的刺突”。兩種多肽均由env基因編碼，并以多肽前體形式合成，多肽前體在其轉運至細胞表面期間被蛋白水解切割。盡管未切割的Env蛋白能夠結合于所述受體，但切割事件本身對激活該蛋白的融合潛力是必需的，這對于病毒進入宿主細胞是必需的。通常，SU和TM蛋白均于多個位點糖基化。然而，在某些病毒中，例如MLV，TM不被糖基化。
盡管SU和TM蛋白本身不總是有包膜病毒體顆粒裝配所需的，但它們在進入過程中起重要作用。在該方面，SU域結合于靶細胞上的受體分子，通常是特定的受體分子。據(jù)信這一結合事件激活TM蛋白的膜融合誘導潛力，此后病毒膜和細胞膜融合。在某些病毒中，特別是MLV，人們認為導致TM胞質尾的短部分去除的切割事件在暴露該蛋白全部融合活性中起關鍵作用(Brody等1994 J Virol 684620—4627；Rein等1994 J Virol 681773—1781)。TM跨膜區(qū)段遠側的該胞質“尾”仍在病毒膜內(nèi)側上，在不同的反轉錄病毒中其長度顯著不同。
因此，SU／受體相互作用的特異性可以限定反轉錄病毒的宿主范圍和組織嗜性。在某些情況下，這種特異性可能限制重組反轉錄病毒載體的轉導潛力。這里，轉導包括用病毒載體將非病毒基因傳遞至靶細胞的過程。因此，許多基因治療試驗使用MLV。具有稱為4070A的包膜蛋白的特定MLV被稱為兼嗜性病毒，它也可以感染人細胞，因為其包膜蛋白與人和小鼠之間保守的磷酸轉運蛋白“對接”。這種轉運蛋白是普遍存在的，因此這些病毒能夠感染許多細胞類型。然而，在某些情況下，尤其從安全的角度來看，它可能對特異性導向限定的細胞有益。為此，幾個研究小組已經(jīng)工程改造了一種小鼠親嗜性反轉錄病毒，這種反轉錄病毒不同于相對正常地僅感染小鼠細胞的其兼嗜性病毒，而是特異性地感染特定的人細胞。用紅細胞生成素區(qū)段取代Env蛋白的片段，產(chǎn)生重組反轉錄病毒，該反轉錄病毒則特異性地結合至在其表面表達紅細胞生成素受體的人細胞，諸如紅細胞前體(Maulik和Patel 1997“Molecular BiotechnologyTherapeutic Applicationsand Strategies”1997 Wiley—Liss Inc．第45頁)。
除gag、pol和env外，復雜的反轉錄病毒也含有“輔助”基因，它們編碼輔助蛋白。輔助蛋白定義為由通常的復制基因或結構基因gag、pol和env編碼的蛋白以外的、由輔助基因編碼的蛋白。這些輔助蛋白不同于參與基因表達調(diào)節(jié)的蛋白，如由tat、rev、tax和rex編碼的蛋白。輔助基因的實例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef中的一個或多個。這些輔助基因可以發(fā)現(xiàn)于例如HIV中(參見例如“Retroviruses”Coffin等編輯，Pub．CSHL 1997的第802和803頁)。非必需輔助蛋白可以在特化的細胞類型中起作用，提供與由細胞蛋白提供的功能至少部分重復的功能。通常，輔助基因位于pol和env之間，恰好在env下游，包括LTR的U3區(qū)或env和每種其它基因的重疊部分。
復雜的反轉錄病毒已經(jīng)進化出調(diào)節(jié)機制，所述調(diào)節(jié)機制使用病毒編碼的轉錄激活蛋白以及細胞轉錄因子。這些反式作用的病毒蛋白用作由LTR指導的RNA轉錄的激活蛋白。慢病毒的轉錄反式激活蛋白由病毒tat基因編碼。Tat結合于穩(wěn)定的稱為TAR的莖—環(huán)RNA二級結構，其一種功能是使Tat明顯最佳定位，以反式激活轉錄。
如早前所述，已經(jīng)提議將反轉錄病毒作為傳遞系統(tǒng)(要不然作為傳遞載體進行表達)，特別是將NOI或多個NOI傳遞至一個或多個目的位點。這種轉移可以在體外、活體外或體內(nèi)發(fā)生，或是它們的組合。當以該方式使用時，反轉錄病毒通常稱為反轉錄病毒載體或重組反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體已經(jīng)被用來研究反轉錄病毒生活周期的各個方面，包括受體使用、反轉錄和RNA包裝(由Miller綜述，1992 CurrTop Microbiol Immunol 1581—24)。
在用于基因治療的典型的重組反轉錄病毒載體中，可以從病毒除去gag、pol和env蛋白編碼區(qū)中的一種或多種的至少一部分。這使得反轉錄病毒載體為復制缺陷型。除去的部分甚至可以用一種NOI取代，以便產(chǎn)生能夠將其基因組整合入宿主基因組的病毒，但其中修飾的病毒基因組由于缺乏結構蛋白而本身不能繁殖。當整合入宿主基因組中時，發(fā)生所述NOI的表達，產(chǎn)生例如治療和／或診斷效應。因此，通常通過將NOI整合入重組病毒載體中；將修飾的病毒載體包裝入病毒體外殼中；并允許轉導目的位點，諸如靶細胞或靶細胞群體，而達到將所述NOI轉移至目的位點。
繁殖并分離大量的反轉錄病毒載體(例如制備合適滴度的反轉錄病毒載體)，通過采用包裝細胞系或輔助細胞系和重組載體的組合，用于后續(xù)的例如目的位點的轉導，這是可能的。
在某些情況下，繁殖和分離可能需要將反轉錄病毒的gag、pol和env基因分離，并將其分別引入宿主細胞中，以產(chǎn)生“包裝細胞系”。所述包裝細胞系產(chǎn)生包裝反轉錄病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi區(qū)而導致不能包衣殼。然而，當將攜帶NOI和psi區(qū)的重組載體引入包裝細胞系時，所述輔助蛋白可以包裝psi陽性重組載體，產(chǎn)生重組病毒原種。這可以用來轉導細胞，以將所述NOI引入細胞基因組中。其基因組缺乏制造病毒蛋白所需的所有基因的重組病毒，僅可以轉導一次，并且不能繁殖。這些僅能轉導一輪靶細胞的病毒載體被稱為復制缺陷型載體。因此，將所述NOI引入宿主／靶細胞基因組，而不產(chǎn)生潛在有害的反轉錄病毒。在“Retroviruses”(1997 Cold Spring HarbourLaboratory Press編輯JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第449頁)中概述了可用的包裝系。
已經(jīng)發(fā)展了反轉錄病毒包裝細胞系的設計，以解決特別是早先設計所通常遇到的自發(fā)產(chǎn)生輔助病毒的問題。因為同源性大大促進重組，所以降低或消除該載體和輔助病毒基因組之間的同源性已經(jīng)減少了輔助病毒產(chǎn)生的問題。新近，已經(jīng)研制出包裝細胞，其中在獨立轉染入包裝細胞系的分離的表達質粒中攜帶gag、pol和env病毒編碼區(qū)，使得野生型病毒的產(chǎn)生需要三次重組事件。這降低了可復制病毒產(chǎn)生的潛力。該策略有時稱為三質粒轉染法(Soneoka等1995 Nucl．Acids Res．23628—633)。
當研制載體時，瞬時轉染也可以用來測量載體的產(chǎn)生。在該方面，瞬時轉染避免了產(chǎn)生穩(wěn)定的載體生產(chǎn)細胞系所需的較長時間，如果該載體或反轉錄病毒包裝組分對細胞有毒性，則使用瞬時轉染。通常用來產(chǎn)生反轉錄病毒載體的組分包括編碼Gag／pol蛋白的質粒、編碼Env蛋白的質粒和含有NOI的質粒。載體的產(chǎn)生包括將這些組分中的一種或多種瞬時轉染入含其它所需組分的細胞中。如果該載體編碼有毒基因或編碼干擾宿主細胞復制的基因，諸如細胞周期抑制劑或誘導細胞凋亡的基因，則可能難以產(chǎn)生穩(wěn)定的載體生產(chǎn)細胞系，但瞬時轉染可以用來在細胞死亡之前產(chǎn)生所述載體。此外，利用瞬時轉染，已經(jīng)開發(fā)出產(chǎn)生的載體滴度水平與得自穩(wěn)定的載體生產(chǎn)細胞系的水平相當?shù)募毎迪?Pear等1993，Proc Natl Acad Sci 908392—8396)。
某些HIV蛋白的毒性，可能使得難以產(chǎn)生穩(wěn)定的基于HIV的包裝細胞，由于這種毒性，通常通過載體和輔助病毒的瞬時轉染制備HIV載體。某些工作者甚至已經(jīng)用水泡性口膜炎病毒(VSV)的Env蛋白取代HIV的Env蛋白。VSV Env蛋白的插入促進載體的濃縮，因為通過瞬時轉染，已經(jīng)產(chǎn)生滴度為5×105(濃縮后為108)的HIV／VSV—G載體(Naldini等1996 Science 272263—267)。因此，HIV載體的瞬時轉染可以提供有用的策略，以產(chǎn)生高滴度的載體(Yee等1994 PNAS．919564—9568)。
關于載體的滴度，反轉錄病毒載體的實際使用主要受以下因素的限制在體外培養(yǎng)物中可以獲得的轉導顆粒滴度(通過不超過108顆粒／ml)和許多有包膜病毒對用于濃縮和純化病毒的常規(guī)生化和物化技術的敏感性。
作為實例，已經(jīng)開發(fā)了幾種濃縮反轉錄病毒載體的方法，包括使用離心(Fekete和Cepko 1993 Mol Cell Biol 132604—2613)、中空纖維過濾(Paul等1993 Hum Gene Ther 4609—615)和切向流過濾(Kotani等1994Hun Gene Ther 519—28)。盡管可以達到將病毒滴度提高20倍，但反轉錄病毒的Env蛋白的相對脆性限制了濃縮反轉錄病毒載體的能力，且濃縮該病毒通常導致感染性病毒體的回收差。盡管如上所述，通過用更穩(wěn)定的VSV—G蛋白取代反轉錄病毒的Env蛋白可以克服該問題，這允許以更好的得率更有效地濃縮載體，但其缺點是VSV—G蛋白對細胞的毒性相當大。
盡管用目前可利用的載體可獲得107cfu／ml的無輔助病毒載體的滴度，但通常可以用滴度低得多的載體貯液進行試驗。然而，由于實用原因，需要高滴度的病毒，尤其是當必須感染大量的細胞時。另外，轉導大百分率的某些細胞類型需要高滴度。例如，人造血祖細胞感染的頻率主要取決于載體的滴度，僅用滴度非常高的貯液才能發(fā)生有用頻率的感染(Hock和Miller 1986 Nature 320275—277；Hogge和Humphries 1987 Blood 69611—617)。在這些情況下，僅僅將所述細胞暴露于大體積的病毒以補償?shù)筒《镜味仁遣粔虻?。相反，在某些情況下，感染性載體病毒體的濃度對于促進有效的轉導可能是關鍵性的。
研究人員正在嘗試產(chǎn)生高滴度的載體以用于基因傳遞。作為實例，已經(jīng)證明不同載體設計的比較，可用來幫助限定高滴度病毒產(chǎn)生所需的必需元件。關于不同反轉錄病毒載體設計的早期工作表明，幾乎所有的MLV內(nèi)部蛋白編碼區(qū)均可以缺失，而不消除該載體的感染性(Miller等1983 Proc Natl Acad Sci 804709—4713)。這些早期載體僅保留env編碼區(qū)3’端的小部分。后續(xù)的工作已經(jīng)表明，所有的env基因編碼序列均可以去除，而不會進一步降低載體的滴度(Miller和Rosman1989 Biotechnique 7980—990；Morgenstern和Land 1990 Nucleic AcidsRes 183587—3596)。僅病毒LTR和連接所述LTR、包括正鏈和負鏈DNA引發(fā)所需區(qū)段和將病毒RNA選擇性包裝入病毒體所需的區(qū)(psi位點；Mann等1983 Cell 33153—159)在內(nèi)的短區(qū)域，被認為是載體傳遞必需的。盡管如此，用這些早期載體獲得的病毒滴度仍低于親代輔助病毒滴度的約10倍。
其它試驗表明，gag基因5’端序列的保留顯著提高病毒載體的滴度，這是因為將病毒RNA包裝入病毒體中的包裝效率提高(Armentano等1987 J Virol 611647—1650；Bender等1987 J Virol 611639—1646；Adam和Miller 1988 J Virol 623802—3806)。這種效應不是因為由該載體的gag區(qū)合成病毒蛋白，而是因為gag讀框破壞或gag的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子已經(jīng)對載體的滴度無影響(Bender等1987出處同上)。這些試驗證明，將基因組RNA有效包裝入MLV所需的序列比先前通過缺失分析限定的psi信號大(Mann等1983出處同上)。為了獲得高滴度(106至＞107)，已表明在反轉錄病毒載體中包括這種稱為psi+(psiplus)的較大的信號是重要的?，F(xiàn)在已經(jīng)證明，該信號從所述剪接供體上游跨越至gag起始密碼子下游(Bender等1987出處同上)。因為該信號的位置而使得在剪接的env表達轉錄物中該信號缺失。這確保僅含有病毒生活周期的所有三種必需基因的全長轉錄物被包裝。
除在提高載體滴度方面操作所述反轉錄病毒載體外，也已經(jīng)設計了反轉錄病毒載體，以誘導在轉導的細胞中產(chǎn)生特定的NOI(通常為標記蛋白)。正如已經(jīng)提及的，最常用的反轉錄病毒載體設計包括用一種或多種NOI取代反轉錄病毒序列，以產(chǎn)生復制缺陷型載體。這種最簡單的方法是使用所述反轉錄病毒5’LTR中的啟動子，來控制編碼NOI的cDNA的表達，或改變所述LTR的增強子／啟動子，以提供組織特異性表達或誘導性?；蛘?，已經(jīng)通過用在啟動子選擇中提供更大靈活性的內(nèi)部啟動子表達了單一的編碼區(qū)。
當所述NOI為選擇標記時，如在次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hprt)的情況下，最容易實現(xiàn)表達目的基因的這些策略(Miller等1983Proc Natl Acad Sci 804709—4713)，這便于載體轉導的細胞的選擇。如果該載體含有不是選擇標記的NOI，則可以通過與存在于分離的質粒上的選擇標記共轉染，將該載體引入包裝細胞。該策略對于基因治療有吸引力的優(yōu)點是在最終的靶細胞中表達單一的蛋白，并且避免了選擇標記的可能毒性和抗原性。然而，當所插入的基因不可選擇時，該方法的缺點是更難以產(chǎn)生生產(chǎn)高滴度載體貯液的細胞。另外，通常更難以測定該載體的滴度。
目前用來設計表達兩種或兩種以上蛋白的反轉錄病毒載體的方法，依賴于三種通用的策略。這些策略包括(ⅰ)由一種啟動子轉錄的可變剪接的mRNA表達不同的蛋白；(ⅱ)使用5’LTR中的啟動子和內(nèi)部啟動子，驅動不同cDNA的轉錄，和(ⅲ)使用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)元件，以允許由或者單一mRNA或者由可以從一個可讀框表達的融合蛋白翻譯多個編碼區(qū)。
含內(nèi)部啟動子的載體已經(jīng)廣泛用來表達多個基因。一種內(nèi)部啟動子使得利用非病毒LTR的啟動子／增強子組合來驅動基因表達成為可能。多個內(nèi)部啟動子可以包括在反轉錄病毒載體中，且已經(jīng)證明可以分別由來自其自身的啟動子表達至少三種不同的cDNA(Overell等1988 Mol Cell Biol 81803—1808)。
盡管現(xiàn)在有許多這類修飾的反轉錄病毒載體可以用于在多種哺乳動物細胞中表達NOI，但大多數(shù)這些反轉錄病毒載體衍生自不能轉導非分裂細胞的簡單的反轉錄病毒，諸如鼠類致癌反轉錄病毒。
作為實例，廣泛使用的利用可變剪接以由病毒LTR SV(X)(Cepko等1984 Cell 371053—1062)表達基因的載體，含有新霉素磷酸轉移酶基因作為選擇標記。這類類型載體的模型是親代病毒MO—MLV，在該病毒中Gag和Gag—Pol蛋白由全長病毒mRNA翻譯，而Env蛋白由剪接的mRNA產(chǎn)生。由該載體編碼的其中一種蛋白由全長RNA翻譯，而將5’LTR附近的剪接供體恰好連接于第二基因上游的剪接受體的剪接作用產(chǎn)生一種RNA，由該RNA可以翻譯第二基因產(chǎn)物。該策略的一個缺點是將外源序列插入剪接的基因的內(nèi)含子中。這可以影響剪接RNA與未剪接RNA之比，或提供干擾編碼第二基因產(chǎn)物的剪接RNA產(chǎn)生的可變剪接受體(Korman等1987 Proc Natl Acad Sci 842150—2154)。因為這些效應是不可預測的，所以它們可能影響所編碼基因的生產(chǎn)。
其它修飾的反轉錄病毒載體可以根據(jù)剪接能力分為兩類。
第一類修飾的反轉錄病毒載體含有剪接供體內(nèi)的、抑制病毒轉錄物剪接的突變(GT至GC)，其典型為pBABE載體(Morgenstern等1990Nucleic Acid Reseasrch 183587—3596)。這種剪接抑制是有益的，原因有兩個首先，它確保所有的病毒轉錄物均含有包裝信號，并因此所有的病毒轉錄物均可以包裝入所述生產(chǎn)細胞。其次，它防止病毒剪接供體和所插入基因的可能的隱蔽剪接受體之間的潛在的異常剪接。
第二類修飾的反轉錄病毒載體含有功能性內(nèi)含子，其典型為N2(Miller等1989 Biotechniques 7980—990)和新近的MFG(Dranoff等1993Proc Natl Acad Sci 193979—3986)。這兩種載體均使用在包裝信號內(nèi)發(fā)現(xiàn)的正常的剪接供體。然而，它們各自的剪接受體(SA)不同。對于N2，SA發(fā)現(xiàn)于“延伸的”包裝信號內(nèi)(Bender等1987出處同上)。對于MFG，使用天然的SA(發(fā)現(xiàn)于pol內(nèi)，參見

圖1)。對于這兩種載體，已經(jīng)表明，剪接大大增強轉導細胞中的基因表達(Miller等1989出處同上；Krall等1996 Gene Therapy 337—48)。這類觀察支持先前的發(fā)現(xiàn)一般而言，剪接可以增強mRNA的翻譯(Lee等1981 Nature 294228—232；Lewis等1986 Mol Cell Biol 61998—2010；Chapman等1991 NucleicAcids Res 193979—3986)。對此，一個可能的原因是參與轉錄物剪接的相同機器可能也有助于將轉錄物輸出細胞核。
與上述修飾的反轉錄病毒載體不同，對能夠感染非分裂細胞的反轉錄病毒慢病毒系統(tǒng)中可變剪接的研究工作非常少(Naldini等1996Science 272263—267)。迄今為止，僅有的公開的慢病毒載體為衍生自HIV—1(Kim等1997 J Virol 72811—816)和FIV(Poeschla等1998 NatMed 4354—357)的慢病毒載體。這些載體仍含有病毒衍生的剪接供體和受體序列(Naldini等1996出處同上)。
一些研制用于基因傳遞的高滴度載體的替代方法包括使用(ⅰ)缺陷型病毒載體，諸如腺病毒、腺相關病毒(AAV)、皰疹病毒和痘病毒和(ⅱ)修飾的反轉錄病毒載體設計。
腺病毒是一種雙鏈線性DNA病毒，它不經(jīng)過RNA中間體。根據(jù)基因序列的同源性，將超過50種不同的人血清型腺病毒分為6個亞群。腺病毒的天然靶是呼吸道上皮和胃腸道上皮，一般僅產(chǎn)生輕度癥狀。血清型2和5(具有95％序列同源性)最常用于腺病毒載體系統(tǒng)中，通常與年輕人的上呼吸道感染相關。
腺病毒是無包膜的規(guī)則二十面體。典型的腺病毒包括140nm殼內(nèi)DNA病毒。二十面體對稱的該病毒由152個殼粒組成240個六鄰體和12個五鄰體。所述顆粒的核心含有36kb線性雙鏈體DNA，它于5’端與用作DNA復制引物的末端蛋白(TP)共價連接。所述DNA具有反向末端重復序列(ITR)，且其長度隨血清型而變化。
腺病毒進入細胞涉及一系列不同的事件。病毒通過病毒纖絲(37nm)和細胞上的纖絲受體的相互作用而附著于細胞。Ad2／5血清型的該受體最近已經(jīng)鑒定出，命名為CAR(Coxsackie和Adeno受體，Tomko等(1997 Proc Natl Acad Sci 943352—3358)。所述病毒通過細胞αvβ3和αvβ5整聯(lián)蛋白內(nèi)化入內(nèi)體，是由五鄰體—基質殼體蛋白(base capsidprotein)中的病毒GRD序列介導的(Wickham等，1993 Cell 73309—319)。內(nèi)化后，內(nèi)體通過稱為內(nèi)體裂解(endosomolysis)的過程破裂，據(jù)信這是由細胞αvβ5整聯(lián)蛋白優(yōu)先促進的事件(Wickham等1994 J CellBiol 127257—264)。另外，最近有證據(jù)表明，Ad5的纖絲隆起以高親和性結合于某些細胞類型表面上的1類MHC α2結構域，所述細胞類型包括上皮細胞和B原淋巴細胞(Hong等1997 EMBO 162294—2306)。
隨后，病毒易位至細胞核，在此發(fā)生早期區(qū)的激活，并且不久后進行DNA復制和晚期區(qū)的激活。腺病毒DNA的轉錄、復制和包裝需要宿主和病毒兩者的功能性蛋白機器。
病毒基因的表達可以分為早期(E)和晚期(L)。晚期定義為病毒DNA復制的開始。腺病毒結構蛋白一般在晚期合成。在腺病毒感染后，在大多數(shù)血清型病毒感染的細胞中，宿主細胞mRNA和蛋白的合成被抑制。腺病毒2和腺病毒5的腺病毒裂解循環(huán)非常有效，每個受感染細胞產(chǎn)生約10，000病毒體，并且合成過量的病毒蛋白和不加入病毒體中的DNA。腺病毒早期轉錄是一連串復雜的相關互連的生化事件，但它主要需要在DNA復制開始之前合成病毒RNA。
以下示意圖是腺病毒基因組的示意圖，顯示早期和晚期基因轉錄的相對方向和位置。 腺病毒基因組的結構在所有腺病毒群中是相似的，特定的功能一般位于所研究的每種血清型的相同位置。早期胞質信使RNA與病毒DNA上的四個限定的非相連區(qū)互補。這些區(qū)命名為E1—E4。早期轉錄物已經(jīng)分類為一系列的立即早期區(qū)(E1a)、延遲早期區(qū)(E1b、E2a、E2b、E3和E4)以及中間區(qū)(intermediate region)。
早期基因在感染后約6—8小時表達，由基因區(qū)段E1—4中的7個啟動子驅動。
E 1a區(qū)參與病毒基因和細胞基因的轉錄反式激活以及其它序列的轉錄阻抑。E1a基因對所有其它早期腺病毒信使RNA發(fā)揮重要的控制功能。在正常組織中，為了有效地轉錄E1b、E2a、E2b、E3或E4區(qū)，需要活性E1a產(chǎn)物。然而，可以繞過E1a功能。可以操作細胞，以提供E1a樣功能，或可以天然含有這類功能。也可以操作病毒以繞過E1a功能。病毒包裝信號與E1a增強子(194—358nt)重疊。
E 1b區(qū)影響病毒和細胞的代謝和宿主蛋白的關閉。也包括編碼pIX蛋白的基因(3525—4088nt)，包裝全長病毒DNA需要此蛋白，它對于病毒的熱穩(wěn)定性是重要的。感染晚期病毒事件的正常進程需要病毒E1b區(qū)。E1b產(chǎn)物在宿主細胞核中起作用。在E1b序列中產(chǎn)生突變的突變體表現(xiàn)出晚期病毒mRNA積累減少以及對腺病毒感染晚期正常觀察到的宿主細胞轉運的抑制的削弱。改變宿主細胞功能需要E1b，以使得加工和轉運的改變有利于病毒晚期基因產(chǎn)物。這些產(chǎn)物則導致病毒包裝并釋放病毒體。E1b產(chǎn)生防止細胞凋亡的19kD蛋白。E1b也產(chǎn)生結合于p53的55kD蛋白。關于腺病毒及其復制的綜述，參見WO96／17053。
E 2區(qū)是必需的，因為它編碼72 kDa DNA結合蛋白、DNA聚合酶和55kDa末端蛋白(TP)的80kDa前體，TP是蛋白引發(fā)以起始DNA合成所需的。
19kDa蛋白(gp 19K)在E3區(qū)中編碼，它與調(diào)節(jié)宿主對病毒的免疫應答有關。在感染的第一階段該蛋白的表達對TNFα應答而向上調(diào)節(jié)，該蛋白然后結合I類MHC抗原并防止該抗原遷移至上皮細胞表面，由此減少細胞毒T淋巴細胞對腺病毒感染的細胞的識別。在體外研究中E3區(qū)是不必要的，并且可以通過缺失1．9kb XbaI片段而被去除。
E 4區(qū)涉及減少宿主蛋白的合成并增加病毒的DNA復制。
有5個家族的晚期基因，所有這些晚期基因均從主要晚期啟動子起始。晚期基因的表達包括涉及RNA剪接的非常復雜的轉錄后控制機制。纖絲蛋白在L5區(qū)中編碼。腺病毒基因組鄰接反向末端重復序列，所述序列在Ad5中為103bp，并且是DNA復制所必需的。感染后30—40小時，完成病毒的生產(chǎn)。
通過缺失對E2、E3和E4啟動子的誘導重要的E1基因，可以轉變腺病毒，以用作基因轉移的載體。E1復制缺陷型病毒可以在反式提供E1多肽的細胞系中繁殖，所述細胞系諸如人胚腎細胞系293。可以通過重組，插入一種或多種治療基因來取代E1基因。由或者E1啟動子或者異源啟動子驅動該基因的表達。
通過缺失某些或所有E4可讀框(ORF)，已經(jīng)研制出甚至更加減毒的腺病毒載體。然而，某些第二代載體看來不產(chǎn)生長期的基因表達，即使所述DNA似乎被保持。因此，看來一種或多種E4 ORF的功能可以增強來自病毒攜帶的至少某些病毒啟動子的基因表達。
制造缺陷更多的病毒的替代方法已經(jīng)將所述病毒完全“去內(nèi)臟”，僅保留病毒復制所需的末端重復?？梢杂玫谝淮o助病毒，在293細胞系中使“去內(nèi)臟的”或“無內(nèi)臟的”病毒生長至高滴度，但難以從輔助病毒中分離出“去內(nèi)臟的”載體。
有復制能力的腺病毒也可以用于基因治療。例如，可以將E1A基因插入第一代病毒中，使其處于腫瘤特異性啟動子的調(diào)節(jié)之下。理論上，在將病毒注射入腫瘤后，病毒可以在腫瘤中特異性地復制，但在周圍正常細胞中不復制。該類型的載體可以或者用來通過裂解直接殺傷腫瘤細胞，或者用來傳遞“自殺基因”，諸如單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV tk)，它可以在用丙氧鳥苷處理后殺傷受感染細胞和旁觀者細胞?；蛘撸瑑HE1b缺陷的腺病毒已經(jīng)特別在1期臨床試驗中用于抗腫瘤治療。由E1b編碼的多肽能夠阻斷p53介導的細胞凋亡，防止細胞對病毒感染應答而自殺。因此，在正常的非腫瘤細胞中，在缺乏E1b時，病毒不能阻斷細胞凋亡，并因此不能產(chǎn)生感染性病毒并傳播。在p53缺陷型腫瘤細胞中，E1b缺陷型病毒可以生長并傳播至相鄰的p53缺陷型腫瘤細胞，而不傳播至正常的細胞。再者，該類型的載體也可以用來傳遞諸如HSV tk的治療基因。
作為用于基因傳遞的載體，腺病毒提供優(yōu)于其它基因治療載體系統(tǒng)的優(yōu)點，原因如下它是雙鏈DNA無包膜病毒，能夠在體內(nèi)和體外轉導范圍廣泛的人類和非人類起源的細胞類型。這些細胞包括呼吸道上皮細胞、肝細胞、肌細胞、心肌細胞、滑膜細胞、初級乳房上皮細胞和有絲分裂后終末分化的細胞，諸如神經(jīng)元(也許重要的例外為某些淋巴樣細胞，包括單核細胞)。
腺病毒載體也能轉導非分裂細胞。對于諸如囊性纖維化、其中肺上皮中的受侵襲細胞更新率慢的疾病而言，這是非常重要的。事實上，正在進行的幾個試驗利用腺病毒介導的將囊性纖維化轉運蛋白(CFTR)轉移入受影響的囊性纖維化成年患者的肺臟中。
腺病毒已經(jīng)用作基因治療的載體，并用于表達異源基因。大(36千堿基)基因組可以容納至多8kb的外源插入DNA，并且能夠在互補細胞系中有效復制，產(chǎn)生至多1012的非常高的滴度。因此，腺病毒是研究基因在初級非復制型細胞中表達的最佳系統(tǒng)之一。
由腺病毒基因組表達病毒基因或外源基因，不需要復制型細胞。腺病毒載體通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞。一旦在細胞內(nèi)，腺病毒載體極少整合入宿主染色體中，而是在染色體外(獨立于宿主基因組)作為線性基因組在宿主細胞核中發(fā)揮作用。因此，使用重組腺病毒緩解了與隨機整合入宿主基因組中有關的問題。
人類惡性腫瘤與腺病毒感染無關。已經(jīng)研制出減毒的腺病毒株，并已經(jīng)作為活疫苗用于人類。
然而，目前的腺病毒載體在體內(nèi)治療應用方面有一些主要的限制。這些限制包括(ⅰ)瞬時基因表達—腺病毒載體一般保持為附加體并且不復制，使得它不能傳遞到隨后的子代，(ⅱ)因為它不能復制，所以靶細胞的增殖可能導致稀釋該載體，(ⅲ)產(chǎn)生針對腺病毒蛋白的免疫應答，使得甚至低水平表達腺病毒蛋白的細胞被破壞，以及(ⅳ)不能得到有效的治療指數(shù)，因為體內(nèi)的傳遞導致僅在一部分靶細胞中攝入該載體并表達所傳遞的基因。
如果將腺病毒的特征與反轉錄病毒／慢病毒的遺傳穩(wěn)定性結合，則所述腺病毒基本上可以用來轉導靶細胞，以成為可以穩(wěn)定感染相鄰細胞的瞬時反轉錄病毒生產(chǎn)細胞。
本發(fā)明設法提供新型反轉錄病毒載體。
具體地說，本發(fā)明設法提供能夠在一個或多個所需靶位點提供一種NOI或甚至多種NOI有效表達的新型反轉錄病毒載體。
本發(fā)明也設法提供一種用于制備高滴度載體病毒體的新系統(tǒng)，所述系統(tǒng)加入了體內(nèi)使用安全的特征，并能夠提供于一個或多個所需靶位點提供一種NOI或甚至多種NOI的有效表達。
按照本發(fā)明的第一方面，提供包含一個功能性剪接供體位點和一個功能性剪接受體位點的反轉錄病毒載體；其中所述功能性剪接供體位點和所述功能性剪接受體位點鄰接一個第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供體位點位于所述功能性剪接受體位點上游；其中所述反轉錄病毒載體衍生自反轉錄病毒原載體；其中所述反轉錄病毒原載體包含一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點的第一核苷酸序列(NS)和一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反轉錄病毒載體因所述反轉錄病毒原載體的反轉錄而形成。
按照本發(fā)明的第二方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述反轉錄病毒原載體包含一個反轉錄病毒包裝信號；并且其中所述第二NS位于所述反轉錄病毒包裝信號下游，使得可于主要靶位點阻止剪接。
按照本發(fā)明的第三方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述第二NS置于所述第一NOI下游，使得所述第一NOI能夠于主要靶位點表達。
按照本發(fā)明的第四方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述第二NS位于多克隆位點上游，使得可以插入一種或多種另外的NOI。
按照本發(fā)明的第五方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述第二NS為編碼免疫分子或其部分的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的第六方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述免疫分子為免疫球蛋白。
按照本發(fā)明的第七方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述第二NS為編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的第八方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述載體還包含一種功能性內(nèi)含子。
按照本發(fā)明的第九方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述功能性內(nèi)含子的定位使得它能夠將至少一種所述NOI的表達限于所需靶位點。
按照本發(fā)明的第十方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述靶位點為一種細胞。
按照本發(fā)明的第十一方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述載體或原載體衍生自鼠類致癌反轉錄病毒或慢病毒。
按照本發(fā)明的第十二方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述載體衍生自MMLV、MSV、MMTV、HIV—1或EIAV。
按照本發(fā)明的第十三方面，提供一種反轉錄病毒載體，其中所述反轉錄病毒載體為整合的原病毒。
按照本發(fā)明的第十四方面，提供可得自反轉錄病毒載體的反轉錄病毒顆粒。
按照本發(fā)明的第十五方面，提供用反轉錄病毒載體轉染或轉導的細胞。
按照本發(fā)明的第十六方面，提供用于醫(yī)學的反轉錄病毒載體或病毒顆?；蚣毎?。
按照本發(fā)明的第十七方面，提供一種反轉錄病毒載體或病毒顆?；蚣毎?，以用于生產(chǎn)將一種或多種NOI傳遞至有需要的靶位點的藥用組合物。
按照本發(fā)明的第十八方面，提供包括用反轉錄病毒載體或病毒顆粒轉染或轉導細胞或使用細胞的方法。
按照本發(fā)明的第十九方面，提供反轉錄病毒載體或病毒顆?；蚣毎膫鬟f系統(tǒng)，其中所述傳遞系統(tǒng)包含一種或多種非反轉錄病毒表達載體、腺病毒或質?；蛩鼈兊慕M合，以將一種NOI或多種NOI傳遞至第一靶細胞，所述傳遞系統(tǒng)還包含一種反轉錄病毒載體，以將一種或多種NOI傳遞至第二靶細胞。
按照本發(fā)明的第二十方面，提供一種反轉錄病毒原載體。
按照本發(fā)明的第二十一方面，提供一種功能性內(nèi)含子的用法，以將一種或多種NOI的表達限于所需靶細胞。
按照本發(fā)明的第二十二方面，提供應用反轉錄酶將第一NS從反轉錄病毒原載體的3’端傳遞至反轉錄病毒載體的5’端。
按照本發(fā)明的第二十三方面，提供用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細胞并在其中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞。
按照本發(fā)明的第二十四方面，提供一種雜種病毒載體系統(tǒng)，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體和／或所述第二病毒載體可得自或基于反轉錄病毒載體，最好是慢病毒載體。
按照本發(fā)明的第二十五方面，提供一種雜種病毒載體系統(tǒng)，其中所述慢病毒載體包含或能夠傳遞斷裂內(nèi)含子結構。
按照本發(fā)明的第二十六方面，提供一種慢病毒載體系統(tǒng)，其中所述慢病毒載體包含或能夠傳遞斷裂內(nèi)含子結構。
按照本發(fā)明的第二十七方面，提供一種腺病毒載體系統(tǒng)，其中所述腺病毒載體包含或能夠傳遞斷裂內(nèi)含子結構。
按照本發(fā)明的第二十八方面，提供基于或得自以下任何一種或多種實體的載體或質粒pE1sp1A、pCI—Neo、pElRevE、pE1HORSE3．1、pE1PEGASUS4、pCI—Rab、pE1Rab。
按照本發(fā)明的第二十九方面，提供能夠在靶細胞中差異表達NOI的反轉錄病毒載體。
本發(fā)明的另一方面包括用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細胞并在其中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體，而所述第二病毒載體可得自或基于反轉錄病毒載體，最好是慢病毒載體。
本發(fā)明的另一方面包括用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細胞并在其中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體，而所述第二病毒載體可得自或基于反轉錄病毒載體，最好是慢病毒載體；其中所述病毒載體系統(tǒng)包含一個功能性剪接供體位點和一個功能性剪接受體位點；其中所述功能性剪接供體位點和所述功能性剪接受體位點鄰接一個第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供體位點位于所述功能性剪接受體位點上游；其中所述反轉錄病毒載體衍生自反轉錄病毒原載體；其中所述反轉錄病毒原載體包含一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點的第一核苷酸序列(“NS”)和一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反轉錄病毒載體因所述反轉錄病毒原載體的反轉錄而形成。
最好是，所述反轉錄病毒原載體包含一個位于所述第二核苷酸序列上游的第三NS；其中所述第三NS能夠產(chǎn)生一個非功能性剪接供體位點。
所述反轉錄病毒載體最好還包含一個第二NOI；其中所述第二NOI位于所述功能性剪接受體位點下游。
所述反轉錄病毒原載體最好包含所述第二NOI；其中所述第二NOI位于所述第二核苷酸序列下游。
所述第二NOI或其表達產(chǎn)物最好是治療劑或診斷劑，或包含治療劑或診斷劑。
所述第一NOI或其表達產(chǎn)物最好是或包含一種或多種賦予可選擇性的因子(例如標記元件)、病毒必需元件或其部分或其組合。
所述第一NS最好位于反轉錄病毒原載體3’端或其附近；最好是其中所述3’端包含一個U3區(qū)和一個R區(qū)；并且最好其中所述第一NS位于所述U3區(qū)和所述R區(qū)之間。
所述反轉錄病毒原載體的U3區(qū)和／或所述第一NS最好包含為第三NOI的NS；其中所述NOI為轉錄控制元件、編碼序列或其部分的一種或多種。
所述第一NS最好可得自病毒。
所述第一NS最好為內(nèi)含子或其部分。
所述內(nèi)含子最好可得自SV40病毒的小t—內(nèi)含子。
所述載體組分最好受調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，所述載體組分由低氧調(diào)節(jié)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面，所述載體組分由四環(huán)素開／關系統(tǒng)調(diào)節(jié)。
因此，本發(fā)明提供利用反轉錄病毒載體的傳遞系統(tǒng)。
本發(fā)明傳遞系統(tǒng)的反轉錄病毒載體包含一個功能性剪接供體位點(“FSDS”)和一個功能性剪接受體位點(“FSAS”)，它們連接一個第一NOI。所述反轉錄病毒載體因反轉錄病毒原載體的反轉錄而形成，該反轉錄病毒原載體可以包含多個NOI。
當所述FSDS位于所述FSAS上游時，任何間插序列均能被剪接。通常，剪接去除間插或“內(nèi)含子”RNA序列，連接剩余的“外顯子”序列以提供連續(xù)的序列用于翻譯。
剪接過程圖可示于下 在該圖示中，Y代表因剪接而被去除的間插序列。
反轉錄病毒載體的天然剪接結構示于圖27a。已知載體的剪接結構示于圖27b。按照本發(fā)明的剪接結構示于圖27c。
按照本發(fā)明，如果所述FSDS位于所述FSAS下游，則剪接不能發(fā)生。
同樣，如果所述FSDS為非功能性剪接供體位點(NFSDS)和／或所述FSAS為非功能性受體受體位點(NFAS)時，則剪接不能發(fā)生。
NFSDS的一個實例是突變的FSDS，使得所述FSDS不再能夠被剪接機制識別。
按照本發(fā)明，每種NS均可以是任何合適的核苷酸序列。例如，每種序列可以是獨立的DNA或RNA—它們可以合成制備或可以用重組DNA技術制備，或可以從天然來源分離，或可以是它們的組合。所述序列可以是有義序列或反義序列?？梢杂卸喾N可以直接或間接地相互連接的序列或其組合。
按照本發(fā)明，每種NOI均可以是任何合適的核苷酸序列。例如，每種序列可以是獨立的DNA或RNA—它們可以合成制備或可以用重組DNA技術制備，或可以從天然來源分離，或可以是它們的組合。所述序列可以是有義序列或反義序列。可以有多種可以直接或間接地相互連接的序列或其組合。
所述第一NOI可以包括任何一種或多種以下選擇標記，所述選擇標記已經(jīng)成功地用于反轉錄病毒載體細菌新霉素和潮霉素磷酸轉移酶基因，它們分別賦予G418抗性和潮霉素抗性(Palmer等1987 ProcNatl Acid Sci 841055—1059；Yang等1987 Mol Cell Biol 73923—3928)；突變的小鼠二氫葉酸還原酶基因(dhfr)，它賦予對氨甲蝶呤抗性(Miller等1985 Mol Cell Biol 5431—437)；細菌gpt基因，它允許細胞在含霉酚酸、黃嘌呤和氨基蝶呤的培養(yǎng)基中生長(Mann等1983 Cell 33153—159)；細菌hisD基因，它允許細胞在無組氨酸但含組氨醇的培養(yǎng)基中生長(Danos和Mulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 856460—6464)；多種抗藥性基因(mdr)，賦予對多種藥物的抗性(Guild等1988 Proc Natl AcadSci 851595—1599；Pastan等1988 Proc Natl Acad Sci 854486—4490)和細菌賦予對嘌呤霉素或腐草霉素抗性的基因(Morgenstern和Land 1990Nucleic Acid Res 183587—3596)。
所有這些標記均為顯性選擇標記，并允許化學選擇表達這些基因的大多數(shù)細胞。β—半乳糖苷酶也可以認為是顯性標記；表達β—半乳糖苷酶的細胞可以通過采用熒光激活細胞分類器而被選擇。事實上，任何細胞表面蛋白均可以為已經(jīng)不制造所述蛋白的細胞提供選擇標記。通過采用抗所述蛋白的熒光抗體和細胞分類器，可以選擇表達所述蛋白的細胞。已經(jīng)包括在載體中的其它選擇標記包括hprt和HSV胸苷激酶，后者允許細胞在含次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基中生長。
所述第一NOI可以含有非編碼序列，例如反轉錄病毒包裝位點或使得所述第二NOI在所述原載體中無功能性的無義序列，但當它們通過剪接所述載體而被去除時，所述第二NOI顯露出，進行功能表達。
所述第一NOI也可以編碼病毒必需元件，諸如編碼Env蛋白的env，這可以降低生產(chǎn)系統(tǒng)的復雜度。作為實例，在腺病毒載體中，這允許所述反轉錄病毒載體基因組和包膜配置于單一的腺病毒載體中，并置于同一啟動子控制之下，由此提供更簡單的系統(tǒng)，并在所述腺病毒載體中留下更大的容納額外序列的容量。一方面，那些額外的序列可以是gag—pol盒本身。因此，在一個腺病毒載體中，人們可以生產(chǎn)反轉錄病毒載體顆粒。先前的研究(Feng等1997 Nature Biotechnology 15866)需要使用多個腺病毒載體。
如果所述反轉錄病毒組分包括一個env核苷酸序列，則全部或部分該序列可以任選地用另一env的全部或部分核苷酸序列取代，所述另一env核苷酸序列的實例諸如命名為4070A的兼嗜性Env蛋白或流感血細胞凝集素(HA)或水泡性口腔炎病毒G(VSV—G)蛋白。用異源env基因取代所述env基因，是稱為假型化的技術或策略的一個實例。假型化不是一種新現(xiàn)象，在WO—A—98／05759、WO—A—98／05754、WO—A—97／17457、WO—A—96／09400、WO—A—91／00047和Mebatsion等1997Cell 90，841—847中可以找到實例。
在一個優(yōu)選方面，已經(jīng)將本發(fā)明的反轉錄病毒載體假型化。在該方面，假型化可以提供一個或多個優(yōu)點。例如，用所述慢病毒載體，基于HIV的載體的env基因產(chǎn)物將限制這些載體，使其僅感染表達稱為CD4的蛋白的細胞。但如果這些載體中的所述env基因已經(jīng)用來自其它RNA病毒的env序列取代，則它們的感染范圍可能更廣(Verma和Somia 1997 Nature 389239—242)。作為實例，研究人員已經(jīng)用來自VSV的糖蛋白將基于HIV的載體假型化(Verma和Somia 1997出處同上)。
在另一替代方法中，所述Env蛋白可以是修飾的Env蛋白，諸如突變的或工程改造的Env蛋白?？梢灾圃煨揎椈蜻x擇修飾，以引入尋靶能力或降低毒性或用于另一目的(Valsesia—Wittman等1996 J Virol 702056—64；Nilson等1996 Gene Therapy 3280—6；Fielding等1998 Blood 91802和其中引用的參考文獻)。
合適的第二NOI編碼序列包括治療和／或診斷應用的序列，諸如但不限于編碼以下的序列細胞因子、趨化因子、激素、抗體、工程免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、酶、免疫共同刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、反義RNA、靶蛋白的反式顯性陰性突變體(transdominatnegative mutant)、毒素、條件毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白和生長因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶以及它們的衍生物(諸如具有結合的報道基團)。但包括這類編碼序列時，這類編碼序列通?？梢圆僮餍缘剡B接于合適的啟動子，所述啟動子可以是驅動核酶表達的啟動子、或是一種不同的啟動子或多種啟動子。
所述第二NOI編碼序列可以編碼融合蛋白或編碼序列的區(qū)段。
本發(fā)明反轉錄病毒載體可以用來將諸如前體藥物活化酶的第二NOI傳遞至腫瘤位點，以治療癌癥。在每種情況下，使用合適的前體藥物聯(lián)合合適的前體藥物活化酶治療所述個體(諸如患者)。合適的前體藥物結合所述載體給予。前體藥物的實例包括磷酸鬼臼亞乙苷(與堿性磷酸酶一起使用，Senter等1988 Proc Natl Acad Sci 854842—4846)；5—氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶一起使用，Mullen等1994 CancerRes．541503—1506)；阿霉素—N—對羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素—V酰胺酶一起使用，Kerr等1990 Cancer Immunol Immunother 31202—206)；對—N—雙(2—氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(與羧肽酶G2一起使用)；氨基甲酸頭孢菌素氮芥(與β—內(nèi)酰胺酶一起使用)；SR4233(與P450還原酶一起使用)；丙氧鳥苷(與HSV胸苷激酶一起使用，Borrelli等1988 ProcNatl Acad Sci 857572—7576)；與硝基還原酶一起使用的芥子前體藥物(Friedlos等1997 J Med Chem 401270—1275)和環(huán)磷酰胺(與P450一起使用，Chen等1996 Cancer Res 561331—1340)。
本發(fā)明的載體可以通過病毒或非病毒載體傳遞至靶位點。
正如本領域眾所周知的，載體是允許或促進一種實體從一種環(huán)境轉移至另一種環(huán)境的工具。并且作為實例，用于重組DNA技術的某些載體允許諸如DNA區(qū)段(諸如異源DNA區(qū)段，諸如異源cDNA區(qū)段)的實體轉移入靶細胞?？扇芜x地，一旦處于靶細胞中，所述載體則可以用來將異源DNA維持在所述細胞中，或可以用作DNA復制單位。用于重組DNA技術的載體實例包括質粒、染色體、人工染色體或病毒。
非病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于DNA轉染法。在此，轉染包括使用非病毒載體將基因傳遞至靶哺乳動物細胞的過程。
典型的轉染方法包括電穿孔、DNA生物發(fā)射(biolistics)、脂質介導的轉染、緊密(compacted)DNA介導的轉染、脂質體、免疫脂質體、脂轉染試劑、陽離子試劑介導的轉染、陽離子表面兩親物(CFA)(NatureBiotechnology 1996 14；556)和它們的組合物。
病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。其它的載體實例包括活體外傳遞系統(tǒng)，它們包括但不限于DNA轉染法，諸如電穿孔、DNA生物發(fā)射、脂質介導的轉染、緊密DNA介導的轉染。
本發(fā)明的載體傳遞系統(tǒng)可以包括在體外制備的一個第一載體，它編碼在體內(nèi)產(chǎn)生第二載體所必需的基因。
一種或多種所述第一病毒載體可以是多種不同的病毒載體，諸如反轉錄病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘病毒載體，或在多個第一病毒載體的情況下，它們可以是不同病毒起源的載體的混合物。無論在何種情況下，所述第一病毒載體均最好是缺陷型的，因為缺陷型載體不能獨立地復制。因此，它們能夠進入靶細胞并傳遞所述第二載體序列，但并不能復制以繼續(xù)進一步感染靶細胞。
在所述雜種病毒載體系統(tǒng)包含一種以上第一載體以編碼所述第二載體的情況下，兩種或所有三種第一載體將用來轉染或轉導第一靶細胞群體，通常是同時轉染或轉導。
最好有編碼所述第二病毒載體所有組分的單一的第一病毒載體。
優(yōu)選的單一或多個第一病毒載體是腺病毒載體。
用于本發(fā)明的腺病毒載體可以衍生自人腺病毒或通常不感染人類的腺病毒。所述載體最好衍生自2型腺病毒或5型腺病毒(Ad2或Ad5)、或小鼠腺病毒或鳥類腺病毒，諸如CELO病毒(Cotton等1993 JVirol 673777—3785)。所述載體可以是具有復制能力的腺病毒載體，但更優(yōu)選是缺陷型腺病毒載體。可以通過缺失病毒復制必需的一種或多種組分，使腺病毒載體為缺陷型。通常，每個腺病毒載體含有至少一個E1區(qū)的缺失。為了產(chǎn)生感染性腺病毒載體顆粒，通過使病毒在諸如人293細胞系的人胚胎成纖維細胞細胞系中傳代，可以互補這一缺失，其中293細胞系含有整合拷貝的Ad5的左邊部分，包括E1基因。異源DNA插入這類載體的容量至多可以為約7kb。因此，這類載體可以用來構建按照本發(fā)明的包含三種分離重組載體的系統(tǒng)，每種載體含有其中一個必需的轉錄單位以構建所述反轉錄病毒第二載體。
替代的腺病毒載體是本領域已知的，它們在其它腺病毒基因中含有進一步的缺失，這些載體也適用于本發(fā)明。這些第二代腺病毒載體中的數(shù)種已經(jīng)顯示免疫原性降低(例如E1+E2缺失Gorziglia等1996 JVirol 704173—4178；E1+E4缺失Yeh等1996 J Virol 70559—565)。延伸的缺失用來提供額外的克隆容量以將多個基因引入所述載體。例如已經(jīng)描述了25kb的缺失(Lieber等1996 J Virol 708944—8960)，也報道了缺失所有病毒基因的克隆載體(Fisher等1996 Virology 21711—22)，所述載體允許引入35kb以上的異源DNA。這類載體可以用來產(chǎn)生按照本發(fā)明的腺病毒第一載體，所述第一載體編碼用于構建所述反轉錄病毒第二載體的兩種或三種轉錄單位。
所述第二病毒載體最好是反轉錄病毒載體。通過在所述第一靶細胞中缺陷型病毒載體顆粒裝配和包裝的必需基因的表達，產(chǎn)生所述第二載體。因為該載體不能獨立復制，因而為缺陷型的。因此，一旦所述第二反轉錄病毒載體已經(jīng)轉導了一個第二靶細胞，則它不能通過復制而傳播至任何其它靶細胞。
術語“反轉錄病毒載體”通常包括能夠感染但本身不能復制的反轉錄病毒核酸。因此，它是復制缺陷型。反轉錄病毒載體通常包含一種或多種NOI，最好是非反轉錄病毒起源的NOI，以將其傳遞至靶細胞。反轉錄病毒載體也可以包含一個功能性剪接供體位點(FSDS)和一個功能性剪接受體位點(FSAS)，使得當所述FSDS位于所述FSAS上游時，任何間插序列均能夠被剪接。反轉錄病毒載體可以在U3區(qū)包含其它非反轉錄病毒序列，諸如非反轉錄病毒控制序列，一旦所述反轉錄病毒載體作為原病毒整合入靶細胞中時，所述U3區(qū)可以影響NOI的表達。所述反轉錄病毒載體不需要含有僅來自單一反轉錄病毒的元件。因此，按照本發(fā)明，可以具有可得自兩種或兩種以上不同反轉錄病毒或其它來源的元件。
術語“反轉錄病毒原載體”通常包括上述的反轉錄病毒載體基因組，但它包含一個能夠產(chǎn)生一個功能性剪接供體位點(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)和一個能夠產(chǎn)生一個功能性剪接受體位點(FSAS)的第二NS，使得所述第一NS位于所述第二NS下游，以致不能發(fā)生與所述第一NS和所述第二NS有關的剪接。當所述反轉錄病毒原載體反轉錄時，形成反轉錄病毒載體。
術語“反轉錄病毒載體顆?！笔侵赴b的反轉錄病毒載體，它最好能夠結合于靶細胞并進入靶細胞。如上討論的所述載體顆粒的組分可以相對于野生型反轉錄病毒進行修飾。例如，可以將所述顆粒的蛋白性外殼中的Env蛋白進行遺傳修飾，以便改變其尋靶特異性或完成某些其它所需功能。
本發(fā)明該方面的反轉錄病毒載體可以衍生自鼠類致癌反轉錄病毒，諸如MMLV、MSV或MMTV；或可以衍生自慢病毒，諸如HIV—1、EIAV；或可以衍生自另一反轉錄病毒。
可以將本發(fā)明的反轉錄病毒載體修飾，以使得所述反轉錄病毒的天然剪接供體位點無功能性。
術語“修飾”包括使所述天然剪接供體沉默或去除。所述剪接供體位點已去除的載體諸如基于MLV的載體，是本領域已知的。這種載體的一個實例是pBABE(Morgenstren等1990出處同上)。
可以由所述第一載體中DNA編碼的反轉錄病毒載體生產(chǎn)的必需基因的表達，產(chǎn)生所述第二載體。這類基因可以包括反轉錄病毒的gag—pol基因、有包膜病毒的env基因和含一種或多種治療或診斷NOI的缺陷型反轉錄病毒載體。所述缺陷型反轉錄病毒載體一般含有使得能進行反轉錄的序列、5’長末端重復序列(LTR)的至少一部分、3’LTR的至少一部分和包裝信號。
如果期望使所述第二載體為復制缺陷型，則所述第二載體可以由多個轉錄單位編碼，所述轉錄單位可以位于單一的或位于兩種或兩種以上的腺病毒載體或其它第一載體中。因此，可能有編碼所述第二載體基因組的轉錄單位、編碼gag—pol的轉錄單位和編碼env的轉錄單位?；蛘?，可以結合兩種或多種這些轉錄單位。例如，編碼gag—pol和env或env和基因組的核酸序列，可以結合在單一轉錄單位中。完成這一點的方法是本領域已知的。
本文所述的轉錄單位為含編碼序列和完成這些編碼序列表達的信號的核酸區(qū)，其獨立于任何其它編碼序列。因此，每個轉錄單位通常包含包含至少一個啟動子、一個增強子和一個多腺苷酸化信號。
術語“啟動子”以本領域的正常含義使用，例如Jacob—Monod基因表達理論中的RNA聚合酶結合位點。
術語“增強子”包括結合于轉錄起始復合物的其它蛋白組分并由此促進由其相關啟動子指導的轉錄起始的DNA序列。
編碼第二載體的轉錄單位的啟動子和增強子最好在生產(chǎn)所述第二病毒載體的條件下，在所述第一靶細胞中有強活性，或能夠被強烈誘導。所述啟動子和／或增強子可以是組成型有效的，或其活性可以受組織限制或受時間限制。合適的組織限制啟動子／增強子的實例是在腫瘤細胞中有高活性的啟動子／增強子，諸如來自MUCl基因、CEA基因或5T4抗原基因的啟動子／增強子。時間限制的啟動子／增強子的實例是對局部缺血／或低氧應答的啟動子／增強子，諸如低氧效應元件或grp78或grp94基因的啟動子／增強子。一個優(yōu)選的啟動子—增強子組合是人巨細胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)啟動子／增強子組合。
其它優(yōu)選的額外組分包括能夠有效表達NOI或多個NOI的實體。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，有所述第二載體組分的低氧或局部缺血可調(diào)節(jié)表達。在該方面，低氧是在范圍廣泛的不同細胞類型中基因表達的有效的調(diào)節(jié)物，并通過誘導諸如低氧誘導型因子—1(HIF—1；Wang和Semenza 1993 Proc Natl Acad Sci 90430)的低氧誘導型轉錄因子的活性而起作用，低氧誘導型轉錄因子結合于同類的DNA識別位點，即各種基因啟動子上的低氧效應元件(HRE)。Dachs等(1997Nature Med 5515)已經(jīng)使用了多體形式的小鼠磷酸甘油激酶—1(PGK—1)基因的HRE(Firth等1994 Proc Natl Acad Sci 916496—6500)，來在體外控制對低氧應答的人纖維肉瘤細胞的標記基因和治療基因的表達，以及在體內(nèi)控制在實體瘤中的標記基因和治療基因的表達(Dachs等出處同上)?；蛘撸@著的葡萄糖缺乏也存在于腫瘤的局部缺血區(qū)的事實，能被用來在腫瘤中特異性地激活異源基因的表達。已知被葡萄糖缺乏特異性激活的grp78基因啟動子的截短的632個堿基對的序列，也顯示出能夠在體內(nèi)鼠類腫瘤中驅動高水平的報道基因的表達(Gazit等1995 Cancer Res．551660)。
調(diào)節(jié)這類組分表達的一個替代方法是如Yorshida等所述的使用Gossen和Bujard描述的四環(huán)素開／關系統(tǒng)(1992 Proc Natl Acad Sci 895547)來生產(chǎn)反轉錄病毒的gal、pol和VSV—G蛋白(1997 BiochemBiophys Res Comm 230426)。不尋常的是，該調(diào)節(jié)系統(tǒng)也用于本發(fā)明來控制所述原載體基因組的生產(chǎn)。這確保在缺乏四環(huán)素時沒有載體組分從所述腺病毒載體表達。
以下描述可以加入到所述雜種病毒載體系統(tǒng)的安全特征。可以存在一種或多種這類特征。
所述第二載體對于體內(nèi)應用也是有利的，因為將消除產(chǎn)生能夠獨立復制的感染性病毒的重組的可能性的一種或多種特征加入其中。在先前公開的研究中不包括這類特征(Feng等1997出處同上)。特別是，F(xiàn)eng等沒有描述由下述三種組分構建反轉錄病毒載體(出處同上)。
首先，通過缺失同源區(qū)，可以避免編碼所述第二載體組分的序列之間的序列同源性。同源區(qū)允許發(fā)生基因重組。在一個特定的實施方案中，用三種轉錄單位構建第二反轉錄病毒載體。第一轉錄單位含有在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的反轉錄病毒的gag—pol基因。第二轉錄單位含有在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的反轉錄病毒的env基因。第三轉錄單位包含在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的缺陷型反轉錄病毒基因組。在天然的反轉錄病毒基因組中，包裝信號的位置使得正確起作用需要部分gag序列。通常，當由其構建反轉錄病毒載體系統(tǒng)時，包括部分gag基因在內(nèi)的包裝信號仍在所述載體基因組中。然而，在本發(fā)明的情況下，所述缺陷型反轉錄病毒基因組含有基本包裝信號，它不包含與所述第一轉錄單位中的gag序列同源的序列。同樣外，在反轉錄病毒中，例如在莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)中，在pol編碼序列3’端和env 5’端之間有重疊小區(qū)。通過改變或者pol編碼序列3’端或者env 5’端的序列，以改變密碼子用法，而不改變所編碼蛋白的氨基酸序列，可以去除所述第一和第二轉錄單位之間的相應的同源性區(qū)域。
其次，通過用另一反轉錄病毒或另一有包膜病毒的Env蛋白將一種反轉錄病毒的基因組假型化，使得避免env組分和gag—pol組分之間的同源區(qū)，可以避免有復制能力的第二病毒載體的可能性。
在一個具體實施方案中，由以下三種組分構建所述反轉錄病毒載體第一轉錄單位含有非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的反轉錄病毒的gag—pol基因。第二轉錄單位含有在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的替代的有包膜病毒的env基因。第三轉錄單位包含在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的缺陷型反轉錄病毒基因組。所述缺陷型反轉錄病毒基因組含有基本包裝信號，它不含有與所述第一轉錄單位中的gag序列同源的序列。
第三，通過采用以特定方式構建的兩種轉錄單位，可以消除有復制能力的反轉錄病毒的可能性。第一轉錄單位含有在第一靶細胞中有活性的啟動子—增強子(諸如hCMV啟動子—增強子或組織限制啟動子—增強子)控制下的gag—pol編碼區(qū)。第二轉錄單位編碼能夠被包裝入反轉錄病毒顆粒中的反轉錄病毒基因組RNA。第二轉錄單位含有包裝、整合和反轉錄所必需的反轉錄病毒序列，也含有有包膜病毒的env蛋白編碼序列和一種或多種治療基因的編碼序列。
在該實施例中，設計所述env和NOI編碼序列的轉錄，使得所述Env蛋白優(yōu)先在第一靶細胞中生產(chǎn)，而所述NOI的表達產(chǎn)物優(yōu)先在第二靶細胞中生產(chǎn)。
一種合適的內(nèi)含子剪接布置在后面實施例5中進行了描述，并在圖17和圖27c中圖示。這里，在由所述第一載體傳遞至第一靶細胞的反轉錄病毒基因組序列中，剪接供體位點位于剪接受體位點下游。因此在第一靶細胞中不存在剪接，或很少發(fā)生剪接，所以所述Env將蛋白優(yōu)先表達。然而，一旦所述載體基因組已經(jīng)通過反轉錄過程并整合入第二靶細胞，則功能性剪接供體序列將位于5’LTR中，位于功能性剪接受體序列上游。發(fā)生剪接，將所述env序列剪接出，產(chǎn)生所述NOI的轉錄物。
在該實施例的第二布置中，所述NOI的表達限于第二靶細胞，并防止在第一靶細胞中表達，如下所述。該布置在后面的實施例6中描述，并圖示于圖18。在此，啟動子—增強子和含所述編碼序列5’端的NOI第一片段和天然或人工衍生或可衍生的剪接供體序列，被插入所述反轉錄病毒基因組構成物3’端R區(qū)的上游。含有完成所述編碼區(qū)所需的所有序列的所述NOI的第二片段，置于所述反轉錄病毒基因組構成物中包裝信號下游的天然或人工衍生或可衍生剪接受體序列的下游。反轉錄病毒基因組在第二靶細胞中反轉錄并整合時，所述NOI的啟動子’5片段和所述功能性剪接供體序列位于所述功能性剪接受體和所述NOI3’端上游。來自所述啟動子和剪接的轉錄，允許在第二靶細胞中翻譯所述NOI。
在一個優(yōu)選實施方案中，按照本發(fā)明的雜種病毒載體系統(tǒng)包含編碼反轉錄病毒第二載體的單一的或多個腺病毒第一載體。
描述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案解決一個與腺病毒載體和其它病毒載體有關的一個主要問題，即來自這類載體的基因表達是瞬時的。由第一靶細胞產(chǎn)生的反轉錄病毒顆?？梢赞D導第二靶細胞，在所述第二靶細胞中的基因表達穩(wěn)定地保持，因為所述反轉錄病毒載體基因組整合入宿主細胞基因組中。所述第二靶細胞不表達大量的病毒蛋白抗原，因此免疫原性低于用腺病毒載體轉導的細胞。
用反轉錄病毒載體作為所述第二載體是有利的，因為它例如通過允許導向快速分裂細胞，而允許一定程度的細胞辨別。此外，反轉錄病毒的整合允許在靶組織中穩(wěn)定表達治療基因，包括在增殖性靶細胞中的穩(wěn)定表達。
應用本發(fā)明的新型反轉錄病毒載體設計也是有利的，因為基因表達可以限于第一靶位點或第二靶位點。以該方式，單一的或多個NOI可以優(yōu)先于第二靶位點表達，而在第一靶位點表達差或不以生物學顯著水平表達。結果，可以避免NOI的可能毒性或抗原性。
優(yōu)選的是，所述第一病毒載體優(yōu)先轉導某種或某些細胞類型。
所述第一載體更優(yōu)選為定向載體，也就是說它與天然病毒相比組織嗜性改變，使得所述載體導向特定的細胞。
術語“定向載體”不必與術語“靶位點”或“靶細胞”關連。
“靶位點”是指天然或定向載體能夠轉染或轉導的位點。
“第一靶位點”是指天然或定向載體能夠轉染或轉導的第一位點。
“第二靶位點”是指天然或定向載體能夠轉染或轉導的第二位點。
“靶細胞”就是指是天然或定向載體能夠轉染或轉導的細胞。
“第一靶細胞”是指天然或定向載體能夠轉染或轉導的第一細胞。
“第二靶細胞”是指天然或定向載體能夠轉染或轉導的第二細胞。
按照本發(fā)明的優(yōu)選的腺病毒第一載體也最好是定向載體，其中所述載體的組織嗜性因改變而不同于野生型腺病毒。可以修飾腺病毒載體，以產(chǎn)生例如以下描述的定向腺病毒載體Krasnykh等1996 J．Virol706839—6846；Wickham等1996 J．Virol 706831—6838；Stevenson等1997 J．Virol 714782—4790；Wickham等1995 Gene Therapy 2750—756；Douglas等1997 Neuromuscul．Disord 7284—298；Wickham等1996Nature Biotechmology 141570—1573。
用于按照本發(fā)明的載體系統(tǒng)的第一靶細胞包括造血細胞(包括單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞或任何這些細胞的祖細胞)；內(nèi)皮細胞；腫瘤細胞；基質細胞；星形膠質細胞或神經(jīng)膠質細胞；肌細胞；和上皮細胞。
因此，能夠產(chǎn)生所述第二病毒載體的按照本發(fā)明的第一靶細胞可以是上述細胞類型中的任何一種。
在一個優(yōu)選的實施方案中，按照本發(fā)明的第一靶細胞是用一種缺陷型腺病毒載體轉導的單核細胞或巨噬細胞，所述缺陷型腺病毒載體含有用于反轉錄病毒gag—pol的第一轉錄單位和能夠產(chǎn)生可包裝缺陷型反轉錄病毒基因組的第二轉錄單位。在這種情況下，所述第二轉錄單位最好處于在機體內(nèi)患病位置中優(yōu)先有活性的啟動子—增強子的控制之下，其中所述患病位置諸如局部缺血位點或實體瘤的微環(huán)境。
在一個具體的優(yōu)先實施方案中，構建所述第二轉錄單位，使得將所述基因組插入所述第二靶細胞中時，產(chǎn)生一個內(nèi)含子，它用來降低病毒必需元件(諸如病毒env基因)的表達，并允許有效地表達一種或多種治療和／或診斷NOI。
所述包裝細胞可以是待治療個體機體內(nèi)的體內(nèi)包裝細胞，或它可以是在體外培養(yǎng)的細胞，諸如組織培養(yǎng)細胞系。合適的細胞系包括哺乳動物細胞，諸如鼠類成纖維細胞衍生的細胞系或人細胞系。所述包裝細胞系最好是人細胞系，諸如HEK293、293T、TE671、HT1080。
或者，所述包裝細胞可以是得自待治療個體的細胞，諸如單核細胞、巨噬細胞、血細胞或成纖維細胞。所述細胞可以從個體分離，活體外給予所述包裝組分和載體組分，然后再給予自身包裝細胞?；蛘?，可以將所述包裝組分和載體組分體內(nèi)給予所述包裝細胞。將反轉錄病毒的包裝組分和載體組分給予個體細胞的方法是本領域已知的。例如，一種方法是通過瞬時三重轉染(Landau和Littman 1992 J．Virol．66，511O；Soneoka等1995 Nucleic Acids Res 23628—633)，將產(chǎn)生反轉錄病毒顆粒所需的不同的DNA序列(例如env編碼序列、gag—pol編碼序列和缺陷型反轉錄病毒基因組)同時引入所述細胞。
所述第二病毒載體也可以是定向載體。對于反轉錄病毒載體，這可以通過修飾所述Env蛋白來完成。所述反轉錄病毒第二載體的Env蛋白需要是無毒的包膜或可以以無毒量在所述第一靶細胞中生產(chǎn)的包膜，諸如MMLV兼嗜性包膜或修飾的兼嗜性包膜。在這種情況下，所述安全特征最好是缺失反轉錄病毒組分之間同源的區(qū)域或序列。
所述包膜最好是允許轉導人細胞的包膜。合適的env基因的實例包括但不限于VSV—G、MLV兼嗜性env諸如4070Aenv、RD114貓白血病病毒env或流感病毒的血細胞凝集素(HA)。所述Env蛋白可以是能夠結合于數(shù)目有限的人類細胞類型上的受體的Env蛋白，可以是含有導向部分的工程包膜。由在所選擇的包裝細胞系中有活性的啟動子和任選增強子，轉錄所述env和gag—pol編碼序列，所述轉錄單位由一個多腺苷酸化信號終止。例如，如果所述包裝細胞是人類細胞，則合適的啟動子—增強子組合是來自人巨細胞病毒主要立即早期(hCMV—MIE)基因的啟動子—增強子，并可以使用來自SV40病毒的多腺苷酸化信號。其它合適的啟動子和多腺苷酸化信號是本領域已知的。
所述第二靶細胞群體可以與所述第一靶細胞群體相同。例如，將本發(fā)明的第一載體傳遞至腫瘤細胞，導致可以轉導其它腫瘤細胞的其它載體顆粒的復制和產(chǎn)生。
或者，所述第二靶細胞群體可以不同于所述第一靶細胞群體。在這種情況下，所述第一靶細胞用作被治療個體機體內(nèi)的內(nèi)源工廠，產(chǎn)生可以轉導所述第二靶細胞群體的另外的載體顆粒。例如，所述第一靶細胞群體可以是用所述第一載體體內(nèi)或活體外轉導的造血細胞。然后，將所述第一靶細胞傳遞至或遷移至機體內(nèi)諸如腫瘤的位點，并產(chǎn)生能夠轉導例如實體瘤中有絲分裂活性的腫瘤細胞的所述第二載體顆粒。
按照本發(fā)明的反轉錄病毒載體顆粒也將能夠轉導緩慢分裂的細胞和諸如MLV的非慢病毒不能有效轉導的細胞。緩慢分裂的細胞在約每3—4天內(nèi)分裂一次，包括某些腫瘤細胞。盡管腫瘤含有快速分裂的細胞，但某些腫瘤細胞尤其是腫瘤中心的某些細胞很少分裂?；蛘?，所述靶細胞可以是能夠經(jīng)歷細胞分裂的生長停滯的細胞，諸如腫瘤塊中心部分的細胞或干細胞，諸如造血干細胞或CD34陽性細胞。作為再一替代方法，所述靶細胞可以是分化細胞的前體，諸如單核細胞前體、CD33陽性細胞或骨髓前體。作為再一替代方法，所述靶細胞可以是分化細胞，諸如神經(jīng)元、星形膠質細胞、神經(jīng)膠質細胞、小膠質細胞、巨噬細胞、單核細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、精母細胞、精子細胞或精子?？梢曰蛘咴趶娜祟悅€體分離后在體外轉導靶細胞，或者在體內(nèi)直接轉導靶細胞。
本發(fā)明允許在隨后有效轉導第二靶細胞所需的一種或多種治療蛋白的作用位點或其附近，體內(nèi)定位產(chǎn)生高滴度的缺陷型反轉錄病毒載體顆粒。這比或者采用缺陷型腺病毒載體或者采用單獨的缺陷型反轉錄病毒載體更加有效。
本發(fā)明也允許體內(nèi)在非分裂細胞或緩慢分裂的細胞中產(chǎn)生諸如基于MMLV的載體的反轉錄病毒載體。僅在諸如體外增殖的適應于組織培養(yǎng)的細胞的快速分裂的細胞中，或在體內(nèi)的快速分裂的腫瘤細胞中，產(chǎn)生基于MMLV的反轉錄病毒載體，這在先前已經(jīng)是可能的。對于將基因傳遞至實體瘤的細胞(其許多實體瘤細胞分裂緩慢)而言，以及對于應用非分裂細胞(諸如內(nèi)皮細胞)和各種造血譜系細胞作為生產(chǎn)治療蛋白產(chǎn)物的內(nèi)源工廠而言，擴展能夠產(chǎn)生反轉錄病毒載體的細胞類型的范圍是有利的。
由按照本發(fā)明的載體系統(tǒng)傳遞一種或多種治療基因的方法可以單獨采用或結合其它治療或所述治療組分使用。
例如，本發(fā)明的反轉錄病毒載體可以用來傳遞可用于治療WO—A—98／05635中所列疾病的一種或多種NOI。為了易于參考，現(xiàn)在提供部分該表癌癥、炎癥和炎癥疾病、皮膚病、發(fā)熱、心血管效應、出血、血凝固和急性期反應、惡病質、厭食、急性感染、HIV感染、休克狀態(tài)、移植物抗宿主反應、自身免疫病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛和阿斯匹林依賴性抗血栓形成；腫瘤的生長、侵入和擴散、血管發(fā)生、轉移、惡性腹水和惡性胸膜滲漏；腦局部缺血、局部缺血性心臟病、骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、骨質疏松、哮喘、多發(fā)性硬化、神經(jīng)變性、早老性癡呆、動脈粥樣硬化、中風、脈管炎、節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎；牙周炎、齦炎；牛皮癬、特應性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮松解；角膜潰瘍、視網(wǎng)膜病和手術傷口愈合；鼻炎、過敏性結膜炎、濕疹、過敏反應；再狹窄、充血性心力衰竭、子宮內(nèi)膜異位、動脈粥樣硬化或endosclerosis。
另外，或在替代方法中，本發(fā)明的反轉錄病毒載體可以用來傳遞可用于治療WO—A—98／07859中所列疾病的一種或多種NOI。為了易于參考，現(xiàn)在提供部分該表細胞因子和細胞增殖／分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治療免疫缺陷，包括感染人免疫缺陷病毒；調(diào)節(jié)淋巴細胞的生長；治療癌癥和許多自身免疫病，以及預防移植排斥或誘導腫瘤免疫)；調(diào)節(jié)血生成，例如治療骨髓疾病或淋巴疾病；促進骨、軟骨、腱、韌帶和神經(jīng)組織的生長，例如用于使傷口愈合、治療燒傷、潰瘍和牙周病及神經(jīng)變性；抑制或激活促卵泡激素(調(diào)節(jié)生育力)；趨化活性(例如使特定的細胞類型移動至傷害位點或感染位點)；止血和溶解血栓活性(例如用于治療血友病和中風)；抗炎活性(用于治療例如膿毒性休克或節(jié)段性回腸炎)；作為抗微生物藥；例如代謝或行為的調(diào)節(jié)物；作為鎮(zhèn)痛藥；治療特定的缺陷疾?。挥糜谥委熇缗Ｆぐ_，用于人類或獸醫(yī)醫(yī)學領域。
另外，或在替代方法中，本發(fā)明的反轉錄病毒載體可以用來傳遞可用于治療WO—A—98／09985中所列疾病的一種或多種NOI。為了易于參考，現(xiàn)在提供部分該表巨噬細胞抑制活性和／或T細胞抑制活性和由此的抗炎活性；抗免疫活性，即對細胞免疫應答和／或體液免疫應答的抑制效應，包括與炎癥不相關的應答；抑制巨噬細胞和T細胞附著于細胞外基質組分和纖連蛋白的能力，以及向上調(diào)節(jié)T細胞中fas受體的表達；抑制不想要的免疫反應和炎癥，包括關節(jié)炎，包括類風濕性關節(jié)炎、與過敏性相關的炎癥、變態(tài)反應、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膠原疾病和其它自身免疫病、與動脈粥樣硬化相關的炎癥、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心搏停止、心肌梗塞、血管炎癥疾病、呼吸窘迫綜合征或其它心肺疾病、與消化性潰瘍、潰瘍性結腸炎和其它胃腸道疾病相關的炎癥、肝纖維變性、肝硬變或其它肝病、甲狀腺炎、或其它腺病、腎小球性腎炎、或其它腎病和泌尿學疾病、耳炎或其它耳鼻咽疾病、皮炎或其它皮膚病、牙周病或其它牙病、睪丸炎或附睪炎(epididimo—orchitis)、不育癥、睪丸創(chuàng)傷或其它與免疫相關的睪丸疾病、胎盤功能障礙、胎盤機能不全、習慣性流產(chǎn)、子癇、先兆子癇和其它與免疫和／或炎癥相關的婦科疾病、后色素層炎、中色素層炎、前色素層炎、結膜炎、脈絡膜視網(wǎng)膜炎、眼色素層視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)、視神經(jīng)炎、眼內(nèi)炎癥例如視網(wǎng)膜炎或囊性斑狀水腫(cystoid macular oedema)、交感性眼炎、鞏膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎、退行性fondus病的免疫和炎性組分、眼外傷的炎性組分、由感染引起的眼部炎癥、增生性玻璃體—視網(wǎng)膜病(vitreo—retinopathies)、急性局部缺血性視神經(jīng)病、例如在青光眼過濾手術后的過度瘢痕形成、針對眼植入物的免疫和／或炎性反應以及其它免疫和炎癥相關的眼病、與自身免疫病相關的炎癥或在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或任何其它器官中免疫和／或炎癥抑制將為有益的病癥或障礙、Parkinson病、由治療Parkinson病引起的并發(fā)癥／或副作用、與AIDS相關的癡呆綜合征、HIV相關的腦病、Devic病、Sydenham舞蹈病、早老性癡呆和CNS的其它退行性疾病、病癥或障礙、中風的炎性組分、小兒麻痹后綜合征、精神障礙的免疫和炎性組分、脊髓炎、腦炎、亞急性硬化性全腦炎、腦脊髓炎、急性神經(jīng)病、亞急性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病、Guillaim—Barre綜合征、Sydenham舞蹈病、重癥肌無力、腦假腫瘤、Down綜合征、Huntington病、肌萎縮性側索硬化、CNS壓迫或CNS外傷或CNS感染的炎性組分、肌肉萎縮和營養(yǎng)不良的炎性組分、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的與免疫和炎癥相關的疾病、病癥或障礙、外傷后炎癥、膿毒性休克、傳染病、手術的炎癥并發(fā)癥或副作用、骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和／或副作用、例如由于感染病毒載體引起的基因治療的炎癥和／或免疫并發(fā)癥和副作用、或與AIDS相關的炎癥、為了抑制或阻止體液和／或細胞免疫應答、為了通過減少單核細胞或淋巴細胞的量來治療或減輕單核細胞或白細胞增生性疾病例如白血病、在移植天然或人工細胞、組織或器官(諸如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然或人工皮膚組織)的情況下用于預防和／或治療移植排斥。
按照本發(fā)明還提供控制一種或多種治療NOI生產(chǎn)的方法，使得所述治療NOI優(yōu)先在第二靶細胞群體中表達，而在第一靶細胞中表達差或不以生物學顯著水平表達。
本發(fā)明也提供用于通過基因療法治療個體的藥用組合物，其中所述組合物包含治療有效量的本發(fā)明反轉錄病毒載體，所述反轉錄病毒載體包含一種或多種可傳遞治療和／或診斷NOI或由所述反轉錄病毒載體產(chǎn)生或可得自所述反轉錄病毒載體的病毒顆粒。所述藥用組合物可以用于人類或動物。通常，醫(yī)師會確定最適于個體受治療者的精確的劑量，所述劑量將隨特定個體的年齡、體重和反應而變化。
所述組合物可以可任選地包含藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔助劑。藥用載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可以根據(jù)計劃的給藥途徑和標準的藥物實踐來選擇。所述藥用組合物可以包含作為載體、賦形劑或稀釋劑的或除此之外的任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑和可以輔助或增加病毒進入靶位點的其它載體劑(諸如脂質傳遞系統(tǒng))。
合適時，所述藥用組合物可以通過以下任何一種或多種方式給予吸入；栓劑或子宮托形式；通常以洗劑、溶液劑、乳膏、軟膏或撒布粉劑(dusting powder)形式；通過使用皮膚貼劑；口服，為含賦形劑(諸如淀粉或乳糖)的片劑形式、或單獨的或結合賦形劑的膠囊或ovule形式、或含調(diào)味劑或著色劑的酏劑、溶液劑或懸浮液形式；或它們可以胃腸外注射，例如經(jīng)陰莖海綿體內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射。對于胃腸外給藥，所述組合物最好以無菌水溶液形式使用，所述水溶液可以含有其它物質，例如足夠的鹽或單糖，以使得溶液與血液等滲。對于頰或舌下給藥，所述組合物可以以用常規(guī)方法配制的片劑或錠劑形式給予。
在本發(fā)明的再一方面，提供一般意義(即不必限于以上限定的本發(fā)明的上述第一方面)的用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)系統(tǒng)包含一種或多種編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能感染第一靶細胞并在其中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞。
關于該具體實施方案，本發(fā)明的基因載體因此為用于基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，它能夠從靶細胞內(nèi)產(chǎn)生缺陷型感染性顆粒。因此，本發(fā)明的基因載體包括一種體外制造的第一載體，所述第一載體編碼體內(nèi)產(chǎn)生第二載體必需的基因。在應用中，所述第二載體攜帶一種或多種用于插入所述第二靶細胞的選定基因。所述選定基因可以是一種或多種標記基因和／或治療基因。標記基因編碼可選擇和／或可檢測蛋白。
以下是涉及本發(fā)明該特定方面的更多方面，所述內(nèi)容也可應用于本發(fā)明的上述方面。
另一方面，本發(fā)明提供用一種或多種所述第一病毒載體感染、并能夠產(chǎn)生感染性的第二病毒載體顆粒的靶細胞。
再一方面，本發(fā)明提供治療人類和非人類哺乳動物的方法，所述方法包括如本文所述的給予雜種病毒載體系統(tǒng)或用一種或多種所述第一病毒載體感染的靶細胞。
一種或多種所述第一病毒載體可以是多種不同的病毒載體，諸如反轉錄病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘病毒載體，或在多個第一病毒載體的情況下，它們可以是不同病毒起源的載體的混合物。無論在何種情況下，所述第一病毒載體均最好是缺陷型的，因為缺陷型載體不能獨立地復制。因此，它們能夠進入靶細胞并傳遞所述第二載體序列，但并不能復制以繼續(xù)感染其它靶細胞。
在所述雜種病毒載體系統(tǒng)包含一種以上編碼所述第二載體的第一載體的情況下，兩種或所有三種第一載體將用來感染第一靶細胞群體，通常是同時感染。最好有編碼所述第二病毒載體所有組分的單一的第一病毒載體。
優(yōu)選的單一或多種第一病毒載體是腺病毒載體。在可以從體外培養(yǎng)物獲得的滴度方面，腺病毒載體具有優(yōu)于其它病毒載體的顯著優(yōu)點。與有包膜病毒相比，所述腺病毒顆粒也比較穩(wěn)定，因此更容易純化和貯存。然而，目前的腺病毒載體用于體內(nèi)治療應用的主要限制，是由于來自缺陷型腺病毒載體的基因表達僅為瞬時的。因為所述載體基因組不復制，所述靶細胞的增殖導致稀釋所述載體。此外，針對腺病毒蛋白產(chǎn)生的免疫應答，破壞甚至低水平表達所述腺病毒蛋白的細胞。
所述第二病毒載體最好是反轉錄病毒載體。通過在所述第一靶細胞中缺陷型病毒載體顆粒裝配和包裝的必需基因的表達，產(chǎn)生所述第二載體。因為該載體不能獨立復制，因而為缺陷型的。因此，一旦所述第二反轉錄病毒載體已經(jīng)轉導了一個第二靶細胞，則它不能通過復制而傳播至任何其它靶細胞。
可以由所述第一載體中DNA編碼的反轉錄病毒載體生產(chǎn)的必需基因的表達，產(chǎn)生所述第二載體。這類基因可以包括反轉錄病毒的gag—pol基因、有包膜病毒的包膜基因和含一種或多種治療基因的缺陷型反轉錄病毒基因組。所述缺陷型反轉錄病毒基因組一般含有使得能進行反轉錄的序列、5’長末端重復序列(LTR)的至少一部分、3’LTR的至少一部分和包裝信號。
重要的是，所述第二載體對于體內(nèi)使用也是安全的，因為它加入了消除重組產(chǎn)生能獨立復制的感染性病毒的可能性的一種或多種安全特征。
為了確保所述第二載體為復制缺陷型的，可以用多個轉錄單位編碼所述第二載體，所述轉錄單位可以位于單一的或位于兩種或兩種以上腺病毒或其它第一載體中。因此，可以有一個轉錄單位編碼所述第二載體基因組、一個轉錄單位編碼gag—pol，而一個轉錄單位編碼env?；蛘?，可以組合兩種或多種這些轉錄單位。例如，編碼gag—pol和env、或env和所述基因組的核酸序列可以組合在一個單一轉錄單位中。完成這一點的方法是本領域已知的。
本文所述的轉錄單位為含編碼序列和完成那些編碼序列表達的信號的核酸區(qū)，其獨立于任何其它編碼序列。因此，每個轉錄單位一般包含至少一個啟動子、一個增強子和一個多腺苷酸化信號。編碼所述第二載體的轉錄單位的啟動子和增強子最好在生產(chǎn)所述第二病毒載體的條件下，在所述第一靶細胞中是強活性的，或能夠被強烈誘導。所述啟動子和／或增強子可以是組成型有效的，或其活性可以受組織限制或受時間限制。合適的組織限制啟動子／增強子的實例是在腫瘤細胞中有高活性的啟動子／增強子，諸如來自MUC1基因、CEA基因或5T4抗原基因的啟動子／增強子。時間限制的啟動子／增強子的實例是對局部缺血和／或低氧應答的啟動子／增強子，諸如低氧效應元件或grp78或grp94基因的啟動子／增強子。一個優(yōu)選的啟動子—增強子組合是人巨細胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)啟動子／增強子組合。
在某些環(huán)境下，第二載體組分的低氧或局部缺血可調(diào)節(jié)表達可能特別有用。低氧是在范圍廣泛的不同細胞類型中基因表達的強效的調(diào)節(jié)物，并通過誘導諸如低氧誘導型因子—1(HIF—1；Wang和Semenza1993 Proc．Natl．Acad．Sci USA 90430)的低氧誘導型轉錄因子的活性而起作用，低氧誘導型轉錄因子結合于同類的DNA識別位點，即各種基因啟動子上的低氧效應元件(HRE)。Dach等(1997 Nature Med 5515)已經(jīng)使用了多體形式的小鼠磷酸甘油激酶—1(PGK—1)基因的HRE(Firth等1994 Proc．Natl．Acad．Sci USA 916496—6500)，來在體外控制對低氧應答的人纖維肉瘤細胞的標記基因和治療基因的表達，以及在體內(nèi)控制在實體瘤中的標記基因和治療基因的表達(Dachs等出處同上)?；蛘?，顯著的葡萄糖缺乏也存在于腫瘤的局部缺血區(qū)的事實，能被用來在腫瘤中特異性地激活異源基因的表達。已知被葡萄糖缺乏特異性激活的grp78基因啟動子的截短的632個堿基對序列，也顯示出能夠在體內(nèi)在鼠類腫瘤中驅動高水平的報道基因的表達(Gazit等1995 CancerRes．551660)。
以下描述可以加入到所述雜種病毒載體系統(tǒng)的安全特征。可以存在一種或多種這類特征。
首先，通過缺失同源區(qū)，可以避免編碼所述第二載體組分的序列之間的序列同源性。同源區(qū)允許發(fā)生基因重組。在一個特定的實施方案中，用三種轉錄單位構建第二反轉錄病毒載體。第一轉錄單位含有在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的反轉錄病毒的gag—pol基因。第二轉錄單位含有在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的反轉錄病毒的env基因。第三轉錄單位包含在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的缺陷型反轉錄病毒基因組。在天然的反轉錄病毒基因組中，包裝信號的位置使得正確起作用需要部分gag序列。通常，當由其構建反轉錄病毒載體系統(tǒng)時，包括部分gag基因在內(nèi)的包裝信號仍在所述載體基因組中。然而，在本發(fā)明的情況下，所述缺陷型反轉錄病毒基因組含有基本包裝信號，它不合與所述第一轉錄單位中的gag序列同源的序列。此外，在反轉錄病毒中，例如在莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)中，在pol編碼序列3’端和env5’端之間有重疊小區(qū)。通過改變或者pol編碼序列3’端的序列或者env 5’端的序列，以改變密碼子用法，而不改變所編碼蛋白的氨基酸序列，可以去除所述第一和所述第二轉錄單位之間的相應的同源性區(qū)域。
其次，通過用另一反轉錄病毒或另一有包膜病毒的包膜蛋白將一種反轉錄病毒的基因組假型化，使得避免env組分和gag—pol組分之間的同源區(qū)，可以避免有復制能力的第二病毒載體的可能性。在一個具體實施方案中，由以下三種組分構建所述反轉錄病毒載體。第一轉錄單位含有在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的反轉錄病毒的gag—pol基因。第二轉錄單位含有在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的替代有包膜病毒的env基因。第三轉錄單位包含在非反轉錄病毒啟動子和增強子控制下的缺陷型反轉錄病毒基因組。所述缺陷型反轉錄病毒基因組含有基本包裝信號，它不含有與所述第一轉錄單位中的gag序列同源的序列。
假型化可能涉及例如基于慢病毒(諸如HIV或馬傳染性貧血病毒(EIAV))的反轉錄病毒基因組，所述包膜蛋白可以例如是命名為4070A的兼嗜性包膜蛋白?；蛘?，所述反轉錄病毒基因組可以基于MMLV，所述包膜蛋白可以是來自可以在所述第一靶細胞中以無毒量生產(chǎn)的另一病毒的蛋白，諸如流感血細胞凝集素或水泡性口腔炎病毒G蛋白。在另一替代方法中，所述包膜蛋白可以是修飾的包膜蛋白，諸如突變的或工程改造的包膜蛋白?？梢灾苽湫揎椈蜻x擇修飾，以引入尋靶能力或降低毒性或用于另一目的。
第三，通過采用以特定方式構建的兩種轉錄單位，可以消除有復制能力的反轉錄病毒的可能性。第一轉錄單位含有在第一靶細胞中有活性的啟動子—增強子(諸如hCMV啟動子—增強子或組織限制性啟動子—增強子)控制下的gag—pol編碼區(qū)。第二轉錄單位編碼能夠包裝入反轉錄病毒顆粒中的反轉錄病毒基因組RNA。第二轉錄單位含有包裝、整合和反轉錄所必需的反轉錄病毒序列，也含有有包膜病毒的env蛋白編碼序列和一種或多種治療基因的編碼序列。
在一個優(yōu)選實施方案中，按照本發(fā)明的雜種病毒載體系統(tǒng)包含單一或多種編碼反轉錄病毒第二載體的腺病毒第一載體。用于本發(fā)明的腺病毒載體可以衍生自人腺病毒或通常不感染人類的腺病毒。所述載體最好衍生自2型腺病毒或5型腺病毒(Ad2或Ad5)、或小鼠腺病毒或鳥類腺病毒，諸如CEL0病毒(Cotton等1993 J．Virol 673777—3785)。所述載體可以是具有復制能力的腺病毒載體，但更優(yōu)選缺陷型腺病毒載體?？梢酝ㄟ^缺失病毒復制必需的一種或多種組分，使腺病毒載體為缺陷型。通常，每個腺病毒載體含有至少一個E1區(qū)的缺失。為了產(chǎn)生感染性腺病毒載體顆粒，通過使病毒在諸如人293細胞系的人胚胎成纖維細胞細胞系中傳代，可以互補這一缺失，其中293細胞系含有整合拷貝的Ad5的左邊部分，包括E1基因。異源DNA插入到這類載體的容量可以至多為約7kb。因此，這類載體可以用來構建按照本發(fā)明的包含三種分離重組載體的系統(tǒng)，每種載體含有其中一個必需的轉錄單位以構建所述反轉錄病毒第二載體。
替代的腺病毒載體是本領域已知的，它們在其它腺病毒基因中含有進一步的缺失，這些載體也適用于本發(fā)明。這些第二代腺病毒載體中的數(shù)種顯示出免疫原性降低(例如E1+E2缺失Gorziglia等1996 J．Virol．704173—4178；E1+E4缺失Yeh等1996 J．Virol．70559—565)。延伸的缺失用來提供額外的克隆容量以將多個基因引入所述載體。例如已經(jīng)描述了25kb的缺失(Lieber等1996 J．Virol．708944—8960)，也報道了缺失所有病毒基因的克隆載體(Fisher等1996 Virology 21711—22)，所述載體允許引入35kb以上的異源DNA。這類載體可以用來產(chǎn)生按照本發(fā)明的腺病毒第一載體，所述第一載體編碼用于構建所述反轉錄病毒第二載體的兩種或三種轉錄單位。
所述本發(fā)明的實施方案解決了與腺病毒載體和其它病毒載體有關的一個主要問題，即來自這類載體的基因表達是瞬時的。由所述第一靶細胞產(chǎn)生的反轉錄病毒顆?？梢愿腥镜诙屑毎谒龅诙屑毎械幕虮磉_穩(wěn)定地保持，因為所述反轉錄病毒載體基因組整合入宿主細胞基因組中。所述第二靶細胞不表達大量的病毒蛋白抗原，因此其免疫原性低于用腺病毒載體轉導的細胞。
用反轉錄病毒載體作為所述第二載體也是有利的，因為它例如通過允許導向快速分裂細胞，而允許一定程度的細胞辨別。此外，反轉錄病毒的整合允許在靶組織中穩(wěn)定地表達治療基因，包括在增殖性靶細胞中的穩(wěn)定地表達。
所述第一病毒載體最好優(yōu)先感染某種或某些細胞類型。所述第一載體更優(yōu)選為定向載體，也就是說它與天然病毒相比組織嗜性改變，使得所述載體導向特定的細胞。術語“定向載體”不必與術語“靶位點”或“靶細胞”相關連?！鞍屑毎本褪侵甘翘烊换蚨ㄏ蜉d體能夠感染或轉導的細胞。
按照本發(fā)明的優(yōu)選的腺病毒第一載體也最好是定向載體，其中所述載體的組織嗜性改變而不同于野生型腺病毒?？梢孕揎椣俨《据d體，以產(chǎn)生例如以下描述的定向腺病毒載體Krasnykh等1996 J．Virol706839—6846；Wickham等1996 J．Virol 706831—6838；Stevenson等1997 J．Virol 714782—4790；Wickham等1995 Gene Therapy 2750—756；Douglas等1997 Neuromuscul．Disord 7284—298；Wickham等1996Nature Biotechnology 141570—1573。
用于按照本發(fā)明的載體系統(tǒng)的第一靶細胞包括但不限于造血細胞(包括單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞或任何這些細胞的祖細胞)；內(nèi)皮細胞；腫瘤細胞；基質細胞；星形膠質細胞或神經(jīng)膠質細胞；肌細胞；和上皮細胞。
因此，能夠產(chǎn)生所述第二病毒載體的按照本發(fā)明的第一靶細胞可以是上述細胞類型中的任何一種。在一個優(yōu)選的實施方案中，按照本發(fā)明的第一靶細胞是用一種缺陷型腺病毒載體感染的單核細胞或巨噬細胞，所述缺陷型腺病毒載體含有用于反轉錄病毒gag—pol的第一轉錄單位和能夠產(chǎn)生可包裝缺陷型反轉錄病毒基因組的第二轉錄單位。在這種情況下，至少所述第二轉錄單位最好處于在機體內(nèi)患病位置中優(yōu)先有活性的啟動子—增強子的控制之下，其中所述患病位置諸如局部缺血位點或實體瘤的微環(huán)境。在本發(fā)明該方面的一個具體的優(yōu)選實施方案中，構建所述第二轉錄單位，使得將所述基因組插入所述第二靶細胞中時，產(chǎn)生一個內(nèi)含子，以用來降低病毒env基因的表達，并允許有效地表達治療基因。
所述第二病毒載體也可以是定向載體。對于反轉錄病毒載體，這可以通過修飾所述包膜蛋白來完成。所述反轉錄病毒第二載體的包膜蛋白需要是無毒的包膜或可以以無毒量在所述第一靶細胞中生產(chǎn)的包膜，諸如MMLV兼嗜性包膜或修飾的兼嗜性包膜。在這種情況下，所述安全特征最好是缺失反轉錄病毒組分之間同源的區(qū)域或序列。
所述第二靶細胞群體可以與所述第一靶細胞群體相同。例如，將本發(fā)明的第一載體傳遞至腫瘤細胞，導致可以轉導其它腫瘤細胞的其它載體顆粒的復制和產(chǎn)生?；蛘撸龅诙屑毎后w可以不同于所述第一靶細胞群體。在這種情況下，所述第一靶細胞用作被治療個體機體內(nèi)的內(nèi)源工廠，產(chǎn)生可以感染所述第二靶細胞群體的另外的載體顆粒。例如，所述第一靶細胞群體可以是用所述第一載體體內(nèi)或活體外轉導的造血細胞。然后，將所述第一靶細胞傳遞至或遷移至機體內(nèi)諸如腫瘤的位點，并產(chǎn)生能夠轉導例如實體瘤中腫瘤細胞的所述第二載體顆粒。
本發(fā)明允許在隨后有效轉導第二靶細胞所需的一種或多種治療蛋白的作用位點或其附近，體內(nèi)定位產(chǎn)生高滴度的缺陷型反轉錄病毒載體顆粒。這比或者采用缺陷型腺病毒載體或者采用單獨的缺陷型反轉錄病毒載體更加有效。
本發(fā)明也允許體內(nèi)在非分裂細胞或緩慢分裂的細胞中產(chǎn)生諸如基于MMLV的載體的反轉錄病毒載體。僅在諸如體外增殖的適應于組織培養(yǎng)的細胞的快速分裂的細胞中，或在體內(nèi)的快速分裂的腫瘤細胞中，產(chǎn)生基于MMLV的反轉錄病毒載體，這在先前已經(jīng)是可能的。對于將基因傳遞至實體瘤的細胞(許多實體瘤細胞分裂緩慢)而言，以及對于應用非分裂細胞(諸如內(nèi)皮細胞)和各種造血譜系的細胞作為生產(chǎn)治療蛋白產(chǎn)物的內(nèi)源工廠而言，擴展能夠產(chǎn)生反轉錄病毒載體的細胞類型的范圍是有利的。
由按照本發(fā)明的載體系統(tǒng)傳遞一種或多種治療基因的方法可以單獨采用或結合其它治療或所述治療組分使用?？梢灾委煹募膊“ǖ幌抻诎┌Y、神經(jīng)病、遺傳病、心臟病、中風、關節(jié)炎、病毒感染和免疫系統(tǒng)疾病。合適的治療基因包括編碼以下物質的基因腫瘤抑制蛋白、酶、前體藥物活化酶、免疫調(diào)節(jié)分子、抗體、工程免疫球蛋白樣分子、融合蛋白、激素、膜蛋白、血管活性蛋白或肽、細胞因子、趨化因子、抗病毒蛋白、反義RNA和核酶。
在按照本發(fā)明的治療方法的一個優(yōu)選實施方案中，用本發(fā)明的載體系統(tǒng)將編碼前體藥物活化酶的基因傳遞至腫瘤，并且隨后用合適的前體藥物治療所述個體。前體藥物的實例包括磷酸鬼臼亞乙苷(與堿性磷酸酶一起使用，Senter等1988 Proc．Nat1．Acad．Sci．854842—4846)；5—氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶一起使用，Mullen等1994 CancerRes．541503—1506)；阿霉素—N—對羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素—V酰胺酶一起使用，Kerr等1990 Cancer Immunol．Immunother．31202—206)；對—N—雙(2—氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(與羧肽酶G2一起使用)；氨基甲酸頭孢菌素氮芥(與b—內(nèi)酰胺酶一起使用)；SR4233(與P450還原酶一起使用)；丙氧鳥苷(與HSV胸苷激酶一起使用，Borrelli等1988 Proc．Natl．Acad．Sci．857572—7576)；與硝基還原酶一起使用的芥子前體藥物(Friedlos等1997 J Med Chem 401270—1275)和環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺(與細胞色素P450一起使用，Chen等1996 Cancer Res 561331—1340)。
按照本發(fā)明還提供一種方法，控制治療基因的生產(chǎn)，使得所述治療基因優(yōu)先在所述第二靶細胞群體中表達，而在所述第一靶細胞中表達差或不以生物學顯著水平表達。
按照本發(fā)明，可以使用本領域技術人員技術水平內(nèi)的標準分子生物學技術。這類技術全面描述于文獻中。參見例如Sambrook等(1989)Molecular Cloninga laboratory manual；Hames和Glover(1985—1997)DNA Cloninga practical approach，第Ⅰ—Ⅳ卷(第二版)；在McCafferty等(1996)“Antibody EnginneringA Practical Approach”中給出了將免疫球蛋白基因工程改造的方法。
總之，本發(fā)明涉及適用于將一種或多種NOI引入靶細胞的新型傳遞系統(tǒng)。
在一個廣義方面，本發(fā)明涉及包含一個功能性剪接供體位點和一個功能性剪接受體位點的反轉錄病毒載體；其中所述功能性剪接供體位點和所述功能性剪接受體位點鄰接一個第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供體位點位于所述功能性剪接受體位點上游；其中所述反轉錄病毒載體衍生自反轉錄病毒原載體；其中所述反轉錄病毒原載體包含一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點的第一核苷酸序列(“NS”)和一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反轉錄病毒載體因所述反轉錄病毒原載體的反轉錄而形成。
在再一廣義方面，本發(fā)明提供用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細胞并能在其中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞。
最好是，所述第一載體可得自或基于腺病毒載體和／或所述第二病毒載體可得自或基于反轉錄病毒載體，最好是慢病毒載體。
現(xiàn)在參考以下附圖，通過實施例進一步描述本發(fā)明圖1顯示反轉錄病毒原病毒基因組的結構；
圖2顯示小T剪接供體pLTR的加入；圖3顯示pL—SA—N的圖解說明；圖4顯示缺失一個剪接供體的pL—SA—N的圖解說明；圖5顯示MLV pICUT的序列；圖6顯示于EIAV LTR質粒的CMV／R接點處插入一個剪接供體；圖7顯示將一個剪接受體插入pEGASUS—1；圖8顯示從EIAV載體去除一個野生型剪接供體；圖9顯示pCMVLTR+SD與pEGASUS+SA(noSD)組合，產(chǎn)生pEICUT—1；圖10顯示pEICUT—LacZ的構建；圖11顯示pEICUT—LacZ序列；圖12顯示在轉染和轉導的細胞中所述載體的結構；圖13顯示基因表達限于或者包裝細胞或者轉導細胞；圖14顯示MLV pICUT Neo—p450載體的構建，所述載體將潮霉素的表達限于生產(chǎn)細胞，而將2B6(一種p450同種型)的表達限于轉導細胞；圖15顯示突變的env(m4070A)與來自pol，基因3’端的野生型MMLV序列的序列比較；圖16顯示修飾的env基因m4070A的完整序列；圖17顯示限制的基因表達構成物；4070A包膜限于第一細胞；p450限于第二細胞；圖18顯示使用內(nèi)含子將NOI(在該實施例中為p450)的表達限于轉導細胞；圖19顯示轉移載體pE1sp1A的圖解說明；圖20顯示pE1sp1A構成物的圖解說明；圖21顯示pE1RevE構成物的圖解說明；圖22顯示pE1HORSE3．1—gagpol構成物的圖解說明；圖23顯示pE1PEGASUS4—基因組構成物的圖解說明；
圖24顯示pCI—Neo構成物的圖解說明；圖25顯示pCI—Rab構成物的圖解說明；圖26顯示pE1Rab構成物的圖解說明；圖27a以圖解說明反轉錄病毒載體中的天然剪接結構；圖27b以圖解說明已知的反轉錄病毒載體中的剪接結構；圖27c以圖解說明按照本發(fā)明的剪接結構；和圖28以圖解說明按照本發(fā)明的雙雜種病毒載體系統(tǒng)；以下是略為更詳細的細節(jié)圖1顯示反轉錄病毒原病毒基因組的結構。在該方面，諸如鼠類致癌反轉錄病毒的最簡單的反轉錄病毒具有三個可讀框gag、pol和env。在gag翻譯期間的移碼導致pol翻譯。通過所示的剪接供體(SD)和剪接受體(SA)之間的剪接，完成Env的表達和翻譯。包裝信號以psi表示，且僅包含于全長的轉錄物中—而不包含于表達env的亞基因組轉錄物中，其中該信號在所述剪接事件期間被去除。
圖2圖示將小T剪接供體加入pLTR。在此，將所述小t剪接供體序列插入LTR載體的轉錄起始下游，但位于R序列上游，使得反轉錄時(在最終的構成物中)，所述U3—剪接供體—R盒“遺傳”至所述原病毒載體的5’端，并且所表達的RNA轉錄物在其5’末端附近含有一個剪接供體序列。
圖3顯示pL—SA—N的示意圖。共有剪接受體(T／C)nNC／TAG—G(Mount 1982 Nucleic Acids Res 10459—472)和分支點用下劃線和粗體顯示。箭頭顯示內(nèi)含子／外顯子接點。在此，將所述共有剪接受體序列插入到pLXSN的Stu1／BamH1位點。因此通過這種定位，該受體將與任何上游的剪接供體(在最終的RNA轉錄物中)相互作用。
圖4顯示構建缺失一個剪接供體的pL—SA—N的示意圖。通過用以下顯示的兩種寡核苷酸對pL—SA—N載體進行PCR反應，將gT變?yōu)間C。然后，將所得的產(chǎn)物以Spe1—Asc1片段克隆入pL—SA—N中，因而用gC取代野生型剪接供體gT。Spe1和Asc1位點均以粗體顯示，Spe1寡核苷酸中的突變以大寫粗體顯示。
圖5顯示MLV pICUT的序列。
圖6顯示于EIAV LTR質粒的CMV／R接點處插入一個剪接供體的示意圖。用以下概述的兩種寡核苷酸進行PCR，將所得的PCR產(chǎn)物以Sac1—BamH1片段克隆入CMVLTR中，并去除相當?shù)钠?。在Sac1寡核苷酸中，所述箭頭指示轉錄起始，新的插入片段以大寫顯示，并將剪接供體序列下劃線。R的起始以斜體顯示。
圖7顯示將一個剪接受體插入pEGASUS—1的示意圖。在此，將下述的雙鏈寡核苷酸插入Xho1—Bpul102消化的pEGASUS—1，產(chǎn)生質粒pEGASUS+SA。共有剪接受體(T／C)nNC／TAG—G(Mount 1982出處同上)和分支點均以下劃線和粗體顯示。箭頭指出內(nèi)含子／外顯子接點。
圖8顯示從EIAV載體去除一個野生型剪接供體的示意圖。用下述的寡核苷酸和模板pEGASUS+SA，通過重疊PCR，去除剪接供體序列。用寡聚物1+2和寡聚物3+4進行第一個單獨的PCR反應。然后洗脫出所得的擴增產(chǎn)物，將其混合用于第三個PCR反應。該第三反應進行10個循環(huán)后，加入寡聚物2和寡聚物4。然后將所得的產(chǎn)物以Sal1—Sac1片段克隆入pEGASUS+SA中，產(chǎn)生質粒pEGASUS+SA(noSD)。顯示了所述剪接供體(SD)的位置。在寡聚物1和互補的寡聚物3中，將野生型剪接供體從GT變?yōu)镚C的點突變以粗體顯示。
圖9顯示pCMVLTR+SD與pEGASUS+SA(noSD)組合，產(chǎn)生pEICUT—1的示意圖。在此，我們將pEGASUS+SA(noSD)的Mlu1片段插入pCMV—LTR唯一的Mlu1位點。
圖10顯示構建pEICUT—LacZ的示意圖。這通過如下概述的將pEGASUS—1的Xhol—Bpu1102 LacZ片段插入pEICUT—1的Xhol—Bpu1102位點來進行。
圖11顯示pEICUT—LacZ序列。
圖12顯示在轉染和轉導的細胞中所述載體結構的示意圖。在此，起始pICUT載體在剪接受體(在該實例中，所述共有剪接受體衍生自IgSA)上游不含剪接供體，因此所得的RNA轉錄物將不被剪接。因此，所有轉錄物將為含包裝信號的全長轉錄物(A)。然而轉導時，所述剪接供體(在該實例中為小T剪接的供體)“遺傳”至所述原病毒載體的5’端，使得現(xiàn)在產(chǎn)生的所有RNA轉錄物于剪接受體(即內(nèi)含子)上游均含有剪接供體，并因此完成最大剪接(B)。
圖13顯示基因表達限于或者包裝細胞或者轉導細胞的示意圖。通過將新霉素ORF上游的潮霉素ORF置于MLV pEICUT中，完成在該實例中基因表達的限制(a)。用該克隆策略，所得的載體現(xiàn)在表達的RNA轉錄物，僅在轉染的細胞中表達潮霉素，因為核糖體依賴于5’帽的翻譯將僅有效閱讀上游ORF。然而，轉導時，潮霉素現(xiàn)在包含于功能性內(nèi)含子內(nèi)，并因此從成熟的轉錄物(b)中缺失，因此新霉素ORF現(xiàn)在以5’帽依賴性方式翻譯。
圖14顯示MLV pICUT Neo—p450載體構建的示意圖，所述載體將潮霉素的表達限于生產(chǎn)細胞，而將2B6(一種p450同種型)的表達限于轉導細胞。用于該構建的起始載體為圖13的pICUT載體，它含有hygo和neo兩者。neo基因用完整的p450 2B6 cDNA如下取代通過用以下引物對人肝RNA(Clontech)進行RT—PCR，獲得完整的2B6 cDNA5’ttcgatgatcaccaccatggaactcagcgtcctcctcttccttgcac3’5’ttcgagccggctcatcagcggggcaggaagcggatctggtatgttg3’這產(chǎn)生完整的2B6 cDNA，它具有鄰接僅有的BclⅠ和NgoM1位點的最適化kosak序列。然后將該cDNA克隆入pICUT—Hyg—Neo的Bcl1—NgoM1位點，因此用p450取代Neo(參見以下(A))。以下也顯示了在轉染(B)和轉導(C)的細胞中的所述原病毒DNA構成物。
圖15是突變的env(m4070A)與來自pol基因3’端的野生型MMLV序列的序列比較。
圖16是改變的4070A的完整序列。
圖17顯示基因限制表達的反轉錄病毒載體，采用該載體，在所述起始載體中表達所述第一NOI(所述4070A包膜ORF)，而僅在載體復制后表達所述第二NOI(在該實例中為p450)。在復制后，4070A基因位于功能性內(nèi)含子內(nèi)，因此在RNA剪接期間被去除。
圖18顯示一種反轉錄病毒表達載體，使用該載體，在復制后p450基因的5’端(補平為(flush to)剪接供體)僅在p450基因的3’端(補平為SA)上游發(fā)現(xiàn)，因而僅在復制后為表達的功能性p450基因(來自剪接的mRNA)。實施例實施例1斷裂—內(nèi)含子MLV載體的構建。(ⅰ)小T剪接供體的加入用于該構成物的起始質粒為pLXSN(Miller等1989出處同上)；首先，用Nhe1消化該構成物，將骨架再連接，產(chǎn)生一個LTR(U3—R—U5)質粒。然后，將含有所述剪接供體序列的寡核苷酸插入該質粒的Kpn1—Bbe1位點之間。NLV R序列至Kpn1也包含于該寡核苷酸內(nèi)，位于所述剪接供體下游。所得的質粒命名為3’LTR—SD(參見圖2)。(ⅱ)剪接受體的加入用于該構成物的剪接受體序列(包括分支點—參與內(nèi)含子套索形成(Aebi等1987 Trends in Genetics 3102—107)的剪接受體上游20堿基和40堿基之間的一個A殘基)衍生自免疫球蛋白重鏈可變區(qū)mRNA(Bothwell等1981 Cell 24625—637)，但具有共有／最適化受體位點。這種序列信號也存在于pCI(Promega)中。首先將該受體序列作為雙鏈寡核苷酸插入pLXSN的BamH1—Stu1位點，產(chǎn)生載體pL—SA—N(注意在克隆期間SV40啟動子從pLXSN中喪失)。關于克隆策略的概述請參見圖3。(ⅲ)從pL—SA—N中去除原始剪接供體。
通過基于PCR的定點誘變，完成包含于pL—SA—N的gag序列內(nèi)的剪接供體的去除。使用兩種寡核苷酸，以PCR擴增跨越pL—SA—N的Asc1和Spe1特有位點的區(qū)域。在所述跨越Spe1的寡核苷酸中，也加入agGTaag至agGCaag的改變，該改變也在剪接陰性pBABE載體中發(fā)現(xiàn)(Morgenstern等1990出處同上)。關于克隆策略的概述請參見圖4。(ⅳ)將pL(noSD)—SA—N與3’LTR—SD組合。
pL(noSD)SA—N質粒含有一個正常MLV衍生的3’LTR。通過從pL(noSD)SA—N取出Nhe1插入片段，并將其加入Nhe1消化的3’LTR—SD載體中，用3’LTR—SD序列取代所述3’LTR。名為pICUT(轉導時產(chǎn)生的內(nèi)含子(Intron Created Upon Transduction))的所得的質粒含有這種新一代反轉錄病毒載體的所有特征(關于序列信息請參見圖5)。實施例2斷裂—內(nèi)含子慢病毒載體的構建。起始EIAV慢病毒表達載體的構建(也參見專利申請GB 9727135．7)。
為了構建斷裂功能的慢病毒載體，起始點為名為pEGASUS—1的載體(參見專利申請GB 9727135．7)。該載體衍生自感染性原病毒EIAV克隆pSPEIAV19(登記號U01866；Payne等1994)。其構建概述如下首先，將通過PCR擴增的EIAV LTR克隆入pBluescriptⅡKS+(Stratagene)中。然后插入pSEIAV19的MluⅠ／MluⅠ(216／8124)片段，產(chǎn)生pBluescriptⅡKS+中的野生型原病毒克隆(pONY2)(圖1)。然后通過去除HindⅢ／HindⅢ片段使env區(qū)缺失，產(chǎn)生pONY2—H。另外，缺失pol中的BglⅡ／NcoⅠ片段(1901／4949)，并將由HCMV IE增強子／啟動子驅動的β—半乳糖苷酶基因插入其位置。該質粒命名為pONY2．10nlsLacZ。為了將EIAV序列減至759個堿基對并將第一轉錄物與CMV啟動子分離首先，采用以下引物，從pONY2．10LacZ PCR擴增包含EIAV多嘌呤序列段(Polypurine tract)(PPT)和3’LTR的序列PPTEIAV+(Y8198)GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG，和3’NEGSpeⅠ(Y8199)CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG然后將PCR產(chǎn)物克隆入pBSⅡKS+的Spe1位點；其取向使得U5鄰近pBluescriptⅡKS+中的Not1。
下一步，對于報道基因盒，通過Pst1消化取出來自pONY2．10nlsLacZ的CMV啟動子／LacZ，并將其克隆入pBS．3’LTR的Pst1位點，其取向使得LacZ基因鄰近所述3’LTR，該載體命名為pBSCMVLacZ．3’LTR。
在表達載體pCIEneo中構建所述EIAV載體的5’區(qū)，pCIEneo為pCIneo(Promega)的衍生物，由于包含得自先前定義的全長CMV啟動子5’端的約400個堿基對而被修飾。采用以下引物，用pHIT60(Snoeoka等1995 Nucleic Aicds Res 23628—633)作為模板，經(jīng)PCR擴增獲得該400個堿基對的片段VSAT1(GGGCTATATGAGATCTTGAATAATAAAATGTGT)和VSAT2(TATTAATAACTAGT)和該產(chǎn)物用BglⅡ和SpeⅠ消化，并克隆入的pCIEneo的BglⅡ／SpeⅠ位點。
用以下引物，從pSEIAV擴增EIAV基因組中從R區(qū)至gag編碼區(qū)的nt 150的片段(nt 268—675)CMV5’EIAV2(Z0591)(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTG(下劃線的序列退火于EIAVR區(qū))和3’PSI．NEG(GCTGAGCTCTAGAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTGG)。
所得的PCR產(chǎn)物鄰近Xba1和Sac1位點。然后，將該產(chǎn)物酶切，并克隆入pCIEneo的Xba1／Sac1位點。稱為pCIEneo5’EIAV的所得質?，F(xiàn)在于CMV啟動子轉錄起始點含有EIAVR區(qū)的起始段。然后，通過從pBS．CMVLacZ．3LTR中取出Apa1至Not1的片段，并將其克隆入Sal1—Not1消化的pCIEneo5’EIAV中(在載體和插入片段分別以Not1消化之前，將所述Sal1和Apa1位點用T4“磨光”產(chǎn)生平端)，將CMVLacZ／3TLR盒插入pCIEneo5’EIAV質粒中。所得的質粒命名為pEGASUS—1。
為了用作基因傳遞載體，pEGASUS—1需要由包裝細胞以反式提供的gag／pol和env的表達。關于gag／pol源，通過將pONY2—H的MluI／MluⅠ片段插入哺乳動物表達質粒pCI—neo(Promega)中，制備EIAVgagpol表達質粒(pONY3)，使得gag—pol基因由hCMV—MIE啟動子—增強子表達，并不含LTR序列。對于env源；常規(guī)使用pRV583 VSV—G表達質粒。這三種載體用于關于基于MLV的載體所述的三質粒共轉染中(Someoka等1995 Nucl．Acids Res．23628—633)。在D17成纖維細胞上通常所得病毒的滴度為104—105lacZ形成單位／ml。構建pICUT的EIAV慢病毒形式的載體，命名為pEICUT為了構建pEICUT，首先從pEIASUS—1中去除pEIASUS—1的Xma1—SexA1片段，用T4聚合酶將末端“平端化”，將質粒再連接，產(chǎn)生僅含pEGASUS—1 CMV—R—U5部分的質粒，該質粒在骨架中保留SV40—Neo盒。該質粒命名為CMVLTR。為了于CMV—R邊界插入一個剪接供體，用以下在圖6顯示和在圖6說明中概述的兩種寡核苷酸進行PCR。所得的質粒命名為pCMVLTR+SD。在該EIAV形式中使用與NLV pICUT(參見上文)相同的基于免疫球蛋白的共有剪接受體。用圖7所述的寡核苷酸，將該共有剪接受體插入pEGASUS—1的XhoⅠ—Bpul102位點，產(chǎn)生質粒pEGASUS+SA。通過采用圖8描述的寡核苷酸和方法，用pEGASUS+SA作為模板進行重疊PCR，去除EIAV的野生型剪接供體，產(chǎn)生質粒pEGASUS+SA(noSD)。然后為了產(chǎn)生pEICUT—1，則將pEGASUS+SA(noSD)的Mlu1—Mlu1片段插入pCMVLTR+SD的僅有的Mlu1位點，產(chǎn)生pEICUT—1(參見圖9)。然后，通過Xho1—Bpul102消化和插入，可以將LacZ從pEGASUS—1轉移入pEICUT—1，產(chǎn)生pEICUT—Z(參見圖10；對于序列信息參見圖11)。
MLV和EIAV的pICUT載體均含有所述剪接供體上游的強剪接受體，因此不含功能性內(nèi)含子(內(nèi)含子需要位于剪接受體5’的剪接供體)。為此，當將所述載體轉染入生產(chǎn)細胞中時，產(chǎn)生的所得轉錄物將不剪接。因此，包裝信號將不喪失，結果是可完成最大的包裝(參見圖12)。
然而，由于反轉錄病毒復制的特有方式，因此，在轉導時，由整合的pICUT載體產(chǎn)生的轉錄物將不同于上述轉染細胞的轉錄物。這是因為在復制期間，3’U3啟動子(直至R的5’起始)拷貝，并用作轉導細胞中的5’啟動子。為此，由整合的pICUT產(chǎn)生的轉錄物現(xiàn)在將含有強剪接受體5’端的強剪接供體，這兩者均位于neo ORF上游。這類轉錄物將因此在5’UTR中(非翻譯區(qū))含有一個功能性內(nèi)含子，并因此進行最大剪接和翻譯。
上述這類載體的另一優(yōu)點是，因為所述內(nèi)含子僅在轉導時產(chǎn)生，因而將基因表達限于或者包裝細胞或者轉導細胞是可能的。如何完成這一點的一個實例概述于圖13。該策略需要克隆所述剪接受體上游的一個第二基因(在該實施例中為潮霉素)。通過取出Selcta Vector Hygro(Ingenius；Oxfordshire，UK)的SalⅠ片段上的潮霉素cDNA，并將其克隆入pICUT的Xho1位點(位于所述剪接受體上游)，而完成這一步。該載體在轉染的細胞中選擇性地表達潮霉素，而在轉導的細胞中選擇性地表達新霉素。其原因是，在任何一種mRNA轉錄物中，在無內(nèi)部核糖體結合位點(IRES)的輔助下，僅所述第一基因由核糖體翻譯。在轉染的細胞中，該基因為潮霉素。然而，在轉導的細胞中，因為潮霉素可讀框(ORF)包含于一種功能性內(nèi)含子內(nèi)，所以該基因現(xiàn)在將從成熟mRNA轉錄物中去除，因此允許neo ORF翻譯。
具有這類細胞特異性基因表達的載體因種種原因可能具有臨床用途；作為實例，可以將抗性標記的表達局限于需要它們的生產(chǎn)細胞中，而不在它們可能具有免疫原性的轉導細胞中表達。作為另一實例，諸如蓖麻毒蛋白的毒性基因的表達和顯性負信號蛋白的表達，可以被局限于轉導的細胞，在此可能需要它們來任選地使細胞生長停滯或殺傷細胞，但在這類特征阻止高滴度病毒產(chǎn)生的生產(chǎn)細胞中不表達。圖14顯示Neo—p450 MLV pICUT構成物，使得僅Neo在生產(chǎn)細胞中表達，而前體藥物p450 2B6同種型在轉導細胞中表達。
轉導時產(chǎn)生內(nèi)含子的另一個益處是，載體功能所需的任何必需元件現(xiàn)在均可以置于功能性內(nèi)含子內(nèi)，該內(nèi)含子在轉導時產(chǎn)生，并從轉導細胞的轉錄物中去除。作為實例，關于MLV和慢病毒載體(lentivector)的pICUT載體，所述病毒轉錄物在一個內(nèi)含子內(nèi)含有功能性Psi包裝信號(關于Psi在MLV中的位置，參見Bender等1987；關于Psi在EIAV中的位置，參見專利申請GB 9727135．7)，所述內(nèi)含子在轉導時產(chǎn)生，而從轉導細胞的轉錄物中去除。
得自這種布置的益處包括(ⅰ)增強來自所得轉錄物的翻譯，因為在存在Psi二級結構(如果有的話)的情況下，核糖體可能“一陣一陣地動(stutter)”(Krall等1996出處同上和其中引用的參考文獻)。
(ⅱ)在缺乏包裝信號的情況下，防止由內(nèi)源反轉錄病毒進行轉錄物包裝。
(ⅲ)當諸如gag(和其它潛在的ATG翻譯起始位點)的病毒基本元件從轉導細胞中表達的轉錄物中去除時，防止不想要的成熟前翻譯起始。當EIAV和MLV pICUT載體均將包裝信號延伸到gag中時，這特別有益。
(ⅳ)可以將啟動子、增強子和抑制基因置于轉導時產(chǎn)生的內(nèi)含子內(nèi)，因此模仿其它轉錄物布置，如由CMV產(chǎn)生的在內(nèi)含子中含有這類實體的布置(Chapman等1991出處同上)。
總之，本發(fā)明描述的新型pICUT載體系統(tǒng)促進以下布置(ⅰ)在生產(chǎn)細胞中進行最大包裝和減少轉錄物的翻譯。
(ⅱ)在轉導細胞中進行最大剪接，且因此進行內(nèi)含子增強的轉錄物翻譯。
(ⅲ)將基因和／或病毒基本元件的表達局限于或者生產(chǎn)細胞或者轉導細胞。實施例3構建與pol基因和gag—pol轉錄盒具有最小同源性的MMLV兼嗜性env基因在莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)中，env編碼序列的前約60bp與pol基因的3’端序列重疊。去除這兩個基因之間的同源區(qū)，以在表達這兩種基因的細胞中防止它們之間重組的可能性。
如下將env編碼序列的前60bp的DNA序列改變，而保留所編碼蛋白的氨基酸序列。構建合成的寡核苷酸，以改變env 5’端的密碼子用法(參見圖15)，并將其插入如下的env的其余部分中。
用于再構建4070A基因5’端的起始質粒是pCI質粒(Promega)，其中先前已經(jīng)克隆了含pHIT456(Soneoka等1995出處同上)的4070A基因的Xba1—Xba1片段，以形成pCI—4070A。用引物A和B(圖15)，在pCI4070A上進行PCR反應，產(chǎn)生600個堿基對的產(chǎn)物。然后將該產(chǎn)物克隆到pCI—4070A的Nhe1和Xbo1位點之間。對所得構成物的Nhe1／Xho1區(qū)進行測序。盡管所得基因的氨基酸序列與原始4070A的序列相同，但去除了與pol基因的同源區(qū)。
圖16給出了修飾的env基因m4070A的完整序列。用標準技術將該序列插入表達載體pCI(Promega)中。由pHIT60(Soneoka等1995出處同上)獲得CMV gag—pol轉錄單位。實施例4從反轉錄病毒包裝信號缺失gag序列采用以下寡核苷酸引物，經(jīng)PCR反應，由反轉錄病毒載體MFG(Bandara等1993 Proc Nat1 Acad Sci 9010764—10768)或MMLV原病毒DNA獲得含LTR和最小功能包裝信號的DNA片段HindⅢRGCATTAAAGCTTTGCTCTL523GCCTCGAGCAAAAATTCAGACGGA該PCR片段含有MMLV核苷酸+1至+523，因此不含起始于+621的gag編碼序列(編號基于MMLV的核苷酸序列，Shinnick等1981 Nature293543—548)。
通過用HindⅢ和XhoⅠ限制性酶消化，并用標準技術進行亞克隆，用所述PCR片段可構建反轉錄病毒基因組載體。這類載體與gag編碼序列無同源性。實施例5缺陷型反轉錄病毒基因組的構建能夠產(chǎn)生缺陷型反轉錄病毒基因組的轉錄單位示于圖17。它含有以下元件低氧調(diào)節(jié)啟動子增強子，包含3個拷貝的PGK基因HRE以及缺失72bp的SV40啟動子和pGL3(Promega)的重復增強子；一個含R、U5和包裝信號的MMLV序列；m4070A的編碼序列(實施例3)；一個剪接受體；一個用于插入治療蛋白編碼序列的克隆位點；MMLV的多嘧啶序列段；一個第二拷貝的含HRE啟動子—增強子；一個剪接供體位點；和一個第二拷貝的R、U5。
在所述載體反轉錄并整合入第二靶細胞后，所述剪接供體立即被引入env基因的上游，從而導致將其從mRNA中剪接去除，因此僅允許治療基因在第二靶細胞中有效地表達(參見圖17)。實施例6構建用于細胞色素P450的條件表達載體圖18顯示了把細胞色素P450基因分為兩半的反轉錄病毒表達載體cDNA編碼序列的結構，該結構使得僅轉導后完成了正確的剪接，才允許P450表達。因此這將表達局限于轉導的細胞。
1)用于構建該載體的起始質粒為pLNSX(Miller和Rosman 1989BioTechniques 7980—990)。通過用ALTERED SITESⅡ誘變試劑盒(Promega)和以下序列的合成寡核苷酸，經(jīng)PCR誘變使包含于pLNSX的包裝信號內(nèi)的天然剪接供體(…agGTaag…)(781／782位)突變5’—caaccaccgggagGCaagctggccagcaactta—3’2)用以下兩種寡核苷酸，經(jīng)PCR分離pCI表達載體(Promega)的CMV啟動子引物15’—atcggctagcagatcttcaatattggccattagccatat—3’引物25’—atcgagatctgcggccgcttacctgcccagtgcctcacgaccaa—3’這產(chǎn)生含CMV啟動子與5’Nhe1位點(引物1)和3’Not1和Xba1位點(引物2)的片段。用Nhe1和Xba1將其酶切，將其克隆入已經(jīng)去除Nhe1—Nhe1片段的pLNSX中。
3)用以下引物，經(jīng)RT—PCR從人肝RNA(Clontech)中分離細胞色素P450 cDNA編碼序列的5’端引物35’—atcggcggccgcccaccatggaactcagcgtcctcctcttccttgcaccctagg—3’引物45’—atcggcggccgcacttacCtgtgtgccccaggaaagtatttcaagaagccag—3’這擴增了p450從ATG至殘基693的5’端(從翻譯起始位點編號Yamano等1989 Biochem 287340—7348)。在該片段的5’端(衍生自引物3)上也含有一個Not1位點和一個最佳化的“Kozak”翻譯起始信號。在該序列的3’端(衍生自引物4)含有另一個Not1位點和一個共有剪接供體序列(也發(fā)現(xiàn)于pCI中，最初衍生自人β珠蛋白基因)，GT剪接供體對直接對著P450的殘基704的位置(在引物4中互補殘基以大寫顯示)。該片段用Not1消化，并克隆入用Not1消化的步驟2中產(chǎn)生的質粒中。
4)然后將步驟2克隆期間取出的Nhe1—Nhe1片段再引入步驟3的質粒中。這產(chǎn)生圖17所述的反轉錄病毒載體，但缺失P450 3’端。
5)用以下引物，經(jīng)RT—PCR擴增，從人肝RNA(Clontech)中分離P450編碼序列的3’端引物5actgtgatcataggcacctattgtcttactgacatccactttctctccacagGcaagtttacaaaacctgcaggaaatcaatgcttacatt—3’引物6actgatcgatttccctcagccccttcagcggggcaggaagc—3’這產(chǎn)生PCR擴增的從殘基705(在引物5中以大寫顯示)并延伸通過翻譯終止密碼子的P450 3’端。在該產(chǎn)物5’端內(nèi)包含一個由引物5產(chǎn)生的Bcl1限制性位點和一個共有剪接受體，分支點(也發(fā)現(xiàn)于pCI中，最初來自免疫球蛋白基因)位于殘基705的上游。于終止密碼子下游的該產(chǎn)物的3’端包含一個由引物6產(chǎn)生的Cla1位點。然后將該PCR產(chǎn)物用Bcl1和Cla1消化，并克隆入除去Bcl1—Cla1片段的步驟3的載體中，產(chǎn)生圖18所示的反轉錄病毒載體。
以下實施例描述一種腺慢病毒(adenolentiviral)系統(tǒng)的構建，所述系統(tǒng)可用來在體外或體內(nèi)瞬時產(chǎn)生慢病毒。第一代重組腺病毒第一代腺病毒載體包含所述病毒的E1和E3區(qū)缺失，允許插入外源DNA，通常插入該病毒左臂，鄰近左反向末端重復序列(ITR)。病毒包裝信號(194—358nt)與E1a增強子重疊，因此存在于大多數(shù)El缺失的載體中。該序列可以易位至病毒基因組的右端(Hearing和Shenk，1983 Cell 3359—74)。因此，在E1缺失載體中，可以缺失3．2kb(358—3525nt)。
腺病毒能夠包裝105％長度的基因組，因此允許加入額外的2．1kb。因此，在E1／E3缺失病毒載體中，其克隆容量變?yōu)?—8kb(2．1kb+1．9kb(除去E3)+3．2kb(除去E1))。因為所述重組腺病毒缺乏必需的E1早期基因，所以它不能在非E1互補細胞系中復制。293細胞系由Graham等研制(1977 J Gen Virol 3659—74)，含有來自Ad5基因組左端的約4kb，包括ITR、包裝信號、E1a、E1b和pⅨ。所述細胞穩(wěn)定地表達E1a和E1b基因產(chǎn)物，但即使pⅨ序列在E1b內(nèi)，也不表達晚期蛋白Ⅸ。在非互補細胞中，E1缺失病毒轉導所述細胞，并被轉運至細胞核，但沒有來自E1缺失基因組的表達。第一代腺病毒生產(chǎn)系統(tǒng)Microbix Biosystems—nb1 Gene Science圖19中的圖解顯示采用microbix系統(tǒng)用來產(chǎn)生重組腺病毒的一般策略。
所述一般策略涉及將外源DNA克隆入E1穿梭載體，其中402—3328bp的E1區(qū)被所述外源DNA盒取代。然后，將所述重組質粒與pJM17質粒一起共同轉染入293細胞。pJM17含有E3區(qū)的缺失和于3．7圖譜單位的E1區(qū)中的原核pBRX載體的插入(包括氨芐青霉素抗性序列和細菌ori序列)。因此，該40kb質粒太大而不能包裝入腺核殼中，但可以在細菌中增殖。在293細胞中的細胞內(nèi)重組，導致外源DNA插入片段取代ampr和ori序列。實施例7構建轉移質粒用于產(chǎn)生含EIAV組分的腺病毒為了產(chǎn)生慢病毒載體，需要制造四種腺病毒基因組、gagpol、包膜(狂犬病G)和Rev。由異源啟動子表達慢病毒組分，它們含有內(nèi)含子(需要時(用于高表達gagpol、Rev和狂犬病包膜))以及多腺苷酸化信號。當將這四種病毒轉導入E1a細胞中時，所述腺病毒組分將不表達，但異源啟動子將允許表達慢病毒組分。以下(例1)概述一個構建EIAV腺病毒系統(tǒng)的實例(申請?zhí)?727135．7)。所述EIAV基于缺乏任何非必需EIAV編碼蛋白(S2、Tat或包膜)的基本系統(tǒng)。用來使所述EIAV假型化的包膜是狂犬病包膜(G蛋白)。已經(jīng)表明這很好地使EIAV假型化(申請?zhí)?811152．9)。轉移質粒以下描述含EIAV組分的轉移質粒的構建。所述轉移質粒為pE1sp1A(圖20)。
所述重組轉移質?？梢杂脕硗ㄟ^在293細胞中的同源重組，來制備重組腺病毒。
附上以下質粒的圖解說明。A)pE1RevE—Rev構成物用Apa LI和ClaⅠ切割質粒pCI—Rev。用Klenow聚合酶將編碼EIAV Rev的2．3kb帶平端化，并將其插入pE1sp1A的Eco RV位點，產(chǎn)生質粒pE1RevE(圖21)。B)pE1HORSE3．1—gagpol構成物用Sna BI和NotⅠ切割pHORSE3．1。將編碼EIAV gagpol的6．1kb帶插入用Sna BI和NotⅠ切割的pE1RevE(純化7．5kb帶)。這產(chǎn)生質粒pE1HORSE3．1(圖22)。C)pE1PEGASUS—基因組構成物用BglⅡ和NotⅠ切割pEGASUS4。將含有EIAV載體基因組的6．8kb帶插入用BglⅡ和NotⅠ切割的pE1RevE(純化6．7kb帶)。這產(chǎn)生質粒pE1PEGASUS(圖23)。D)pCI—Rab—狂犬病構成物為了制備pE1Rab，通過用NsiⅠ和AhdⅠ切割質粒pSA91RbG，將狂犬病可讀框插入pCI—Neo(圖24)中。用T4 DNA聚合酶將1．25kb帶平端化，并將其插入用SmaⅠ切割的pCI—Neo中。這產(chǎn)生質粒pCI—Rab(圖25)。F)pE1Rab—狂犬病構成物用Sna BI和NotⅠ切割pCI—Rab。將編碼狂犬病包膜的1．9kb帶插入用Sna BI和NotⅠ切割的pE1RevE(純化7．5kb帶)。這產(chǎn)生質粒pE1Rab(圖26)。概要本發(fā)明涉及適用于將一種或多種NOI引入靶細胞的新型傳遞系統(tǒng)。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明包括包含一個功能性剪接供體位點和一個功能性剪接受體位點的反轉錄病毒載體；其中所述功能性剪接供體位點和所述功能性剪接受體位點鄰接一個第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供體位點位于所述功能性剪接受體位點上游；其中所述反轉錄病毒載體衍生自反轉錄病毒原載體；其中所述反轉錄病毒原載體包含一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點的第一核苷酸序列(“NS”)和一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反轉錄病毒載體因所述反轉錄病毒原載體的反轉錄而形成。
換句話說，該方面包括一種新型傳遞系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種鄰接一個功能性SD和SA的NOI，條件是該系統(tǒng)已經(jīng)由原載體產(chǎn)生，在原載體中，所述SD和SA的順序反轉，使得所述剪接無功能。
本發(fā)明的該方面可稱為“斷裂—內(nèi)含子”方面。圖27c中提供了顯示本發(fā)明該方面的示意圖。相比之下，圖27a和圖27b顯示已知反轉錄病毒載體中的剪接結構。
本發(fā)明的另一廣義方面包括一種新型傳遞系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含能夠包裝一種或多種慢病毒載體組分的一種或多種腺病毒載體組分，其中所述慢病毒載體任選地包含一個斷裂內(nèi)含子結構。
一般而言，本發(fā)明的該方面可以稱為雜種病毒載體系統(tǒng)。在該特定情況下，腺病毒組分和慢病毒組分的組合可以稱為雙雜種病毒載體系統(tǒng)。
圖28提供了顯示本發(fā)明該方面的示意圖。
本文討論了本發(fā)明的這些方面和其它廣義方面。
以上說明書中提及的所有出版物均通過引用結合到本文中。在不偏離本發(fā)明范圍和精神的情況下進行的本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種修改和變化，對本領域技術人員而言是顯而易見的。盡管本發(fā)明已經(jīng)結合具體優(yōu)選實施方案進行了描述，但應該理解，要求保護的本發(fā)明不應過度限于這類具體實施方案。實際上，對分子生物學相關領域技術人員顯而易見的用于實施本發(fā)明的所述模式的各種修改，均屬于以下權利要求書的范圍。
序列表SEQ ID NO．1GCTAGCTTAAGTAACGCCACTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAAAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAAAGAAACAGCTGAATACCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCGGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGAGACAGCTGAGTGATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCGGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGTGAATCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAAATGACCCTGTACCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCCGCTCTCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCTTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTATTCCCAATAAAGCCTCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCACGACGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATTTGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGCAAGCTGGCCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGATTGTCTAGTGTCTATGTTTGATGTTATGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCTGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTTGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGGAAGGGAGTCGATGTGGAATCCGACCCCGTCAGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGGGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGAACCGAAGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATTAGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTCGTTAACTCGAGGATCTAACCTAGGTCTCGAGTGTTTAAACACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGGGCTGCAGGTCGAGGCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCGAAGAACAGATGGTCCCCAGGTGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCGTTAACACTAGTAAGCTTGCTCTAAGGTAAATATGTCGACAGGCCTGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGTAAGCTGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGCGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATSEQ ID NO．2TGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCCGACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAAAAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAACTGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTCGCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGGCGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTOGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATGGGAGACCCTTTGACATGGAGCAAGGCGCTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAGAAATTAACTACTGGTAACTGTAATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGATACCAACTTTGTAAAAGAAAAGGACTCTAGAGTCGACCCCCTCGACGTTTAAACACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTCACGTGAAGCTAGCCTCGAGGATCTGCGGATCCGGGGAATTCCCCAGTCTCAGGATCCACCATGGGGGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCACAAAAATCGACOCTCAAGTCAGAGGTGGCCAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTCACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTCAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTCACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGCGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATCGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCCAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTCATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCOACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGCGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTCAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTCACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCATACCAGATCACCGAAAACTGTCCTCCAAATGTGTCCCCCTCACACTCCCAAATTCGCGGGCTTCTGCCTCTTAGACCACTCTACCCTATTCCCCACACTCACCGGAGCCAAAGCCGCGGCCCTTCCGTTTCTTTGCTTTTGAAAGACCCCACCCGTAGGTGGCAACTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTITGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTCCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCACGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTCGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGCATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGA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ID NO．3參見圖16
序列表<110>Oxford Biomedica(UK)Limited<120>載體<130>4644wo<140><141><160>20<170>PatentIn Ver．2．0<210>1<211>5689<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述核酸<400>1gctagcttaa gtaacgccac tttgcaaggc atggaaaaat acataactga gaatagaaaa 60gttcagatca aggtcaggaa caaagaaaca gctgaatacc aaacaggata tctgtggtaa 120gcggttcctg ccccggctca gggccaagaa cagatgagac agctgagtga tgggccaaac 180aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcggggc caagaacaga tggtccccag 240atgcggtcca gccctcagca gtttctagtg aatcatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300gacctgaaaa tgaccctgta ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg 360ttcgcgcgct tccgctctcc gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggcgcgc 420cagtcttccg atagactgcg tcgcccgggt acccgtattc ccaataaagc ctcttgctgt 480ttgcatccga atcgtggtct cgctgttcct tgggagggtc tcctctgagt gattgactac 540ccacgacggg ggtctttcat ttgggggctc gtccgggatt tggagacccc tgcccaggga 600ccaccgaccc accaccggga ggcaagctgg ccagcaactt atctgtgtct gtccgattgt 660ctagtgtcta tgtttgatgt tatgcgcctg cgtctgtact agttagctaa ctagctctgt 720atctggcgga cccgtggtgg 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1．包含一個功能性剪接供體位點和一個功能性剪接受體位點的反轉錄病毒載體；其中所述功能性剪接供體位點和所述功能性剪接受體位點鄰接一個第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供體位點位于所述功能性剪接受體位點上游；其中所述反轉錄病毒載體衍生自反轉錄病毒原載體；其中所述反轉錄病毒原載體包含一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點的第一核苷酸序列(“NS”)和一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反轉錄病毒載體因所述反轉錄病毒原載體的反轉錄而形成。
2．根據(jù)權利要求1的反轉錄病毒載體，其中所述反轉錄病毒原載體包含一個位于所述第二核苷酸序列上游的第三NS；其中所述第三NS能夠產(chǎn)生非功能性剪接供體位點。
3．根據(jù)權利要求1或權利要求2的反轉錄病毒載體，其中所述反轉錄病毒載體還包含一個第二NOI；其中所述第二NOI位于所述功能性剪接受體位點的下游。
4．根據(jù)權利要求3的反轉錄病毒載體，其中所述反轉錄病毒原載體包含所述第二NOI，其中所述第二NOI位于所述第二核苷酸序列下游。
5．根據(jù)權利要求3或權利要求4的反轉錄病毒載體，其中所述第二NOI或其表達產(chǎn)物為治療劑或診斷劑或包含治療劑或診斷劑。
6．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述第一NOI或其表達產(chǎn)物為或包含任何一種或多種賦予選擇性的因子(例如標記元件)、病毒必需元件或其部分或它們的組合。
7．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述第一NS位于反轉錄病毒原載體3’端或其附近；最好是其中所述3’端包含一個U3區(qū)和一個R區(qū)；并且最好其中所述第一NS位于所述U3區(qū)和所述R區(qū)之間。
8．根據(jù)權利要求7的反轉錄病毒載體，其中所述反轉錄病毒載體的所述U3區(qū)和／或所述第一NS包含為第三NOI的NS；其中所述NOI為轉錄控制元件、編碼序列或其部分的任何一種或多種。
9．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述第一NS可得自病毒。
10．根據(jù)權利要求9的反轉錄病毒載體，其中所述第一NS為內(nèi)含子或其部分。
11．根據(jù)權利要求10的反轉錄病毒載體，其中所述內(nèi)含子可得自SV40病毒的小t—內(nèi)含子。
12．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述反轉錄病毒原載體包含一個反轉錄病毒包裝信號；并且其中所述第二NS位于所述反轉錄病毒包裝信號下游，使得防止于第一靶位點進行剪接。
13．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述第二NS位于所述第一NOI下游，使得所述第一NOI能夠于第一靶細胞表達。
14．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述第二NS置于一個多克隆位點上游，使得可以插入一種或多種額外的NOI。
15．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述第二NS為編碼免疫分子或其部分的核苷酸序列。
16．根據(jù)權利要求15的反轉錄病毒載體，其中所述免疫分子為免疫球蛋白。
17．根據(jù)權利要求16的反轉錄病毒載體，其中所述第二NS為編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
18．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述載體還包含一種功能性內(nèi)含子。
19．根據(jù)權利要求18的反轉錄病毒載體，其中所述功能性內(nèi)含子的定位使得它能夠將至少一種所述NOI的表達限于所需靶位點。
20．根據(jù)權利要求19的反轉錄病毒載體，其中所述靶位點為一種細胞。
21．根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體，其中所述載體或原載體可衍生自鼠類致癌反轉錄病毒或慢病毒。
22．根據(jù)權利要求21的反轉錄病毒載體，其中所述載體可衍生自MMLV、MSV、MMTV、HIV—1或EIAV。
23．任一前述權利要求定義的反轉錄病毒載體，其中所述反轉錄病毒載體為整合的原病毒。
24．可得自根據(jù)任一前述權利要求的反轉錄病毒載體的反轉錄病毒顆粒。
25．用根據(jù)權利要求1—23中任一項的反轉錄病毒載體或根據(jù)權利要求24的反轉錄病毒顆粒轉染或轉導的細胞。
26．用于醫(yī)學領域的根據(jù)權利要求1—23中任一項的反轉錄病毒載體或根據(jù)權利要求24的反轉錄病毒顆?；蚋鶕?jù)權利要求25細胞。
27．根據(jù)權利要求1—23中任一項的反轉錄病毒載體或根據(jù)權利要求24的反轉錄病毒顆?；蚋鶕?jù)權利要求25細胞的用途，用于生產(chǎn)將一種或多種NOI傳遞至有需要的靶位點的藥用組合物。
28．一種方法，包括用根據(jù)權利要求1—23中任一項的反轉錄病毒載體或根據(jù)權利要求24的反轉錄病毒顆粒轉染或轉導細胞或利用根據(jù)權利要求25細胞。
29．用于根據(jù)權利要求1—23中任一項的反轉錄病毒載體或根據(jù)權利要求24的反轉錄病毒顆?；蚋鶕?jù)權利要求25細胞的傳遞系統(tǒng)，其中所述傳遞系統(tǒng)包含一種或多種非反轉錄病毒表達載體、腺病毒或質?；蛩鼈兊慕M合，以將一種NOI或多種NOI傳遞至第一靶細胞，所述系統(tǒng)還包含一種反轉錄病毒載體，以將一種或多種NOI傳遞至第二靶細胞。
30．任一前述權利要求中定義的反轉錄病毒原載體。
31．功能性內(nèi)含子將一種或多種NOI的表達限于所需靶細胞的用途。
32．反轉錄酶將第一NS從反轉錄病毒原載體的3’端傳遞至反轉錄病毒載體的5’端的用途。
33．用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細胞并在其中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞。
34．根據(jù)權利要求33的雜種病毒載體系統(tǒng)，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體和／或所述第二病毒載體可得自或基于反轉錄病毒載體，最好是慢病毒載體。
35．根據(jù)權利要求33和34的雜種病毒載體系統(tǒng)的用途，其中所述慢病毒載體包含斷裂—內(nèi)含子結構或能夠傳遞斷裂—內(nèi)含子結構。
36．雜種病毒載體系統(tǒng)，其中所述慢病毒載體包含斷裂—內(nèi)含子結構或能夠傳遞斷裂—內(nèi)含子結構。
37．慢病毒載體系統(tǒng)，其中所述慢病毒載體包含斷裂—內(nèi)含子結構或能夠傳遞斷裂—內(nèi)含子結構。
38．腺病毒載體系統(tǒng)，其中所述腺病毒載體包含斷裂—內(nèi)含子結構或能夠傳遞斷裂—內(nèi)含子結構。
39．基于或得自以下任何一種或多種實體的載體或質粒pE1sp1A、pCI—Neo、pE1ReVE、pE1HORSE3．1、pE1PEGASUS4、pCI—Rab、pElRab。
40．用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細胞并能在其中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體，而所述第二病毒載體可得自或基于反轉錄病毒載體，最好是慢病毒載體。
41．用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細胞并能在其中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體，而所述第二病毒載體可得自或基于反轉錄病毒載體，最好是慢病毒載體；其中所述病毒載體系統(tǒng)包含一個功能性剪接供體位點和一個功能性剪接受體位點；其中所述功能性剪接供體位點和所述功能性剪接受體位點鄰接一個第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供體位點位于所述功能性剪接受體位點上游；其中所述反轉錄病毒載體衍生自反轉錄病毒原載體；其中所述反轉錄病毒原載體包含一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點的第一核苷酸序列(“NS”)和一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反轉錄病毒載體因所述反轉錄病毒原載體的反轉錄而形成。
42．能夠在大致如本文所述的靶細胞中差異表達NOI的反轉錄病毒載體。
全文摘要
描述了一種反轉錄病毒載體。所述反轉錄病毒載體包含一個功能性剪接供體位點和一個功能性剪接受體位點的反轉錄病毒載體;其中所述功能性剪接供體位點和所述功能性剪接受體位點鄰接一個第一目的核苷酸序列(“NOI”)其中所述功能性剪接供體位點位于所述功能性剪接受體位點上游;其中所述反轉錄病毒載體衍生自反轉錄病毒原載體;其中所述反轉錄病毒原載體包含一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點的第一核苷酸序列(“NS”)和一個能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點的第二NS;其中所述第一NS位于所述第二NS下游;使得所述反轉錄病毒載體因所述反轉錄病毒原載體的反轉錄而形成。
文檔編號C07K14/145GK1279723SQ9881142
公開日2001年1月10日 申請日期1998年9月23日 優(yōu)先權日1997年9月25日
發(fā)明者C·貝冰頓, S·金斯馬, M·烏登, A·金斯馬, K·米特洛范諾斯 申請人:牛津生物醫(yī)學(英國)有限公司