專利名稱：可溶性單鏈t細(xì)胞受體蛋白的制作方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可溶性單鏈T細(xì)胞受體蛋白，以及制備和應(yīng)用這些蛋白的方法。這些蛋白用途很多，包括體外篩選能表達(dá)所需肽—MHC復(fù)合體的細(xì)胞。
2．背景T細(xì)胞應(yīng)答受抗原與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的調(diào)節(jié)。ICR類型之一為膜結(jié)合的異二聚體，由類似免疫球蛋白可變區(qū)(V)和恒定區(qū)(C)的α鏈和β鏈組成。TCRα鏈包括共價(jià)連接的V—α鏈和C—α鏈，而β鏈包括與C—β鏈共價(jià)連接的V—β鏈。V—α鏈和V—β鏈組成一個(gè)能結(jié)合超抗原或?qū)儆谥饕M織相容性復(fù)合體(MHC)(人類為HLA復(fù)合體)范疇之抗原的口袋或裂隙?？傄?jiàn)Davis，免疫學(xué)年鑒3537(1985)；基礎(chǔ)免疫學(xué)，第三版，W．Paul編，Rsen出版公司，紐約(1993)。
據(jù)信TCR在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能中起重要作用。例如，據(jù)報(bào)道TCR介導(dǎo)細(xì)胞殺傷、增強(qiáng)B細(xì)胞增殖、影響各種疾病包括癌癥、過(guò)敏、病毒感染及自身免疫病的進(jìn)程和嚴(yán)重性。因此，對(duì)獲得商用、研究用和醫(yī)用TCR之方法的開(kāi)發(fā)引起人們極大的興趣。
一般來(lái)說(shuō)，TCR難以大量分離。其中一個(gè)主要的障礙是不含TCR跨膜區(qū)的可溶性TCR的產(chǎn)生。更具體地說(shuō)，據(jù)報(bào)道如果TCRα鏈和β鏈沒(méi)有參與包括γ、δ、ε和ζ鏈的CD3復(fù)合體的裝配，則該蛋白通常被降解。參見(jiàn)如Shin等(1993)科學(xué)2591901。
常常在細(xì)菌中嘗試生產(chǎn)無(wú)跨膜區(qū)的可溶性TCR。但細(xì)菌性TCR表達(dá)常導(dǎo)致形成包涵體如不溶和不正確折疊的分子。很多情況下，由這些方法經(jīng)困難地蛋白溶解和重新折疊步驟后可獲得TCR。這些步驟大大減少了TCR產(chǎn)量并對(duì)TCR的穩(wěn)定性和功能產(chǎn)生負(fù)影響。
獲得可溶性TCR的進(jìn)一步嘗試集中于設(shè)計(jì)可溶性更好的TCR分子。例如，將TCR與各種蛋白和多肽序列如磷脂酰肌醇連接序列和CD3鏈融合。目的常常是在特殊細(xì)胞區(qū)室中表達(dá)TCR以輔助蛋白折疊。表達(dá)在細(xì)胞表面的TCR融合蛋白常用常規(guī)方法切割以獲得可溶性TCR。但通常只產(chǎn)生少量能完全可溶并有功能的TCR。參見(jiàn)如Matsui，K等(1991)科學(xué)254，1788(1991)；Engel，I．等(1992)科學(xué)256，1318；Lin，A．Y．等(1990)科學(xué)249，677。
產(chǎn)生可溶性TCR的其它嘗試包括合成包含與免疫球蛋白恒定區(qū)共價(jià)連接的TCR V鏈在內(nèi)的TCR異二聚體分子。例如，Gregoire，C．等(1991)PNAS 88，8087報(bào)道了包括與κ型輕鏈C區(qū)(Cκ)連接的Cα、Vα序列的TCRαβ鏈異二聚體的分泌。該文獻(xiàn)還公開(kāi)了VβCβCκ序列。亦參見(jiàn)Weber，S等(1992)自然，356793。
盡管據(jù)報(bào)道TCR異二聚體的合成有時(shí)可增加可溶性表達(dá)，但這些方法有重大缺陷。例如，合成常要求將DNA共轉(zhuǎn)染入特定細(xì)胞，這些細(xì)胞必須正確裝配多蛋白鏈。這些方法常大大降低功能性異二聚體TCRαβ的產(chǎn)量。
值得注意的是，據(jù)報(bào)道Cκ鏈對(duì)TCR異二聚體的表達(dá)有負(fù)影響。例如有人提出，替換Cκ鏈有時(shí)可增加TCR異二聚體的化合價(jià)。而且，已公開(kāi)的包含Cκ區(qū)的Vβ嵌合鏈加工、分泌和／或折疊都十分困難。參見(jiàn)Gregoire等，文獻(xiàn)同上；Mariuzza，R．A．和Winter，G．(1989)2647310；Gascoigne，N．R．J．等，PNAS(USA)(1987)，842936。
還有人嘗試構(gòu)建含TCRV區(qū)的單鏈蛋白(即sc—TCR)，以產(chǎn)生完全可溶并有功能的TCR。簡(jiǎn)而言之，sc—TCR包括融合的V—α和V—β鏈。參見(jiàn)Novotny，J等，PNAS(USA)88，8646(1991)；Soo Hoo，W．F．等，PNAS(USA)89，4759(1992)；Wulfing，C．和P1uckthun，A．，分子生物學(xué)雜志242，655(1994)；Kurucz，I．等，PNAS(USA)90 3830(1993)；PCT WO96／13593；Ward，E．S．等，分子生物學(xué)雜志224，885，(1992)；和Schlueter，C．J．等，分子生物學(xué)雜志256，859(1996)。
但以上產(chǎn)生sc—TCR的方法常產(chǎn)生不溶性、非正確折疊的分子。例如，已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO 96／18105公開(kāi)了表達(dá)sc—TCR的方法，它一般需要有不很方便的蛋白重折疊和溶解步驟。這些方法產(chǎn)生的sc—TCR量常低得出乎人的意料。亦參見(jiàn)Ward，E．S．等，文獻(xiàn)同上，及Schlueter，C．J．，文獻(xiàn)同上。
關(guān)于改進(jìn)sc—TCR生產(chǎn)已提出了好幾個(gè)方案。這些方案包括指導(dǎo)蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)及有溶解作用的載體蛋白的應(yīng)用。參見(jiàn)如，已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO 96／18105和WO 96／13593。然而，這些方法產(chǎn)生的sc—TCR常需要耗時(shí)的操作以獲得哪怕是普通量的蛋白。
有關(guān)免疫系統(tǒng)分子的體外和體內(nèi)相互作用一直吸引人們的極大興趣。因而十分需要可簡(jiǎn)便地大量生產(chǎn)可溶并完全有功能的TCR分子。例如，有人提出TCR V區(qū)為可有效調(diào)節(jié)TCR功能的小分子(如TCR拮抗物或激動(dòng)劑)提供了具有吸引力的靶。因此獲得可生產(chǎn)大量可溶并完全有功能的sc—TCR融合蛋白的便利方法比較合乎需要。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及可溶性單鏈T細(xì)胞受體蛋白，如包括單鏈T細(xì)胞受體與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)共價(jià)連接的融合蛋白。已發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)與單鏈T細(xì)胞受體的融合意外地能促進(jìn)可溶性表達(dá)。無(wú)需進(jìn)行困難的溶解、切割或重折疊步驟。即可分離出大量單鏈T細(xì)胞受體蛋白。
本發(fā)明的單鏈T細(xì)胞受體(即sc—TCR)蛋白完全有功能并可溶。一方面，sc—TCR蛋白包括共價(jià)連接的TCR Vα和Vβ鏈與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(即Ig—CL)或合適的Ig—CL片段的融合。另一方面，所提供的sc—TCR不含融合的Ig—CL鏈或片段。本發(fā)明之sc—TCR融合蛋白有時(shí)在本文中稱為“sc—TCR融合蛋白”、“可溶性融合蛋白”或類似稱呼?？扇苄詓c—TCR蛋白的表達(dá)減少了宿主細(xì)胞中不溶顆粒的形成，從而顯著提高該蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量，并使純化更為簡(jiǎn)易。
sc—TCR融合蛋白通常包括與單鏈V鏈共價(jià)連接的Ig—CL鏈或合適片段。V鏈包括Vα，β序列，其中V—α鏈一般與V—β鏈通過(guò)肽連接序列融合。融合產(chǎn)物進(jìn)一步通過(guò)V—α鏈或V—β鏈共價(jià)連接至Ig—CL鏈或合適的Ig—CL片段上。Ig—CL鏈或其片段可與單鏈V序列有間隔，如被本文所提供的肽連接序列隔開(kāi)。
通常，Ig—CL是序列已知的κ—或λ—型免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)。κ—型免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)本文常稱為“Cκ鏈”，而λ—型免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)本文常稱為“Cλ鏈”。例如，Ig—CL鏈可為如下所述Cκ鏈或其合適片段。本發(fā)明提供完全可溶并有功能的融合蛋白及獲得大量sc—TCR融合蛋白或相同來(lái)源并有多種應(yīng)用的sc—TCR的方法。
部分實(shí)例中，sc—TCR無(wú)需與Ig—CL鏈或其片段融合便完全有功能并可溶。尤其是，我們意外地發(fā)現(xiàn)很多sc—TCR分子無(wú)需與Ig—CL鏈或其片段融合便能表達(dá)。本發(fā)明因此提供不含融合的Ig—CL鏈或其片段的sc—TCR分子以及產(chǎn)生sc—TCR分子的方法。
本發(fā)明之sc—TCR蛋白具有很多重要的優(yōu)點(diǎn)。例如，此前的實(shí)踐常需要在獲得大量蛋白之前對(duì)TCR相關(guān)蛋白(如TCR受體、TCR異二聚體、sc—TCR)進(jìn)行大量操作。對(duì)比之下，本發(fā)明之sc—TCR可大量得到。其中sc—TCR融合蛋白包括對(duì)其可溶性、產(chǎn)量和功能具有正影響的融合的Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段。因此對(duì)TCR和sc—TCR與諸如小分子(如合成肽、藥物等)和抗原呈遞細(xì)胞(APC)之相互作用的分析可通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明提供的可溶性融合蛋白而得到促進(jìn)。而且，有各種各樣的sc—TCR融合蛋白可用來(lái)與超抗原或APC相互作用，下文將就此作更全面描述。
此外，Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段與sc—TCR的融合為經(jīng)常規(guī)免疫學(xué)方法如下文所公開(kāi)方法檢測(cè)和純化融合蛋白提供了一種方便的方法。
還有一些好處是由下文所示編碼sc—TCR蛋白的DNA構(gòu)建體提供的。例如，所提供的一些DNA構(gòu)建體包含以可開(kāi)關(guān)的盒式編碼sc—TCR的DNA區(qū)段，另一區(qū)段編碼所需sc—TCR。DNA構(gòu)建體可編碼與很多TCR Vαβ序列完全相容的融合的Ig—CL鏈或Ig—CL片段，并可在宿主細(xì)胞中表達(dá)以提供大量的蛋白。本發(fā)明因此提供生產(chǎn)研究用、醫(yī)用或商用充足量的完全可溶并有功能的sc—TCR蛋白的方法。
本發(fā)明的sc—TCR蛋白有多種體外和體內(nèi)用途。
例如，sc—TCR蛋白可體外用于檢測(cè)和分析配體如肽以及TCR配體的MHC／HLA分子組成。sc—TCR蛋白還可用于診斷如檢測(cè)有致病性的T細(xì)胞。sc—TCR還可用于功能分析、細(xì)胞和分子分析、結(jié)構(gòu)分析，包括X射線晶體學(xué)、核磁共振成像、計(jì)算技術(shù)如計(jì)算機(jī)圖象顯示。特別興趣在于那些可很容易適用于鑒定對(duì)TCR和MHC復(fù)合體之間相互作用有調(diào)節(jié)能力的小分子的已知技術(shù)。相關(guān)技術(shù)可用于篩選可能阻斷TCR和TCR特異性抗體之間相互作用的小分子。特別引起關(guān)注的是設(shè)計(jì)用于體外檢測(cè)TCR拮抗物的篩選技術(shù)。
sc—TCR蛋白還具有重要的體內(nèi)應(yīng)用。例如，這些蛋白可用于與致病性T細(xì)胞如涉及免疫相關(guān)失調(diào)或疾病的T細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)；或用于免疫哺乳動(dòng)物如人類，以抵抗T細(xì)胞結(jié)構(gòu)如出現(xiàn)在T細(xì)胞表面、造成或輔助其它分子致病或引發(fā)其它有害功能的TCR胞外區(qū)。尤其是，sc—TCR蛋白可用于按如下述已知免疫學(xué)方法產(chǎn)生抗體。這些方法產(chǎn)生的抗體可用于以體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答為目的的治療方案，如通過(guò)抑制或減少識(shí)別所指抗原之特異性T細(xì)胞數(shù)而進(jìn)行調(diào)節(jié)。尤其是，可選擇特異性結(jié)合TCR表位的單克隆抗體，從而可以靶向參與致病的特定T細(xì)胞亞組或群，并將其清除或在數(shù)量上大大減少。如下文將詳述，sc—TCR蛋白或其結(jié)合抗體可不經(jīng)修飾，或若有必要，有時(shí)可通過(guò)一段肽連接序列與所需分子如藥物、毒素、酶或放射性物質(zhì)共價(jià)連接。
本發(fā)明之sc—TCR蛋白還可用于體外篩選表達(dá)所需肽—MHC復(fù)合體的APC。更具體地說(shuō)，它已用于獲得并擴(kuò)展所選的含所需肽—MHC復(fù)合體之APC的好幾種方案中。
編碼sc—TCR融合蛋白的DNA構(gòu)建體還可用于按1997年3月7日提交的未決美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／813，781(已引入本文作為參考)所述方法制備噬菌體展示庫(kù)。
sc—TCR蛋白還可用于體外篩選肽文庫(kù)以檢測(cè)肽結(jié)合序列如潛在的超抗原。
本發(fā)明還涉及含有編碼目的sc—TCR蛋白之序列的核酸區(qū)段(RNA，mRNA，cDNA或基因組DNA)。其中該核酸區(qū)段可編碼與Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段共價(jià)連接的所需sc—TCR。sc—TCR編碼核酸可由各種來(lái)源獲得，包括對(duì)可公開(kāi)獲得的TCR和Ig—CL鏈DNA序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。核酸區(qū)段可以以能在適當(dāng)?shù)恼婧嘶蛟思?xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)sc—TCR蛋白的DNA載體形式提供。該區(qū)段可以包括可操作連接的轉(zhuǎn)錄因子如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄起始序列和最適增強(qiáng)子序列，以驅(qū)動(dòng)可溶性sc—TCR蛋白在所需細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)?；蛘?，DNA載體自身可提供部分或所有控制元件。
編碼sc—TCR的核酸區(qū)段常經(jīng)過(guò)構(gòu)建除去了天然TCR控制元件。但有時(shí)可能需要用本領(lǐng)域內(nèi)已知的免疫球蛋白啟動(dòng)子和／或增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)sc—TCR蛋白表達(dá)。當(dāng)可溶性融合蛋白在能進(jìn)行RNA剪接的某類細(xì)胞(通常為哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)時(shí)，由本發(fā)明之核酸區(qū)段編碼的Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段常包含內(nèi)含子和外顯子序列。當(dāng)需要將sc—TCR融合蛋白表達(dá)在原核細(xì)胞中時(shí)，可去除或大大減小內(nèi)含子以得到最大表達(dá)。如下文詳述，各種Ig—CL鏈或其合適片段可按所需與sc—TCR分子融合，只要表達(dá)的sc—TCR融合蛋白經(jīng)以下試驗(yàn)測(cè)定為完全可溶并具有功能即可。
本發(fā)明特別提供編碼不含Ig—CL鏈或其合適片段之sc—TCR分子的核酸區(qū)段和含有該DNA區(qū)段的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離本文所公開(kāi)的可溶性sc—TCR蛋白的方法。這些方法一般包括將目的核酸區(qū)段或含有其的載體導(dǎo)入能表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞。含有該區(qū)段或載體的宿主細(xì)胞均在能支持細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。宿主細(xì)胞可以是能表達(dá)可溶形式的可溶性融合蛋白的真核細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。但有時(shí)可能需要在細(xì)菌中表達(dá)可溶性融合蛋白。如下文將詳述，表達(dá)可溶性sc—TCR蛋白的細(xì)菌細(xì)胞可在慢誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)。慢誘導(dǎo)條件一般指培養(yǎng)基中一種必需營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)幾小時(shí)被耗竭，從而誘導(dǎo)sc—TCR蛋白可溶性大量表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)條件。故在這類實(shí)例中需要設(shè)計(jì)細(xì)菌表達(dá)載體以便在慢誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生最大表達(dá)。若有必要，表達(dá)在真核或原核細(xì)胞中的可溶性sc—TCR蛋白可純化為相當(dāng)純的sc—TCR融合蛋白。
本發(fā)明特別提供分離不含融合Ig—CL鏈或片段之sc—TCR分子的方法。這些方法一般包括向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼sc—TCR的DNA區(qū)段或含有該核酸區(qū)段的載體、在適當(dāng)培養(yǎng)基中在允許sc—TCR表達(dá)的條件下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化sc—TCR以分離sc—TCR受體。
本發(fā)明還包括對(duì)含有本發(fā)明之可溶性sc—TCR蛋白的編碼序列的載體或核酸區(qū)段進(jìn)行分離的方法。一般而言，該方法包括將載體或核酸區(qū)段導(dǎo)入宿主細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，自宿主細(xì)胞中純化融合蛋白以獲得相當(dāng)純的融合蛋白。該載體或核酸區(qū)段隨后按常規(guī)方法分離成很純的形式。通常，該載體或區(qū)段為DNA。
某些實(shí)例中，可溶性sc—TCR包括一個(gè)或多個(gè)融合的效應(yīng)物或標(biāo)記(通常一或兩個(gè))。其中部分實(shí)例中標(biāo)記可用于協(xié)助從通常伴隨融合蛋白的天然細(xì)胞成分中純化sc—TCR蛋白。在其它實(shí)例中，蛋白標(biāo)記可用于向可溶性蛋白中導(dǎo)入預(yù)定的化學(xué)切割位點(diǎn)或蛋白裂解位點(diǎn)。尤其是在DNA載體中，如在可溶性融合蛋白和Ig—CL鏈或合適片段之編碼序列之間導(dǎo)入一個(gè)標(biāo)記編碼片段，從而在有必要時(shí)可以將sc—TCR分子與Ig—CL鏈或片段切開(kāi)(即分開(kāi))。
本發(fā)明特別提供包括效應(yīng)物的可溶性sc—TCR融合蛋白和不含融合Ig—CL鏈或片段的sc—TCR分子，其中效應(yīng)物為細(xì)胞毒素或可檢測(cè)標(biāo)記的適于診斷或成像研究的原子或化合物。sc—TCR融合蛋白和sc—TCR分子有多方面應(yīng)用，包括細(xì)胞或組織的體內(nèi)檢測(cè)和／或成像，以及細(xì)胞的體外或體內(nèi)損害或殺傷。靶細(xì)胞或組織常常包括一個(gè)或多個(gè)能選擇性結(jié)合sc—TCR的配體。細(xì)胞實(shí)例包括腫瘤細(xì)胞如黑色素瘤細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞(如，被巨細(xì)胞病毒之類的靈長(zhǎng)類DNA病毒或AIDS病毒之類的靈長(zhǎng)類RNA病毒感染的細(xì)胞)。
應(yīng)用本發(fā)明或聯(lián)合其它方案有可能減小或消除動(dòng)物如哺乳動(dòng)物體內(nèi)不需要的免疫應(yīng)答。大體上，本發(fā)明提供了通過(guò)提供包含在藥學(xué)可接受制劑中的有效量sc—TCR蛋白而減小或消除哺乳動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答的治療方法?；蛘?，可溶性融合蛋白的sc—TCR部分可應(yīng)用于治療方法中。sc—TCR融合蛋白或sc—TCR一般能與一個(gè)或多個(gè)TCR，尤其是那些與致病性T細(xì)胞相關(guān)的TCR競(jìng)爭(zhēng)配體(如抗原)。
本發(fā)明還提供增強(qiáng)本文之sc—TCR蛋白的特異性結(jié)合親和力的方法。例如，未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)公開(kāi)了制備sc—TCR“突變型蛋白(mutein)”的方法，該“突變型蛋白”對(duì)抗原的特異性結(jié)合親和力比相應(yīng)TCR(即天然含有sc—TCR融合蛋白Vαβ鏈的TCR)的高約2—10倍。這類方法一般包括用標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸定向引物誘變sc—TCR分子，以將一或多個(gè)預(yù)定氨基酸突變導(dǎo)入分子，從而增進(jìn)特異性結(jié)合。所公開(kāi)的sc—TCR突變型蛋白尤其可用于體外和體內(nèi)，如參與對(duì)涉及不需要之免疫應(yīng)答的T細(xì)胞的抑制或清除。該未決的美國(guó)專利申請(qǐng)中公開(kāi)的方法能方便地適用于按所需增進(jìn)本文之sc—TCR融合蛋白和sc—TCR分子的特異性結(jié)合。
此外，本發(fā)明的特點(diǎn)還在于制備與能TCR特異性結(jié)合之抗體(多克隆、單克隆或嵌合的)的方法。這類方法常包括用相當(dāng)純的sc—TCR蛋白樣品作免疫原。有時(shí)優(yōu)選用如sc—TCR分子作免疫原以使對(duì)免疫反應(yīng)性Ig—CL鏈或片段的免疫排斥作用減至最小?？贵w實(shí)例有經(jīng)常規(guī)雜交瘤技術(shù)所得單克隆抗體?？贵w也可從包含一或多個(gè)sc—TCR表位的免疫原性肽生成。這些抗體有多種應(yīng)用，包括檢測(cè)生物學(xué)樣品如血液、血清或組織標(biāo)本中的致病性T細(xì)胞。如曾指出，抗體可通過(guò)減少靶T細(xì)胞與抗原或MHC／HLA肽復(fù)合體的相互作用而在體內(nèi)或體外顯著消除或抑制靶T細(xì)胞的活性。在某些設(shè)計(jì)方案中，經(jīng)本領(lǐng)域內(nèi)熟知方法使抗體共價(jià)連接適當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性、抗代謝或可測(cè)性標(biāo)記將很有幫助。
本發(fā)明進(jìn)一步提供經(jīng)對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量sc—TCR蛋白或sc—TCR分子，包括由sc—TCR融合蛋白制備的sc—TCR，而誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物，尤其人類這樣的靈長(zhǎng)類的免疫應(yīng)答的方法。若用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的是sc—TCR融合蛋白，優(yōu)選Ig—CL鏈或片段的單元型與所用宿主相容。利用這些免疫原，就有可能使哺乳動(dòng)物對(duì)出現(xiàn)在T細(xì)胞(即靶T細(xì)胞)表面并涉及致病性或不需要的免疫應(yīng)答的TCR抗原性結(jié)構(gòu)產(chǎn)生免疫。這類T細(xì)胞可經(jīng)常規(guī)方法鑒別，或有必要還可純化并分析其增殖能力。鑒別、純化和分析T細(xì)胞的方法如下述。
表現(xiàn)所需增殖應(yīng)答的T細(xì)胞可建立細(xì)胞系，從中分離核酸并用于產(chǎn)生sc—TCR融合蛋白?？蔀榘械哪康腡CR抗原性結(jié)構(gòu)常包括克隆型(clonotypic)表位、V—α或V—β家族特異性表位、構(gòu)象表位和線性表位?？筎CR抗原性結(jié)構(gòu)的免疫常抑制T細(xì)胞活性，從而減少或清除致病性T細(xì)胞或產(chǎn)生不利影響的T細(xì)胞。哺乳動(dòng)物常通過(guò)施用免疫有效量(即能產(chǎn)生有效抗體效價(jià))并包含在藥學(xué)可接受混合物中的sc—TCR或sc—TCR融合蛋白進(jìn)行免疫，以使靶T細(xì)胞被宿主免疫系統(tǒng)耗盡或清除。
本發(fā)明還涉及對(duì)能特異性結(jié)合TCR的小分子進(jìn)行檢測(cè)的試驗(yàn)。這類試驗(yàn)一般是體外篩選，其中本發(fā)明之sc—TCR蛋白與固相支持物(如微滴板)結(jié)合并與目的小分子在適于sc—TCR與該小分子特異性結(jié)合的條件下一起溫育。例如，目的sc—TCR或sc—TCR融合蛋白可用于熟知的淘選型篩選以檢測(cè)并分離特異性結(jié)合TCR V區(qū)的小分子。在一些實(shí)例中優(yōu)選應(yīng)用sc—TCR融合蛋白，以便使Ig—CL或相應(yīng)Ig—CL片段與固相支持物結(jié)合，從而使支持物與sc—TCR V區(qū)的相互干擾減至最小。
本發(fā)明特別涉及用以檢測(cè)能抑制超抗原或肽—MHC復(fù)合體與TCR之間特異性結(jié)合的小分子的篩選方法。一般而言，這類篩選方法涉及體外試驗(yàn)，其中本發(fā)明之sc—TCR蛋白與小分子及超抗原或肽—MHC復(fù)合體在允許可溶性融合蛋白形成特異性結(jié)合復(fù)合體的條件下一起溫育。在單獨(dú)的對(duì)照反應(yīng)中，可溶性融合蛋白與超抗原或肽—MHC復(fù)合體在相同溫育條件下溫育。然后按常規(guī)蛋白結(jié)合試驗(yàn)技術(shù)選擇能抑制超抗原或肽—MHC復(fù)合體與sc—TCR特異性結(jié)合的配體。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)經(jīng)組合類型化學(xué)產(chǎn)生的配體的篩選方法。例如，在一項(xiàng)試驗(yàn)中，目的sc—TCR分子與固相支持物結(jié)合，并與第一已知配體如某超抗原及由常規(guī)組合化學(xué)產(chǎn)生的第二配體系列混合。第二配體系列的一個(gè)實(shí)例是常有一個(gè)預(yù)定氨基酸有差別的肽集合。然后將溫育條件定為適合第一配體與sc—TCR蛋白的特異性結(jié)合的條件。第二配體系列中能有效阻斷sc—TCR蛋白與第一配體相互作用的肽可按標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)并分離。如此篩選測(cè)得的配體具有多種用途，包括用于藥用組合物以及體外和體內(nèi)檢測(cè)APC。
本文參考的所有文獻(xiàn)均為全文參考。以下非限制性實(shí)施例可舉例說(shuō)明本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B圖示pJRS149(1A)和pKC12．2(1B)載體。
圖2為概述各種DNA載體之構(gòu)建的流程圖。
圖3為概述從pKC12．2構(gòu)建pKC45，pKC46(pSUN18)和pKC51 DNA載體的流程圖。
圖4圖示PEN2 DNA載體。
圖5圖示pKC60和pKC67 DNA載體的插入物。
圖6(6A—6G)列表顯示用于構(gòu)建下述DNA載體的寡核苷酸引物。圖6A(SEQ ID NO1—16)，圖6B(SEQ ID NO17—30)，圖6C(SEQ ID NO31—45)，圖6D(SEQ ID NO46—63)，圖6E(SEQ ID NO64—79)，圖6F(SEQ ID NO80—95)，圖6G(SEQ ID NO96—100)。
圖7列表顯示用于構(gòu)建sc—TCR融合蛋白V—β鏈的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO101—115)。
圖8列表顯示用于構(gòu)建sc—TCR融合蛋白V—β鏈的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO116—130)。
圖9A和9B圖示pKC60—m、pKC67—m、pKC73—m、pKC74—m、pKC75—m的插入物(9A)和pNAG—I—m和pNAG3—m的插入物(9B)。
圖10圖示含有sc—TCR融合蛋白的哺乳動(dòng)物DNA表達(dá)載體。編碼sc—TCR(“sc—TCR變體”)的DNA插入物與小鼠κ內(nèi)含子和小鼠κ外顯子融合。
圖11(包括圖11a和11b)列表顯示用于構(gòu)建sc—TCR融合蛋白的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO7，10，60，75，131—145)。
圖12顯示產(chǎn)生于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的sc—TCR(D011．10)κ融合蛋白的蛋白印跡。
圖13顯示純化的sc—TCR(D011．10)κ融合蛋白的蛋白印跡。
圖14是用考馬斯亮蘭染色的SDS—PAGE凝膠，示純化的sc—TCRκ融合蛋白的染色。
圖15顯示三結(jié)構(gòu)域sc—TCR—κ融合蛋白和四結(jié)構(gòu)域sc—TCR—κ融合蛋白瞬時(shí)表達(dá)的蛋白印跡。
圖16圖示sc—TCR(DO11．10)κ融合蛋白變異體瞬時(shí)表達(dá)的ELISA試驗(yàn)。
圖17圖示sc—TCR(p—149)κ融合蛋白之哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的夾心ELISA試驗(yàn)。
圖18圖示p149 sc—TCR和p149 sc—TCRκ融合蛋白之哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的夾心ELISA試驗(yàn)。
發(fā)明詳述如上簡(jiǎn)述，我們發(fā)現(xiàn)制備和應(yīng)用完全可溶并有功能的sc—TCR是可能的。例如，有可能通過(guò)與Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段共價(jià)連接促進(jìn)sc—TCR分子的可溶性表達(dá)。一般而言，sc—TCR蛋白包括V—α鏈與V—β鏈經(jīng)單鏈肽連接序列共價(jià)連接。sc—TCR融合蛋白包括與V—α鏈或V—β鏈融合的Ig—CL鏈或合適鏈片段。與Ig—CL鏈或片段的融合可增強(qiáng)完全有功能的sc—TCR在多種細(xì)胞中的可溶性表達(dá)。
一般，此sc—TCR蛋白的制備可按本文所公開(kāi)的過(guò)程，經(jīng)公認(rèn)的重組DNA技術(shù)完成。例如，質(zhì)粒DNA的制備、DNA的限制酶剪切、DNA連接、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)、所表達(dá)蛋白的分離和純化均為已知技術(shù)。總參見(jiàn)Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版，1989)；和Ausubel等(1989)，分子生物學(xué)最新方案，John Wiley&Sons，紐約。
sc—TCR分子的一般結(jié)構(gòu)及其制備和應(yīng)用方法已公開(kāi)于未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)。
簡(jiǎn)而言之，sc—TCR分子包括經(jīng)適當(dāng)肽連接序列共價(jià)連接的V—α鏈和V—β鏈。例如，V—α鏈和V—β鏈可通過(guò)與V—α鏈C端和V—β鏈N端融合的適當(dāng)肽連接序列共價(jià)連接。sc—TCR融合蛋白的V—α鏈和V—β鏈一般約200—400個(gè)氨基酸長(zhǎng)，優(yōu)選約300—350個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并與天然TCR的V—α鏈和V—β鏈至少90％相同，優(yōu)選100％相同。術(shù)語(yǔ)“相同”指V—α鏈或V—β鏈的氨基酸100％同源于相應(yīng)天然TCR的V—α鏈或V—β鏈。
sc—TCR分子的V—α鏈可再包含與V—β鏈C端融合的C—β鏈或其片段。V—α鏈還可包含與V—α鏈的C端及肽連接序列的N端融合的C—α鏈或其片段。通常在那些包含C—β鏈片段的融合蛋白中，片段長(zhǎng)約50—126個(gè)氨基酸，且常不含最后的第127位半胱氨酸殘基。而含C—α鏈的融合蛋白中，片段長(zhǎng)可在約1—90個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)變化(即最多至但不含最后的半胱氨酸的C—α鏈)。例如一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含約1—72個(gè)氨基酸、位于第1至72位氨基酸的C—α鏈片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，C—α鏈片段約1—22個(gè)氨基酸，位于第1至第22位(亮氨酸)。C—α鏈片段通常不含任何半胱氨酸殘基，一個(gè)例外是Cα90變異體包含兩個(gè)半胱氨酸殘基。為促進(jìn)完全可溶并有功能的蛋白的表達(dá)，Ig—CL鏈或合適片段共價(jià)連接于sc—TCR分子上，如連接于V—β鏈或C—β片段的C端。盡管一般并不優(yōu)選，但I(xiàn)g—CL鏈或其片段可能共價(jià)連接于V—α鏈N端。在大多數(shù)實(shí)例中，Cα和Cβ鏈長(zhǎng)度的選擇將取決于幾種參數(shù)，包括所選特定V鏈和可溶性融合分子的預(yù)期應(yīng)用。
本發(fā)明的其它sc—TCR蛋白包括如兩個(gè)肽連接序列，其中第一個(gè)肽連接序列融合在V—α鏈C端和V—β鏈N端之間。V—β鏈C端可與C—β鏈片段N端融合。第二個(gè)肽連接序列再與V—β鏈或C—β鏈片段的C端以及Ig—CL鏈或其片段或效應(yīng)物或標(biāo)記分子等的N端融合。
在其它實(shí)施方案中，sc—TCR蛋白可通過(guò)將V—β鏈與V—α鏈經(jīng)適當(dāng)肽連接序列融合而制成，其中V—β鏈或C—β鏈片段的C端與V—α鏈的N端共價(jià)連接。Ig—CL鏈或其片段可按需要共價(jià)連接于分子的C或N端，但一般優(yōu)選連接于C端。
本發(fā)明之scTCR蛋白可包含一或多個(gè)融合蛋白標(biāo)記。例如，就可溶性融合蛋白而言，蛋白標(biāo)記可融合于sc—TCR V—β鏈(或C—β鏈片段)的C端以及Ig—CL鏈或其片段的N端。sc—TCR融合蛋白可因此包括如兩個(gè)蛋白標(biāo)記，其中第一個(gè)標(biāo)記融合在V—β鏈(或C—β鏈片段)的C端以及Ig—CL鏈或其片段的N端，第二個(gè)標(biāo)記(相同或不同的)融合在Ig—CL鏈或其片段的C端?；蛘?，單一的蛋白標(biāo)記可融合于Ig—CL鏈或其片段的C端。
也涉及諸如含有一或多個(gè)蛋白標(biāo)記融合于V—α鏈N端的融合體之類的其它sc—TCR融合蛋白。
sc—TCR蛋白的肽連接序列通常選擇成能使sc—TCR分子生成與天然TCR V—α鏈和V—β鏈的類似的結(jié)合位點(diǎn)。Vα鏈和Vβ鏈可衍生自未經(jīng)誘導(dǎo)的T細(xì)胞，但大多數(shù)情況下V鏈?zhǔn)桥c病理如免疫相關(guān)失調(diào)或疾病有關(guān)的形式。
更尤其是，分隔Vα，β鏈的肽連接序列靈活地將V鏈定位于能特異性結(jié)合配體如目的抗原的口袋中。例如，結(jié)合sc—TCR融合蛋白的配體可用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，如下述試驗(yàn)所測(cè)。這類試驗(yàn)實(shí)例有體外試驗(yàn)，包括幾個(gè)連續(xù)步驟培養(yǎng)表達(dá)TCR的T細(xì)胞、用sc—TCR蛋白(或從中獲得的sc—TCR)在允許TCR與配體結(jié)合的條件下與T細(xì)胞接觸，然后評(píng)估可溶性融合蛋白是否能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性。Ig—CL鏈或Ig—CL鏈片段與sc—TCR分子的融合在某些方案中可通過(guò)例如促進(jìn)sc—TCR的可溶性表達(dá)及維持sc—TCR在水溶液如細(xì)胞培養(yǎng)液中的完整性而提高試驗(yàn)性能。
如上述，本發(fā)明sc—TCR融合蛋白之一包含與如sc—TCR分子C端共價(jià)連接的Ig—CL鏈或合適Ig—CL鏈片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，sc—TCR融合蛋白包含融合的哺乳動(dòng)物Ig—CL鏈，優(yōu)選小鼠或人類全長(zhǎng)Ig—CL鏈，如Cκ鏈。幾種Ig—CL鏈的核酸和蛋白序列業(yè)已公開(kāi)。見(jiàn)如基礎(chǔ)免疫學(xué)，(1993)第三版，W．Paul編，Rsen出版公司，紐約；和Kabat，E．A．等，(1991)有免疫學(xué)意義之蛋白的序列(第五版)公共健康服務(wù)機(jī)構(gòu)，國(guó)立衛(wèi)生研究所。
術(shù)語(yǔ)Ig—CL鏈亦包括與所公開(kāi)的全長(zhǎng)序列有一或多個(gè)氨基酸替換或添加的區(qū)別的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)。例如，可在所公開(kāi)之Ig—CL鏈序列一或兩個(gè)鏈末端經(jīng)如常規(guī)重組方法加入一個(gè)氨基酸。此外，重組方法可用于根據(jù)需要在鏈中替換指定氨基酸。氨基酸添加通常有約1—30個(gè)中性或親水性氨基酸，優(yōu)選約1—10個(gè)這類氨基酸。Ig—CL鏈中一個(gè)氨基酸被另一個(gè)氨基酸替換應(yīng)是保守或非保守的氨基酸替換。故Ig—CL鏈序列中酪氨酸被苯丙氨酸替換就代表了氨基酸保守替換的實(shí)例，而精氨酸被丙氨酸替換是氨基酸非保守替換。正如下文將就Ig—CL鏈片段而指出，含有融合的Ig—CL鏈的sc—TCR融合蛋白將是完全可溶并有功能的。
此外，下文特別公開(kāi)的優(yōu)選Ig—CL鏈序列中氨基酸的替換或添加將屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
在某些實(shí)例中，應(yīng)用Ig—CL鏈片段如小鼠或人類Cκ鏈片段將十分有利。例如，當(dāng)需要減小融合蛋白的分子量時(shí)，可以將適當(dāng)?shù)腎g—CL鏈片段與sc—TCR分子融合?！斑m當(dāng)?shù)腎g—CL鏈片段”或相關(guān)術(shù)語(yǔ)指當(dāng)與目的sc—TCR分子融合時(shí)形成下文規(guī)定的完全可溶并有功能的sc—TCR融合蛋白的Ig—CL片段。目的Ig—CL鏈片段(包括Cκ和Cλ型)可按常規(guī)重組方法制備，如經(jīng)PCR擴(kuò)增小鼠或人類Cκ或Cλ鏈片段，然后將PCR產(chǎn)物連接至編碼目的sc—TCR分子的DNA區(qū)段或載體上。如下文指出，可加工PCR產(chǎn)物使其包含限制酶剪切位點(diǎn)以利于克隆。適當(dāng)?shù)男∈蠡蛉祟怌κ鏈片段一般約在70—150個(gè)，優(yōu)選約90—120個(gè)，更優(yōu)選約100—110個(gè)氨基酸長(zhǎng)度之間。適當(dāng)?shù)男∈蠡蛉祟怌κ鏈DNA序列的實(shí)例如下述。見(jiàn)實(shí)施例5、6和7。
本發(fā)明的sc—TCR是完全有功能并可溶的。術(shù)語(yǔ)“完全有功能”或類似術(shù)語(yǔ)指融合蛋白能特異性結(jié)合配體。檢測(cè)這種特異性結(jié)合的試驗(yàn)已在此公開(kāi)，包括常規(guī)免疫印跡技術(shù)如蛋白印跡。
術(shù)語(yǔ)“完全可溶”或類似術(shù)語(yǔ)指融合蛋白低速離心時(shí)不易自水溶液如細(xì)胞培養(yǎng)液中沉淀。而且，如果sc—TCR融合蛋白在高于約5—37℃的溫度下，在中性或接近中性pH的條件下，有低濃度陰離子或非離子去污劑或不含去污劑時(shí)保持于水溶液中，則它是可溶性的。此時(shí)，可溶性蛋白常常有低沉降值，如少于約10—50 svedberg單位。此處的水溶液通常含有緩沖化合物以穩(wěn)定pH(一般在約pH5—9之間)和離子強(qiáng)度(在約2mM—500mM之間)。有時(shí)加入蛋白酶抑制劑或溫和的非離子去污劑，必要時(shí)還可加入載體蛋白如牛血清白蛋白(BSA)至數(shù)毫克／毫升。含水緩沖液的實(shí)例有標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖液、tris鹽緩沖液或其它已知緩沖液以及細(xì)胞培養(yǎng)液。
如上文指出，已發(fā)現(xiàn)很多sc—TCR分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)即使未融合Ig—CL鏈或其片段也是完全有功能并可溶的。例如，圖9B下部所示pNAG3—m和p149—m載體編碼的sc—TCR分子在下文特指的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)完全有功能并可溶。pNAG3—m載體編碼的sc—TCR分子中依次共價(jià)連接有Vα鏈、Cα鏈、肽連接序列、Vβ鏈和Cβ鏈。公開(kāi)的還有在Cα鏈中包含氨基酸缺失至多達(dá)全長(zhǎng)Cα鏈的sc—TCR分子。參見(jiàn)圖9A和9B下部以及圖5所示pKC60載體。此外，未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)公開(kāi)了包含依次共價(jià)連接的Vα鏈、Cα鏈片段、肽連接序列和Vβ鏈的sc—TCR分子的制備方法。因而，有可能制備包含修飾的(或缺失的)Cα和Cβ鏈、無(wú)Ig—CL鏈或合適片段融合的各種sc—TCR分子。sc—TCR分子可根據(jù)在此所述方法檢驗(yàn)在特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的可溶性表達(dá)。
本發(fā)明之sc—TCR大都由RNA、mRNA、cDNA或基因組DNA等核酸區(qū)段編碼。通常，核酸區(qū)段為DNA區(qū)段。例如，本發(fā)明之DNA區(qū)段通常包括可操作連接的前導(dǎo)序列，以提供適當(dāng)?shù)募?xì)胞加工信號(hào)。一般而言，前導(dǎo)序列與編碼sc—TCR的DNA序列的5’端融合。例如，前導(dǎo)序列可與編碼V—α鏈(或在有些實(shí)施方案中是編碼V—β鏈)之DNA序列的5’端融合。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，盡管是將特定前導(dǎo)序列與特定α或β鏈連接，但仍常?？捎弥亟M技術(shù)替換這些前導(dǎo)序列，而不會(huì)對(duì)融合蛋白的加工產(chǎn)生有害影響。故在一實(shí)施方案中，V—α鏈5’端與適當(dāng)前導(dǎo)序列的3’端共價(jià)連接。前導(dǎo)序列大都約12—26個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。設(shè)計(jì)用于插入細(xì)菌表達(dá)載體的DNA區(qū)段可包括Pel B序列，而用于插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的DNA區(qū)段可包括Ig—CL前導(dǎo)序列，如哺乳動(dòng)物Cκ前導(dǎo)序列。下文將提供Cκ前導(dǎo)序列的實(shí)例。
術(shù)語(yǔ)“可操作連接”指遺傳序列與核酸區(qū)段、或給定片段或序列的5’上游序列或3，下游序列有效地(即有功能地)連接。那些鄰近序列常常對(duì)該核酸區(qū)段或序列在目的細(xì)胞類型中的加工和／或表達(dá)具有有利影響。
本發(fā)明用于細(xì)菌表達(dá)的DNA載體可包括啟動(dòng)子如trp操縱子啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trp—lac啟動(dòng)子、1acuvs或phoA啟動(dòng)子。啟動(dòng)子實(shí)例如phoA，它在慢誘導(dǎo)條件下可持續(xù)數(shù)小時(shí)(如2—10小時(shí))提供強(qiáng)烈的、受調(diào)節(jié)的表達(dá)。在適當(dāng)培養(yǎng)條件下，大多數(shù)強(qiáng)啟動(dòng)子都能提供水平高達(dá)甚至超過(guò)宿主蛋白總量之10％的可溶性融合蛋白。
可溶性融合蛋白的單鏈V區(qū)可衍生自幾乎任何TCR V區(qū)。合適的Vαβ鏈常常是那些免疫誘導(dǎo)后基因表達(dá)增加的鏈。分析TCR V鏈表達(dá)增加的方法已為人知(見(jiàn)如Hafler，D．A．等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1671313(1988)；Mantgazza，R．等，自身免疫力3，431(1990))。
sc—TCR融合蛋白可包含能方便得到基本全長(zhǎng)編碼序列的Vα、β鏈。自細(xì)胞中獲得全長(zhǎng)TCR V鏈序列的方法為已知?；蛘?，Vα、β鏈區(qū)可通過(guò)對(duì)公開(kāi)提供的、至少部分序列已知的Vα、β鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增而獲得。Vβ基因序列的實(shí)例有Vβ8．1、Vβ6．1、Vβ5．1、Vβ5．2、Vβ5．3、Vβ2．1和Vβ2．3基因序列。見(jiàn)Abe等(1992)PNAS(USA)894066；Wang等，(1993)；PNAS(USA)90188；Lahesma等(1993)免疫學(xué)雜志1504125；Kotzin等(1991)PNAS(USA)889161；Uematsu等(1991)PNAS(USA)888534。其它TCR V鏈序列亦見(jiàn)Kabat，E．A．等(文獻(xiàn)同上)和Chotia，C．等(1988)EMBO雜志73745。
此外，實(shí)施例3提供了用于PCR擴(kuò)增各種V—α和V—β鏈的寡核苷酸引物。適當(dāng)寡核苷酸引物的其它實(shí)例亦見(jiàn)圖7和8。
若想從生物學(xué)來(lái)源獲得TCRV鏈，可按標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法鑒別目的TCR，包括應(yīng)用主要結(jié)合TCR V區(qū)某表位并優(yōu)選特異于該表位的TCR特異性抗體。通常，表面表達(dá)可通過(guò)已知技術(shù)如熒光顯微術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、或免疫化學(xué)進(jìn)行檢測(cè)。特異性結(jié)合TCR可變區(qū)的很多抗體均為已知。見(jiàn)如已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)WO 90／06758。
可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的雜交方法，用針對(duì)各種TCR基因家族的寡核苷酸探針進(jìn)行特異性雜交而直接探測(cè)，或優(yōu)選在PCR擴(kuò)增后探測(cè)所測(cè)TCR的DNA或RNA。一般執(zhí)行高嚴(yán)謹(jǐn)度核酸雜交條件。術(shù)語(yǔ)“高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交”指核酸在約65℃、0．1xSSC的條件下溫育。見(jiàn)Sambrook等，文獻(xiàn)同上。TCR DNA序列或其目的部分可直接從擴(kuò)增的DNA或RNA獲得并可根據(jù)需要亞克隆入適當(dāng)載體。
已知有其它方法可獲得TCR V區(qū)DNA。例如，含V區(qū)基因的目的TCR可通過(guò)對(duì)TCR或其相應(yīng)于V區(qū)的優(yōu)選部分測(cè)序而鑒別。DNA序列可在將DNA克隆進(jìn)本領(lǐng)域內(nèi)已知的適當(dāng)測(cè)序載體之后或通過(guò)首先測(cè)定TCR的至少部分蛋白序列再測(cè)定DNA序列而測(cè)定。本領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員均知，上述操作及技術(shù)人員熟知的其它操作可用于成功鑒別目的TCR并從該TCR獲得V區(qū)基因，從而制備出單鏈Vαβ構(gòu)建體以與目的Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段融合。
更為特別的是，當(dāng)需要從生物來(lái)源獲得TCR V區(qū)DNA時(shí)，編碼目的V—α和V—β鏈的DNA區(qū)段可從細(xì)胞如T細(xì)胞雜交瘤或細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)獲得。T細(xì)胞(如Ts、Tc或TH細(xì)胞)可體內(nèi)獲得，或T細(xì)胞可以是培養(yǎng)的T細(xì)胞雜交瘤(如D10或B12細(xì)胞系)。參見(jiàn)以下實(shí)施例1。CTL可以是未經(jīng)誘導(dǎo)的或可與嚙齒類(如小鼠、大鼠、家兔)或靈長(zhǎng)類(如人類或黑猩猩)的免疫系統(tǒng)致病性應(yīng)答相關(guān)。例如，CTL或其它T細(xì)胞可來(lái)自已確診或疑有以下疾病的病人萊姆病、Kawasaki病、麻風(fēng)病、癌癥(即對(duì)腫瘤相關(guān)抗原如CEA的免疫應(yīng)答)、或自身免疫病(尤其是與移植排斥有關(guān)的疾病)、多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和過(guò)敏；或傳染病，尤其是與RNA或DNA病毒有關(guān)的傳染病。具體的目標(biāo)病毒包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、流感病毒、肝炎病毒、痘病毒、EB病毒、腺病毒或多瘤病毒。CTL來(lái)源的實(shí)例是從已有腺癌和黑色素瘤的病人分離的抗原特異性CTL和TIL(見(jiàn)如，Cox等，科學(xué)(1994)264716；Rosenberg，S．A．等N．Eng．J．Med．(1988)3191676；Kawakami，Y．等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1994)180347；Kawakami，Y．等PNAS(1994)916458)。
如前文關(guān)于自細(xì)胞獲得V—α和V—β鏈的敘述，好幾種可替換的方案可用于制備從中分離的核酸。更具體地說(shuō)，為制備V—α和V—β鏈DNA，從那些證實(shí)了有所需TCR結(jié)合特異性的細(xì)胞中分離mRNA。這類方法一般包括應(yīng)用合適的PCR方案，其中使用得自mRNA的第一鏈cDNA模板。然后可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)制備所需α和β鏈。然后可修飾編碼所需α和β鏈的DNA區(qū)段以便包含適當(dāng)?shù)碾倪B接序列和蛋白標(biāo)記(若有必要)。
一般地，PCR方法中所用DNA寡核苷酸引物約長(zhǎng)12—50個(gè)核苷酸，優(yōu)選約長(zhǎng)20—25個(gè)核苷酸。PCR寡核苷酸引物可適當(dāng)包含限制位點(diǎn)以便按需要向PCR產(chǎn)物中加入特異性限制酶切割位點(diǎn)。引物實(shí)例均提供在隨后的實(shí)施例和附圖中。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物將包含擴(kuò)增的V—α和V—β鏈序列，并可作修飾以便按所需包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)、前導(dǎo)序列和啟動(dòng)子序列以得到融合蛋白的最佳表達(dá)。
編碼目的sc—TCR分子的DNA區(qū)段可按下述方法大量制備(每克細(xì)菌細(xì)胞毫克量)。
以下提供的用于制備可溶性融合蛋白的特定sc—TCR包括帶有哺乳動(dòng)物V—α和V—β鏈的sc—TCR。實(shí)例有靈長(zhǎng)類，尤其是人類和黑猩猩；嚙齒類，如免疫原初小鼠如裸鼠或帶有能表達(dá)HLA—A2抗原復(fù)合體的轉(zhuǎn)基因的小鼠(Vitiello，A．等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1991)175，1002)。特定目標(biāo)人群包括那些有上述任一病理如自身免疫病的人。包含來(lái)自不同哺乳動(dòng)物的V—α和V—β鏈DNA序列的嵌合構(gòu)建體可按已知方法構(gòu)建，并也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
如上述，肽連接序列可有效地將融合蛋白V—α和V—β鏈定位，以形成配體結(jié)合口袋?？扇苄匀诤系鞍滓虼四芴禺愋越Y(jié)合配體如超抗原、或MHC／HLA肽復(fù)合體相關(guān)肽抗原、或小分子。特別指出，本發(fā)明目標(biāo)之一是提供能與T細(xì)胞表面的天然TCR競(jìng)爭(zhēng)的可溶并完全有功能的sc—TCR融合分子。術(shù)語(yǔ)“競(jìng)爭(zhēng)”指可溶性融合蛋白能夠以等同于或在某些情況下超過(guò)TCR對(duì)相同配體之特異性結(jié)合親和力的水平結(jié)合配體。例如，根據(jù)下述方法，sc—TCR融合蛋白(或由其衍生的sc—TCR分子)能有與天然TCR大致相當(dāng)或高出多達(dá)約2—10倍的結(jié)合親和力。
通常，與缺少融合Ig—CL鏈或其片段的sc—TCR分子相比，目的Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段的融合對(duì)sc—TCR融合蛋白特異性結(jié)合力的減小不超過(guò)30％，優(yōu)選不超過(guò)10％，更優(yōu)選不超過(guò)5％或更低。結(jié)合試驗(yàn)實(shí)例已在此公開(kāi)，包括下述標(biāo)準(zhǔn)蛋白印跡試驗(yàn)和表面等離子體激元共振(Surface Plasmon Resonance)試驗(yàn)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽連接序列有約7—20個(gè)氨基酸，優(yōu)選約10—20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選約12—20個(gè)氨基酸。連接序列通常柔性地位于融合蛋白中，可使V—α和V—β鏈定位于可提供目的配體如肽抗原特異性結(jié)合的構(gòu)象。連接序列優(yōu)選主要包含帶小側(cè)鏈的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸，以提供最佳彈性。優(yōu)選地，連接序列的約80％或90％或更多包含甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸殘基，尤其是甘氨酸和絲氨酸殘基。優(yōu)選連接序列不含任何可抑制彈性的脯氨酸殘基。連接序列適當(dāng)?shù)剡B接于融合蛋白中V—α鏈的C端和V—β鏈的N端。見(jiàn)以下實(shí)施例1和2。
更尤其是，適當(dāng)連接序列包括(GGGGS)4序列(即(Gly Gly Gly GlySer)4)，如JA302(SEQ ID NO96)和JA301(SEQ ID NO95)。優(yōu)選地，所選連接序列共價(jià)連接于sc—TCR V—α鏈的C端殘基和V—β鏈的第一個(gè)氨基酸之間。然而，如前述，也可能是其它肽連接序列構(gòu)型，其中部分包含與Ig—CL鏈或合適Ig—CL鏈片段如Cκ鏈片段的融合。已公開(kāi)多種可用于連接抗體可變區(qū)的多肽連接序列(見(jiàn)M．Whitlow等，方法酶學(xué)方法手冊(cè)，297—105(1991))?；蛘?，可憑經(jīng)驗(yàn)輕易鑒別其它合適的連接序列。例如，可以克隆并表達(dá)包含帶連接序列的融合蛋白的編碼DNA的DNA載體，并檢驗(yàn)融合分子是否能結(jié)合抗原。一項(xiàng)試驗(yàn)實(shí)例是標(biāo)準(zhǔn)抗原結(jié)合試驗(yàn)如Harlow&Lane，文獻(xiàn)同上所公開(kāi)的。或者，可檢驗(yàn)所表達(dá)的、含連接序列的融合蛋白調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的能力，如本文參考試驗(yàn)所測(cè)。見(jiàn)以下實(shí)施例8、10和11。連接序列的合適大小和序列也可通過(guò)基于融合蛋白之預(yù)定大小和形狀的常規(guī)計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)測(cè)定。肽連接序列實(shí)例有在V—α和V—β鏈之間的多肽連接序列末端包含適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)(如XhoⅠ和SpeⅠ)的那些。
多數(shù)實(shí)例中，編碼目的sc—TCR分子的DNA區(qū)段可經(jīng)基因工程重組進(jìn)入適當(dāng)?shù)腄NA載體。例如，在目的V鏈?zhǔn)墙?jīng)PCR擴(kuò)增的實(shí)施方案中，寡核苷酸引物常在其兩末端具有所需限制性位點(diǎn)，以便可用另一目的DNA區(qū)段替換該DNA區(qū)段。
因此，本發(fā)明之合適DNA載體是目的sc—TCR分子可輕易插入其中的載體。有時(shí)，當(dāng)制備可溶性融合分子時(shí)，Ig—CL鏈或合適Ig—CL鏈片段將由該載體編碼并通過(guò)連接與此DNA區(qū)段融合。其它實(shí)例中，Ig—CL鏈或片段將在與載體連接之前與DNA區(qū)段融合。
本文所用術(shù)語(yǔ)“載體”指能摻入宿主細(xì)胞導(dǎo)致目的核酸區(qū)段如編碼上述sc—TCR融合蛋白的區(qū)段或序列表達(dá)的任何目的核酸序列。載體可包括如線性核酸區(qū)段或序列、質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒和外源染色體DNA。特定地，載體可為重組DNA。本文所用術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”或“基因表達(dá)”指目的核酸序列的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生，包括DNA轉(zhuǎn)錄和RNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯。通常將編碼本發(fā)明sc—TCR融合蛋白的DNA區(qū)段插入載體，優(yōu)選DNA載體中，以便在合適的宿主細(xì)胞中復(fù)制該DNA區(qū)段。
在目的細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明sc—TCR蛋白的方案很多。例如，可將編碼sc—TCR蛋白的DNA序列摻入DNA載體，方法已知如用酶在預(yù)定位點(diǎn)剪切載體，隨后將DNA連接至載體。然后將含DNA序列的載體導(dǎo)入合適的宿主以進(jìn)行sc—TCR蛋白的可溶性表達(dá)。合適載體的選擇可憑經(jīng)驗(yàn)根據(jù)與克隆方案相關(guān)的因素而定。例如，載體應(yīng)與所用宿主細(xì)胞相容，并具有對(duì)其正確的復(fù)制子。而且，載體應(yīng)能容納將表達(dá)的編碼該蛋白的DNA序列。優(yōu)選載體能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)可溶性蛋白，如inVitrogen供應(yīng)的pCDNA3。其它可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的合適載體亦見(jiàn)Sambrook等，文獻(xiàn)同上和Ausubel等，文獻(xiàn)同上。通常，設(shè)計(jì)在細(xì)菌中表達(dá)、編碼可溶性融合蛋白的DNA載體不含全長(zhǎng)Cλ或Cκ內(nèi)含子，但這些序列可包含于設(shè)計(jì)在能剪切RNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體中。
優(yōu)選將DNA載體設(shè)計(jì)成可在真核細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)可溶性sc—TCR。必要時(shí)可安排DNA載體使之在細(xì)菌宿主中復(fù)制，從而可獲得適量DNA載體。例如，DNA載體常包括(ⅰ)在大腸桿菌中有功能的復(fù)制起點(diǎn)；(ⅱ)選擇性抗生素抗性基因；(ⅲ)強(qiáng)病毒啟動(dòng)子如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和可選擇的CMV增強(qiáng)子元件；(ⅳ)Ig—CL前導(dǎo)序列；(ⅴ)目的sc—TCR分子，(ⅵ)與Ig—CL外顯子連接的全長(zhǎng)Ig—CL內(nèi)含子，(ⅶ)生長(zhǎng)激素多聚腺苷化序列如牛生長(zhǎng)激素(bgh)po1y A序列和(ⅷ)選擇性真核標(biāo)記的編碼DNA如與抗生素抗性基因(如新霉素)連接并與病毒性多聚腺苷化序列(如猴病毒40(SV40)poly A序列)融合的強(qiáng)病毒性啟動(dòng)子(如SV40啟動(dòng)子)?；蛘?，DNA載體可包括上述(ⅰ)—(ⅴ)以及(ⅶ)—(ⅷ)，不含(ⅵ)的與Ig—CL外顯子連接的全長(zhǎng)Ig—CL內(nèi)含子。Ig—CL前導(dǎo)序列的實(shí)例有小鼠κ前導(dǎo)序列。全長(zhǎng)Ig—CL內(nèi)含子和外顯子的實(shí)例有全長(zhǎng)Cκ基因。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的DNA載體實(shí)例如圖10(pSUN27載體)。見(jiàn)下述實(shí)施例5。
用于目的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的本發(fā)明DNA載體可經(jīng)常規(guī)技術(shù)修飾以使之在其它哺乳細(xì)胞中的可溶性表達(dá)最優(yōu)化。例如，上述編碼新霉素抗性基因的真核標(biāo)記可由編碼腺苷激酶(TK)基因的DNA取代，從而促進(jìn)sc—TCR融合蛋白在TK—(TK缺陷)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。DNA載體可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它方法修飾，如改變啟動(dòng)子、抗生素抗性基因，用免疫球蛋白啟動(dòng)子、SV40、腺病毒或乳頭瘤病毒啟動(dòng)子取代CMV啟動(dòng)子以使sc—TCR融合蛋白在目的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到最佳表達(dá)?；蛘?，編碼sc—TCR蛋白的DNA序列可根據(jù)需要插入適于酵母或昆蟲細(xì)胞表達(dá)的已知載體。參見(jiàn)如，Ausubel等，文獻(xiàn)同上及Summer&Smith，文獻(xiàn)同上。
適用的宿主細(xì)胞可經(jīng)各種方法轉(zhuǎn)化，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移、病毒或噬菌體感染、鈣、脂質(zhì)體或聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、biolistic轉(zhuǎn)移，或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它這類技術(shù)。
前文已指出，有時(shí)在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)可溶性融合蛋白可能比較理想。例如，適于在細(xì)菌中表達(dá)融合蛋白的宿主細(xì)胞包括易于轉(zhuǎn)化并在培養(yǎng)基中表現(xiàn)快速生長(zhǎng)的細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。其它宿主細(xì)胞包括，酵母如釀酒酵母和昆蟲細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞實(shí)例為桿狀病毒能感染的細(xì)胞如Sf9細(xì)胞。亦參見(jiàn)，Summer&Smith(1988)桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)方法手冊(cè)，德克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站公報(bào)(Texas Agricultural Experimental StationBulletin)第1555號(hào)，學(xué)院站(College Station)，德克薩斯州。
采用的細(xì)胞培養(yǎng)條件一般是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可因如在載體中加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞選擇標(biāo)記(如抗生素抗性基因或G418)而得到選擇的條件。表達(dá)sc—TCR融合蛋白的細(xì)胞可經(jīng)已知過(guò)程如應(yīng)用市售特異性結(jié)合V—α或V—β鏈的單克隆抗體的ELISA試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。或者可選用特異性結(jié)合可溶性融合蛋白Cκ或Cλ鏈(或片段)的單克隆抗體。單克隆抗體和適用的試驗(yàn)的實(shí)例提供在以下實(shí)施例中。
設(shè)計(jì)用于在細(xì)菌中復(fù)制和表達(dá)目的可溶性融合蛋白的載體包括如，(ⅰ)在大腸桿菌中有功能、衍生自如pBR322、優(yōu)選眾所周知的pUC19載體的復(fù)制起始區(qū)；(ⅱ)選擇性抗生素抗性基因，如青霉素和／或新霉素抗性基因；(ⅲ)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，如大腸桿菌trp操縱子的終止區(qū)；(ⅳ)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如phoA、tac、tac—1ac、1acZ、1acuvs、T7或T3啟動(dòng)子；(v)前導(dǎo)序列，如pelB或ompA前導(dǎo)序列；(ⅵ)編碼與目的Ig—CL鏈或合適Ig—CL鏈片段，如全長(zhǎng)小鼠或人類Cκ外顯子融合的sc—TCR的DNA區(qū)段；及(ⅶ)轉(zhuǎn)錄終止子，如來(lái)自大腸桿菌核糖體RNA位點(diǎn)的T1T2序列?；蛘撸d體可包括上述(ⅰ)—(ⅶ)，只是sc—TCR不含融合的Ig—CL鏈或片段。
在細(xì)菌表達(dá)用DNA載體中包含特殊核苷酸序列可在慢誘導(dǎo)條件下輔助sc—TCR融合蛋白的可溶性表達(dá)。例如，下述phoA啟動(dòng)子和pelB前導(dǎo)序列可用于在慢誘導(dǎo)條件下表達(dá)sc—TCR融合蛋白。參見(jiàn)以下實(shí)施例6。在構(gòu)建體中還可包含強(qiáng)翻譯起始序列以提高翻譯效率。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選起始序列是Kozak共有序列(CCACCATG)(SEQ ID NO97)。
DNA載體的前導(dǎo)序列可適宜指導(dǎo)融合蛋白表達(dá)在宿主細(xì)胞膜或宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中，該序列常包括限制酶位點(diǎn)，使編碼如目的V—α鏈的DNA可方便地連接于構(gòu)建體。適宜地，限制酶位點(diǎn)可摻入在前導(dǎo)序列的3’端，有時(shí)本文稱之為連接序列，長(zhǎng)度如約2—10個(gè)密碼子，并與V—α鏈相連，使V—α鏈編碼區(qū)通常為V—α編碼區(qū)的第一個(gè)氨基酸。例如，一個(gè)限制酶位點(diǎn)是Sfi I位點(diǎn)，但也可將其它限制位點(diǎn)插在V—α鏈編碼區(qū)之前，以使V—α鏈能更為便利地插入載體構(gòu)建體。如上述，這類限制酶位點(diǎn)聯(lián)合常位于V—α鏈起點(diǎn)的第二限制酶位點(diǎn)的應(yīng)用，使得可快速、直接地插入各種編碼V—α鏈，或V—α，C—α鏈的序列。優(yōu)選的前導(dǎo)序列包含強(qiáng)翻譯起始位點(diǎn)，而且有時(shí)還在它們的mRNA 3’端包含帽位點(diǎn)。如上述，前導(dǎo)序列實(shí)例包括細(xì)菌表達(dá)用的pelB和OmpA，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用的Cκ小鼠κ鏈前導(dǎo)序列。
sc—TCR蛋白可以各種方式在細(xì)菌中表達(dá)。例如，編碼sc—TCR融合蛋白的DNA載體在細(xì)菌中的表達(dá)可通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間(約2—8小時(shí))慢誘導(dǎo)細(xì)胞完成。例如，如下實(shí)施例6述，DNA載體可制成包括與sc—TCR蛋白編碼序列可操作連接的phoA(強(qiáng))啟動(dòng)子。宿主細(xì)胞可隨后用該DNA載體轉(zhuǎn)化，并使宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中磷酸鹽在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)耗竭，常約2—10個(gè)小時(shí)，更優(yōu)選約4—6小時(shí)。
由本文DNA載體編碼的sc—TCR蛋白可經(jīng)多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。例如，如上述，可溶性融合蛋白可包含一或多個(gè)蛋白標(biāo)記(相同或不同)，包括帶有化學(xué)或蛋白酶切割位點(diǎn)的標(biāo)記。特別是，蛋白標(biāo)記可以是在生理pH下帶電荷的多肽，如6xHIS。在此實(shí)施方案中，可使用適宜的合成基質(zhì)純化融合蛋白。更特別地，該合成基質(zhì)可以是市售sepharose基質(zhì)，如Ni—Sepharose或這類能在約pH6—9結(jié)合6XHIS標(biāo)記的其它適宜基質(zhì)。其它適宜標(biāo)記包括能特異性結(jié)合市售單克隆抗體的EE或myc表位。通常，能與抗體，如單克隆抗體特異性結(jié)合的各種表位均能作為蛋白標(biāo)記。其它適宜的合成基質(zhì)包括已附著了能特異性結(jié)合本發(fā)明sc—TCR蛋白的抗體的基質(zhì)。蛋白標(biāo)記實(shí)例包括帶有腸激酶、因子X(jué)a、蛇毒或凝血酶剪切位點(diǎn)的那些標(biāo)記。參見(jiàn)如，已公布的PCT專利申請(qǐng)WO 96／13593。
表達(dá)的sc—TCR蛋白可用已知方法分離并純化，如免疫親和層析、免疫吸附、免疫沉淀等等。重要的是，制備過(guò)程應(yīng)該不至于為獲得大量融合蛋白而要求比較長(zhǎng)時(shí)間的分離步驟。根據(jù)以下詳述的蛋白純化方法，大多數(shù)sc—TCR蛋白的產(chǎn)量為每約50—100克宿主細(xì)胞糊產(chǎn)2—20毫克。
為制備在此公開(kāi)的sc—TCR蛋白，一般將細(xì)胞提取物或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物離心，所得上清經(jīng)親和或免疫親和層析，如蛋白A或蛋白G親和層析或利用能特異性結(jié)合所表達(dá)sc—TCR融合蛋白的抗體的免疫親和層析方案而純化。這類抗體的實(shí)例如市售能特異性結(jié)合sc—TCR的V—α鏈或V—β鏈的單克隆抗體。這樣的抗體實(shí)例如得自Pharmagen的H57、MR5—2和F23．1?；蛘?，可用能特異性結(jié)合sc—TCR蛋白中免疫球蛋白鏈的市售抗獨(dú)特型抗體純化sc—TCR融合蛋白。這類抗體的應(yīng)用實(shí)例提供在以下實(shí)施例5中。蛋白的單克隆抗體親和純化眾所周知，并已公開(kāi)，如參見(jiàn)Harlow&Lane的《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(1988)一書。
如上述，本發(fā)明之sc—TCR蛋白以可溶并完全有功能的形式提供。因此，sc—TCR蛋白將穩(wěn)定地分泌至培養(yǎng)基中并能特異性結(jié)合目的配體如肽抗原或合成性小分子。更特別地，sc—TCR蛋白在生理?xiàng)l件下、在離液劑如去污劑等基本缺乏或完全缺乏時(shí)一般保持穩(wěn)定。因此，這類可溶性蛋白一般不包括富含疏水氨基酸如發(fā)現(xiàn)于TCR跨膜區(qū)的那些氨基酸的區(qū)。但有時(shí)可包括其適宜部分，只要sc—TCR保持完全可溶即可。即，融合蛋白的表達(dá)不會(huì)導(dǎo)致在相應(yīng)宿主細(xì)胞中形成大量的包涵體。包涵體用顯微鏡或常規(guī)生化技術(shù)如離心沉降可輕易測(cè)得。
本發(fā)明的sc—TCR蛋白可如上述制備，也可按以下實(shí)施例制備。編碼目的V—α或V—β鏈的DNA可來(lái)自如T細(xì)胞、T細(xì)胞雜交瘤系、或公共提供的V—α和V—β鏈序列，如上述。DNA可經(jīng)PCR、克隆或其它適當(dāng)方法擴(kuò)增。例如，可將編碼目的V—α鏈的DNA克隆至適當(dāng)載體，然后克隆編碼目的V—β鏈和適當(dāng)單鏈連接序列的DNA以產(chǎn)生所需sc—TCR。如上述，有時(shí)sc—TCR包含編碼C—α和／或C—β鏈片段的DNA。對(duì)于可溶性sc—TCR融合蛋白，sc—TCR分子構(gòu)建體還與Ig—CL鏈或片段，如小鼠或人類Cκ鏈或合適Cκ鏈片段融合。正如前文已指出，編碼Cκ鏈的DNA可經(jīng)PCR擴(kuò)增并與編碼sc—TCR的DNA連接?；蛘?，Cκ鏈可包含在DNA載體，如Near等(見(jiàn)下文)所公開(kāi)的那些中。再將編碼融合蛋白的DNA區(qū)段導(dǎo)入該DNA載體。DNA載體隨后在宿主細(xì)胞中表達(dá)，收獲融合蛋白，必要時(shí)純化。
本發(fā)明之sc—TCR融合蛋白一般由包含依次以下共價(jià)連接的DNA區(qū)段編碼啟動(dòng)子／前導(dǎo)序列／V—α鏈／單鏈連接序列／V—β鏈／Cκ鏈；啟動(dòng)子／前導(dǎo)序列／V—α鏈／單鏈連接序列／V—β鏈，C—β鏈片段／Cκ鏈；啟動(dòng)子／前導(dǎo)序列／V—α鏈，C—α鏈／單鏈連接序列／V—β鏈／Cκ鏈；或啟動(dòng)子／前導(dǎo)序列／V—α鏈，C—α鏈片段／單鏈連接序列／V—β鏈，C—β鏈片段／Cκ鏈。sc—TCR分子的實(shí)例如上所述，除了Cκ鏈不由該DNA區(qū)段編碼。將編碼sc—TCR蛋白的DNA載體導(dǎo)入目的細(xì)胞，包括本文公開(kāi)的特異性表達(dá)系統(tǒng)，以使融合蛋白可溶性表達(dá)。
在此提供的sc—TCR蛋白可經(jīng)常規(guī)方法修飾以包括多種共價(jià)連接的效應(yīng)物或標(biāo)記。適宜的效應(yīng)物或標(biāo)記包括具有所需生物學(xué)、化學(xué)或生理特性的那些。更特別地，效應(yīng)物分子可以是如植物或細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞毒素，諸如白喉毒素(DT)、志賀毒素、相思豆毒蛋白、霍亂毒素、蓖麻毒蛋白、皂素(saporin)、假單胞菌外毒素(PE)、美洲商陸抗病毒蛋白或gelonin。這些毒素的生物活性片段為本領(lǐng)域內(nèi)已知，包括如DTA鏈和蓖麻毒蛋白A鏈。此外，毒素可以是在細(xì)胞表面具有活性的制劑，如磷脂酶類(如磷脂酶C)。而且，效應(yīng)物分子可以是化療藥物如去乙酰長(zhǎng)春堿酰胺、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、氨甲蝶呤、阿霉素、博來(lái)霉素或順鉑?；蛘撸?yīng)物分子可以是適用于診斷或成像研究的可檢測(cè)性標(biāo)記分子，如碘131、釔90、錸188或鉍212之類的放射性核素。已公開(kāi)的有關(guān)含有效應(yīng)物或標(biāo)記的蛋白制備和應(yīng)用參見(jiàn)如，Moskaug等，生物化學(xué)雜志264，15709(1989)；Pastan，I．等，細(xì)胞47，64L 1986；Pastan等，作為新型治療制劑的重組毒素，生物化學(xué)年鑒61，331，(1992)；“嵌合毒素”O(jiān)1snes和Phil，Pharmac．Ther．，25，355(1982)；已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)WO 94／29350；已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)WO 94／04689；和美國(guó)專利第5，620，939號(hào)。
有關(guān)利用在此公開(kāi)的sc—TCR融合分子和不含融合Ig—CL鏈(或片段)的sc—TCR分子進(jìn)行診斷和成像研究的其它方法和材料的公開(kāi)內(nèi)容，亦參見(jiàn)A．K．Abbas(見(jiàn)下文)及后續(xù)討論。
含有共價(jià)連接的效應(yīng)物分子的可溶性sc—TCR蛋白有多種重要用途。例如，該sc—TCR蛋白可用于將效應(yīng)物分子送至能特異性結(jié)合sc—TCR的特定細(xì)胞。因而，sc—TCR蛋白提供了選擇性損傷和殺死含此配體之細(xì)胞的方法?？捎蓅c—TCR蛋白損傷或殺死的細(xì)胞或組織實(shí)例包括能表達(dá)一或多種可與sc—TCR特異性結(jié)合的配體的腫瘤和病毒感染細(xì)胞。易受損傷或殺死的細(xì)胞或組織可根據(jù)本文公開(kāi)的方法輕易地進(jìn)行分析。
與效應(yīng)物分子融合的sc—TCR蛋白的特別實(shí)例如下諸如以下實(shí)施例6和7公開(kāi)的p149 sc—TCR之類的sc—TCR可用圖9B所示pNAG1或pNAG3載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞而產(chǎn)生。sc—TCR p149蛋白識(shí)別呈遞于人類HLA抗原中的由人類野生型p53腫瘤抑制蛋白加工的肽片段；HLA—2．1。sc—TCR p149及其肽配體已述于Theobald，M．J．等，PNAS(USA)(1995)，9211993。此肽序列為STPPPGTRV(SEQ ID NO．146)。腫瘤抑制蛋白p53的表達(dá)在惡性細(xì)胞中上調(diào)。已顯示50％的腫瘤在其表面表達(dá)的p53水平增高(Holliston，M．D．等，科學(xué)(1991)，25349)。因此，特異于該表位的sc—TCR分子可用毒素標(biāo)記，將該毒素送至表達(dá)p53肽片段HLA—2．1配體的惡性細(xì)胞。這種靶特異性免疫治療可只針對(duì)惡性細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷。體外測(cè)量細(xì)胞毒活性的方法已為人知，包括下述常規(guī)生活力試驗(yàn)。帶有與效應(yīng)物連接的p149 sc—TCR的sc—TCR分子具有其它重要用途。例如，該sc—TCR分子可用于選擇性殺傷表達(dá)p149肽的人類乳腺癌細(xì)胞?？蛇M(jìn)行體外研究，其中標(biāo)記有毒素的p149分子殺傷乳腺癌細(xì)胞的能力可利用非放射活性細(xì)胞毒性試驗(yàn)根據(jù)Eu3+釋放細(xì)胞毒性分析評(píng)估(Bouma，G．J．等，(1992)人類免疫學(xué)(Hum．Immunol．)3585)。帶有融合的效應(yīng)物分子的sc—TCR分子可輕易地進(jìn)行體內(nèi)檢驗(yàn)。例如，可通過(guò)將表達(dá)p149／HLA—A2．1的乳腺癌細(xì)胞移植到HLA／A2轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行體外研究(Theobald等，(1995)文獻(xiàn)同上)。可將毒素標(biāo)記的sc—TCR p149分子按預(yù)定劑量注射給小鼠，測(cè)量腫瘤大小的變化可指示sc—TCR分子的效力。此外，存活時(shí)間可作為評(píng)估新型抗腫瘤療法效力的第二標(biāo)準(zhǔn)。
已知還有其它適宜的效應(yīng)物或標(biāo)記分子。例如其中之一是在生理pH下荷電的多肽如6xHIS。此時(shí)，sc—TCR分子或可溶性sc—TCR融合蛋白可用能在約pH 6—9特異性結(jié)合6xHIS標(biāo)記的市售金屬—sepharose基質(zhì)如Ni—sepharose純化。EE表位和myc表位也是合適的蛋白標(biāo)記，這些表位可被一或多種市售單克隆抗體特異性結(jié)合。
本發(fā)明sc—TCR融合蛋白的分子量可根據(jù)很多因素變化，包括是否選擇了全長(zhǎng)Cκ或Cλ鏈或其合適片段，或是否應(yīng)用了一或多種蛋白標(biāo)記。通常，可溶性融合蛋白的分子量大于約45kDA，其中的V—α和V—β鏈分子量大于約20 kDA，更常常介于約21—26kDa之間。本發(fā)明之融合蛋白的分子量通常約50—75kDa。所有上述分子量均根據(jù)常規(guī)分子量大小測(cè)量試驗(yàn)如SDS—PAGE凝膠電泳測(cè)定。總見(jiàn)Sambrook等，文獻(xiàn)同上，Harlow&Lane，文獻(xiàn)同上；Ausubel等，文獻(xiàn)同上。
在一些方案中，將本發(fā)明之sc—TCR蛋白制備成多價(jià)將十分有利，如可增加sc—TCR的效價(jià)。簡(jiǎn)而言之，可將一至四個(gè)(相同或不同)蛋白用如標(biāo)準(zhǔn)生物素—抗生物素蛋白標(biāo)記技術(shù)共價(jià)連接在一起、或與適宜固相支持物如膠乳顆粒偶聯(lián)而制成多價(jià)sc—TCR蛋白。化學(xué)交聯(lián)的蛋白(如與dendrimer交聯(lián))也是適宜的多價(jià)蛋白。例如，該蛋白可通過(guò)包含編碼帶化學(xué)反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸殘基如Cys或His的序列而修飾。這類帶化學(xué)反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸可位于融合蛋白中的多個(gè)位置，優(yōu)選遠(yuǎn)離sc—TCR的抗原結(jié)合區(qū)。例如，可溶性融合蛋白C—β鏈C端可與包含這類反應(yīng)性氨基酸的蛋白純化標(biāo)記或其它融合蛋白共價(jià)連接。包含適宜側(cè)鏈可使兩個(gè)或更多融合蛋白化學(xué)連接到dendrimer顆粒上，形成多價(jià)分子。Dendrimer是表面可帶有多種不同官能團(tuán)中任何一種的合成性化學(xué)多聚體(D．Tomalia，A1drichimica Acta，2691101(1993))。可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行應(yīng)用的dendrimer實(shí)例如E9 starburst多胺dendrimer和E9comburst po1yamine dendrimer，它們可連接半胱氨酸殘基。
構(gòu)建編碼本發(fā)明之可溶性蛋白及其它生長(zhǎng)制劑，尤其是T細(xì)胞共同刺激因子如B—7基因家族之類(如B7—1或B7—2)的DNA載體，以便增強(qiáng)含有融合蛋白的細(xì)胞的活性可能也比較合乎需要。
本發(fā)明之可溶性蛋白可用于檢測(cè)和鑒定超抗原。例如，本發(fā)明之方法可用于對(duì)T細(xì)胞的未鑒定表位作圖，進(jìn)行如下編碼隨機(jī)肽文庫(kù)的序列或已選定肽的序列可提供在肽文庫(kù)中。然后用本發(fā)明的可溶性sc—TCR蛋白篩選此文庫(kù)，優(yōu)選用帶有可檢測(cè)標(biāo)記的融合蛋白(如標(biāo)有放射性原子或發(fā)光分子)。從融合分子中釋放出融合蛋白所特異性結(jié)合的肽并隨后擴(kuò)增。對(duì)肽進(jìn)行序列分析可鑒定融合蛋白所結(jié)合的序列。此外，可檢驗(yàn)已克隆的肽序列對(duì)表達(dá)相應(yīng)于融合蛋白V—α和V—β鏈之TCR的T細(xì)胞的結(jié)合。多種隨機(jī)肽文庫(kù)可任選其一應(yīng)用。參見(jiàn)如，J．Scott等，科學(xué)(1990)249386；J．Devlin等，科學(xué)(1990)249404；S．Cwirla等，PNAS(USA)，(1990)；876378；J．Hammer等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1992)1761007；Rhode，P．R．等，免疫學(xué)雜志(1996)1574885；及D．O’Sullivan等，免疫學(xué)雜志(1991)1472663。
有很高利用價(jià)值的單鏈Ⅰ類和Ⅱ類MHC／肽復(fù)合體(在其中常稱為scMHCⅠ類和Ⅱ類復(fù)合體)見(jiàn)已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及提交于1995年2月1日的未決美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454號(hào)。已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454號(hào)還公開(kāi)了極有價(jià)值的體外和體內(nèi)T細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)，它們可方便地適用于檢驗(yàn)在此公開(kāi)的sc—TCR蛋白。已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454的內(nèi)容均引入本文作為參考。
本發(fā)明之sc—TCR蛋白調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的能力(即降低或消除T細(xì)胞活性如增殖)可按上述已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)PCT／US95／09816和PCT／US97／01617以及上述未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454中的試驗(yàn)和進(jìn)行該試驗(yàn)的材料容易地進(jìn)行測(cè)定。
更特別地，如上述已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)PCT／US95／09816和PCT／US97／01617號(hào)，以及上述未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454所公開(kāi)，可進(jìn)行體外試驗(yàn)以測(cè)定分子是否能調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性。這類試驗(yàn)經(jīng)改造可測(cè)定sc—TCR蛋白的功能?？傊粋€(gè)試驗(yàn)實(shí)例可經(jīng)如下1—4步連續(xù)步驟完成。T細(xì)胞可適當(dāng)表達(dá)這樣一種標(biāo)記，該標(biāo)記可進(jìn)行分析、可指示T細(xì)胞的活化、或活化后對(duì)T細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用。因此，如上述專利申請(qǐng)所述，可應(yīng)用活化時(shí)表達(dá)白細(xì)胞介素—2(IL—2)的小鼠T細(xì)胞雜交瘤D011．10。測(cè)定IL—2的濃度可證實(shí)特定sc—TCR融合分子是否能調(diào)節(jié)T細(xì)胞雜交瘤的活性(如減少IL—2的產(chǎn)生量)。這類合適試驗(yàn)一般可按以下步驟執(zhí)行1.獲得包含對(duì)應(yīng)于本發(fā)明之sc—TCR蛋白的TCR的T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞。
2．然后在可增殖的條件下培養(yǎng)T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞。
3．隨后將增殖的T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞與一或多種sc—TCR融合蛋白接觸。
4．將T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞與能特異性結(jié)合該TCR并活化T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞的配體接觸。配體實(shí)例包括抗原如超抗原(帶有上述呈遞肽的sc—MHCⅠ類或Ⅱ類復(fù)合體)、或適當(dāng)?shù)腁PC。
5．將T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞與適當(dāng)?shù)墓餐碳ひ蜃咏佑|以提供活化必需的信號(hào)。隨后分析T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞的標(biāo)記如IL—2的產(chǎn)生。24小時(shí)后，IL—2產(chǎn)量減少如40％或更多，說(shuō)明sc—TCR融合蛋白結(jié)合了配體并因此調(diào)節(jié)了T細(xì)胞的活性。
如上已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及上述未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454所述，試驗(yàn)中所用T細(xì)胞常常在適合于增殖的條件下溫育。例如，將D011．10T細(xì)胞雜交瘤在約37℃、5％CO2，于完全培養(yǎng)基(添加了10％FBS、青霉素／鏈霉素、L—谷氨酰胺及5×10—5M2—巰基乙醇的RPMI 1640)上溫育?？梢詫舛韧ǔ?0—8—10—5M的系列稀釋的融合蛋白加入T細(xì)胞培養(yǎng)基中。T細(xì)胞活化信號(hào)優(yōu)選由已攜帶相應(yīng)抗原的抗原呈遞細(xì)胞提供。據(jù)信使用使T細(xì)胞活化略低于最高水平的抗原劑量和APC數(shù)目能更好地檢測(cè)融合蛋白對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的抑制作用。與sc—TCR融合蛋白接觸后IL—2產(chǎn)量的減少，說(shuō)明融合蛋白能調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性。
如已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及上述未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454所述，不測(cè)量表達(dá)蛋白如IL—2，而可通過(guò)用本領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)的放射性標(biāo)記技術(shù)測(cè)量抗原依賴性T細(xì)胞增殖的變化而測(cè)定對(duì)T細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)。例如，可在試驗(yàn)培養(yǎng)基中加入可檢測(cè)性標(biāo)記(如氚標(biāo)記)的核苷酸。DNA中摻入這樣的標(biāo)記核苷酸的量可作為T細(xì)胞增殖的度量。這項(xiàng)試驗(yàn)不適用于無(wú)需抗原呈遞便能生長(zhǎng)的T細(xì)胞，如T細(xì)胞雜交瘤。它適用于測(cè)量分離自哺乳動(dòng)物的未轉(zhuǎn)化T細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)。與融合蛋白接觸后T細(xì)胞增殖水平降低，說(shuō)明此分子可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性并抑制免疫應(yīng)答。優(yōu)選使用體外T細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)量融合蛋白對(duì)體內(nèi)T細(xì)胞集落擴(kuò)展中抗原特異性改變的影響。IL—2產(chǎn)生或T細(xì)胞增殖的測(cè)量可用于測(cè)定sc—TCR融合蛋白是否能改變T細(xì)胞的活化。例如，與融合蛋白接觸后APC刺激的T細(xì)胞的IL—2產(chǎn)量的減少說(shuō)明融合分子可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性并抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
一般而言，適用于這些試驗(yàn)的T細(xì)胞均由轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞系如T細(xì)胞雜交瘤或分離自哺乳動(dòng)物(如人類等靈長(zhǎng)類或小鼠、大鼠、家兔等嚙齒類)的T細(xì)胞提供。其它適用的T細(xì)胞包括1)可公開(kāi)獲得的或可通過(guò)已知方法制備的T細(xì)胞雜交瘤，2)T輔助細(xì)胞和3)T細(xì)胞毒細(xì)胞，優(yōu)選細(xì)胞毒性CD8+細(xì)胞。T細(xì)胞可用已知方法從哺乳動(dòng)物中分離。參見(jiàn)如，R．Shimonkevitz等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，(1983)158303。
體內(nèi)試驗(yàn)也可能適用于測(cè)定可溶性融合蛋白調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的能力，包括抑制或鈍化T細(xì)胞發(fā)育的能力。例如，可分析sc—TCR融合蛋白抑制免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換(即IgM轉(zhuǎn)換成IgG)的能力。參見(jiàn)如P．Linsley等，科學(xué)，(1992)257792—795。
用到可溶性sc—TCR蛋白的診斷方法還包括體內(nèi)診斷性成像和HLA分型(參見(jiàn)如A．K．Abbas，細(xì)胞和分子免疫學(xué)，第328頁(yè)，W．B．Saunders Co．1991)。用于體內(nèi)成像的融合蛋白帶有放射性標(biāo)記(如125I、32P、99Tc)或可施用于哺乳動(dòng)物、且試驗(yàn)對(duì)象可用已知過(guò)程掃描對(duì)sc—TCR的結(jié)合的其它可檢測(cè)標(biāo)記。對(duì)哺乳動(dòng)物的這種分析可輔助對(duì)多種疾病包括如伴有APC之不利表達(dá)的免疫系統(tǒng)失調(diào)的診斷和治療。
這些試驗(yàn)還可用于評(píng)估sc—TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc—TCR)在自身免疫病治療中的應(yīng)用。例如，如已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及上述未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454所述，實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)是小鼠自身免疫病，并是公認(rèn)的多發(fā)性硬化癥模型。在一項(xiàng)試驗(yàn)實(shí)例中，小鼠經(jīng)處理患上EAE，然后施用適當(dāng)?shù)膕c—TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc—TCR)。接著評(píng)估動(dòng)物以確定EAE的進(jìn)展在施用融合蛋白或sc—TCR后是否受到抑制或阻止。
本發(fā)明sc—TCR蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(包括針對(duì)前述特定疾病進(jìn)行免疫接種)的能力可輕易通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定。例如，可以將該sc—TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc—TCR)施用于小鼠等哺乳動(dòng)物，在開(kāi)始用藥及隨后的一定時(shí)間間隔(如施用sc—TCR的2、5和8周后)時(shí)多次取血樣。從血樣中收集血清，分析是否因免疫接種產(chǎn)生了抗體?？贵w濃度可按標(biāo)準(zhǔn)的免疫技術(shù)測(cè)定。
本發(fā)明還提供經(jīng)施用編碼sc—TCR蛋白的DNA序列而在哺乳動(dòng)物，特別是人類等靈長(zhǎng)類的細(xì)胞中表達(dá)該蛋白的方法。優(yōu)選地，可根據(jù)已知方法將攜帶融合蛋白編碼區(qū)、受到合適啟動(dòng)子如CMV啟動(dòng)子的適當(dāng)控制的DNA直接注射于試驗(yàn)對(duì)象的骨骼肌。有關(guān)施用質(zhì)粒DNA、受施對(duì)象的細(xì)胞對(duì)該DNA的吸收以及蛋白的表達(dá)方法已有報(bào)道(參見(jiàn)J．Ulmer等，科學(xué)，(1993)2591745—1749)。對(duì)于可溶性融合蛋白，優(yōu)選所編碼的Ig—CL鏈或其片段與所用宿主為免疫相容。
本發(fā)明之sc—TCR蛋白具有多種治療用途。例如，可以施用該sc—TCR蛋白以減少或消除哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答，如治療患有或疑有癌癥、傳染病、過(guò)敏或自身免疫病(如多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等等)的人類等哺乳動(dòng)物。可經(jīng)任何一種適宜的用藥方式給藥，諸如直接施用編碼該融合蛋白的DNA。那些遭受或?qū)⒁馐懿槐匾拿庖邞?yīng)答所帶來(lái)痛苦的人，如接受諸如心臟、腎臟、皮膚或其它器官移植手術(shù)的病人也適合這類治療。在有關(guān)移植物排斥反應(yīng)的情形下，治療最好開(kāi)始于手術(shù)前。
根據(jù)本發(fā)明，有多種方法可用于減少或消除哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。其中，一種減少不必要免疫應(yīng)答的治療方法是施用有效量的目的sc—TCR融合體以減少或消除致病性T細(xì)胞與超抗原或肽—MHC復(fù)合體之間的相互作用。從而可選擇性控制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答如T細(xì)胞的增殖、分化、活化或B淋巴細(xì)胞的激活。優(yōu)選地，該融合蛋白具有與介導(dǎo)不必要免疫應(yīng)答的致病性T細(xì)胞至少相同或優(yōu)選更強(qiáng)的對(duì)抗原的特異性結(jié)合親和力。此時(shí)尤其優(yōu)選上述已證實(shí)對(duì)配體的特異性結(jié)合親和力增強(qiáng)的sc—TCR融合蛋白突變型蛋白。融合的Ig—CL鏈或片段可用于通過(guò)常規(guī)免疫試驗(yàn)鑒定結(jié)合至靶細(xì)胞的融合蛋白。
sc—TCR蛋白、衍生自合適sc—TCR融合蛋白的sc—TCR、或根據(jù)在此公開(kāi)的方法制備的抗體可通過(guò)注射如腹膜內(nèi)注射或靜脈注射施用于哺乳動(dòng)物。融合蛋白，至少是用于治療的那些分子，優(yōu)選產(chǎn)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其它適宜細(xì)胞，并在使用前純化，以使之基本上或完全不含熱原質(zhì)。治療的最佳用量可通過(guò)常規(guī)方法確定，一般根據(jù)多種因素包括用藥途徑、病人體重、總的身體狀況、性別及本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員認(rèn)定的其它這類因素而變化。
用藥可以是單劑或或間隔數(shù)天或數(shù)周的多劑。術(shù)語(yǔ)“單劑”在此可以是一次釋放的單劑，也可以是緩釋劑。試驗(yàn)對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物(如人類或牛等牲畜以及狗和貓等寵物)，包括以包含sc—TCR、sc—TCR融合蛋白或抗體的藥用組合物進(jìn)行的治療。本發(fā)明的這類藥用組合物均按本領(lǐng)域內(nèi)已知過(guò)程制備和應(yīng)用。例如，包含藥用有效量融合蛋白的制劑可以單劑或多劑容器如封閉的安瓿和小瓶的形式提供，也可凍干貯存(此時(shí)只要求在使用前加入無(wú)菌液態(tài)載體如注射用水)。對(duì)于多種用途還優(yōu)選用脂質(zhì)體制劑。胃腸道外施用的其它組合物也適于此，包括含水和不含水的無(wú)菌注射液(其中可能含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑以及使制劑與受者血液等滲的溶質(zhì))；含水和不含水的無(wú)菌懸浮液(其中可能有懸浮劑和增稠劑)。
包括減少或消除T細(xì)胞應(yīng)答的本發(fā)明方法也可與已知免疫抑制劑、抗病毒試劑、抗癌劑或抗炎劑聯(lián)合應(yīng)用，以更有效地治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。例如，該融合蛋白可與常規(guī)免疫抑制藥物如環(huán)孢菌素或抗炎劑如皮質(zhì)類固醇和非類固醇類藥物聯(lián)合用于治療自身免疫病和過(guò)敏。
如上述，sc—TCR蛋白(或衍生自目的sc—TCR融合蛋白的sc—TCR分子)可用于按本領(lǐng)域內(nèi)已知技術(shù)產(chǎn)生抗體，并常常制成該融合蛋白的純化樣品。選用于產(chǎn)生抗體的sc—TCR融合蛋白可如上述從Ig—CL鏈或片段裂解下來(lái)，以減少針對(duì)該免疫球蛋白鏈的免疫反應(yīng)。如此獲得的sc—TCR可作為免疫原使用?？贵w也可由包含目的sc—TCR的一或多個(gè)表位的免疫原性肽生成。
更特別地，抗體的制備可通過(guò)單獨(dú)用sc—TCR蛋白的純化樣品、如上述分離自目的sc—TCR融合蛋白或免疫原性肽的sc—TCR分子，或聯(lián)合使用合適載體，對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫接種而完成。優(yōu)選地，用該sc—TCR分子作為免疫原。適合的哺乳動(dòng)物包括典型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如綿羊、山羊、家兔、豚鼠、豬、大鼠和小鼠。優(yōu)選用大鼠和小鼠，尤其是小鼠獲得單克隆抗體?？乖┯糜诓溉閯?dòng)物的合適途徑可任選如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射。最佳免疫間隔、免疫劑量等可在相對(duì)較大范圍內(nèi)變動(dòng)，并可根據(jù)此公開(kāi)內(nèi)容憑經(jīng)驗(yàn)確定。典型的過(guò)程包括經(jīng)數(shù)周多次注射抗原。用常規(guī)技術(shù)從免疫動(dòng)物血清中收集抗體并篩選出特異于sc—TCR的抗體。尤其感興趣的是特異性結(jié)合V—α或V—β鏈的抗體，特別是其中的高變區(qū)，包括識(shí)別其上的線性或構(gòu)象表位的抗體。單克隆抗體的產(chǎn)生可在能生產(chǎn)抗體的細(xì)胞、及采用形成雜交瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)融合技術(shù)用于生成單克隆抗體的那些細(xì)胞中完成。參見(jiàn)G．Kohler等(1975)，自然，256456。通常，這包括使抗體生產(chǎn)細(xì)胞與永生化細(xì)胞系如骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交細(xì)胞?；蛘?，單克隆抗體可用Huse等(1989)，科學(xué)，2561275的方法自細(xì)胞中產(chǎn)生。
一個(gè)合適的方案是在約2—7個(gè)月內(nèi)對(duì)小鼠腹膜內(nèi)免疫接種包含純化sc—TCR復(fù)合體的組合物。然后可以取出免疫小鼠的脾細(xì)胞。取脾細(xì)胞之前分析免疫小鼠血清中對(duì)sc—TCR具有特異性的抗體的效價(jià)。然后將取出的小鼠脾細(xì)胞與帶有諸如次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷(HGPRT—)或胸苷激酶缺陷(TK—)之類標(biāo)記的適當(dāng)同基因或異基因(優(yōu)選異基因)淋巴樣細(xì)胞系融合。優(yōu)選用骨髓瘤細(xì)胞作為淋巴樣細(xì)胞系。以如約1比4的比例將骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞混合。細(xì)胞可采用聚乙二醇(PEG)法融合。參見(jiàn)G．Kohler等，自然，文獻(xiàn)同上。將如此克隆到的雜交瘤培養(yǎng)于培養(yǎng)基如RPMI—1640上。參見(jiàn)G．E．More等(1967)，美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志，199549。通過(guò)如放射免疫分析或酶免疫分析法篩選融合操作后培養(yǎng)的雜交瘤分泌能與純化的sc—TCR特異性結(jié)合的抗體的情況?？捎肊LISA按標(biāo)準(zhǔn)方法篩選含抗體的血清。在這類篩選中顯示陽(yáng)性結(jié)果的雜交瘤可擴(kuò)增并用有限稀釋法克隆。最好再進(jìn)行篩選，選出能結(jié)合溶液中以及生物樣品中的sc—TCR的抗體。所分離的抗體可用任何適當(dāng)?shù)拿庖呒夹g(shù)包括親和層析進(jìn)一步純化。
在有些應(yīng)用中，可能需要生成能特異性結(jié)合sc—TCR的嵌合抗體衍生物，如組合了非人類動(dòng)物可變區(qū)和人類恒定區(qū)的抗體分子，因而使抗體在人類試驗(yàn)者體內(nèi)比相應(yīng)的非嵌合抗體免疫原性更小?？芍苽涓鞣N類型的這類嵌合抗體，包括通過(guò)如產(chǎn)生人類可變區(qū)嵌合體，其中可變區(qū)部分、尤其是抗原結(jié)合區(qū)的保守區(qū)為人類來(lái)源，而只有高變區(qū)為非人類來(lái)源。有關(guān)人源化嵌合抗體及其產(chǎn)生方法的討論參見(jiàn)S．L．Morrison，(1985)科學(xué)，2291202；Oi等(1986)，生物技術(shù)，4214；Teng等(1983)，PNAS，U．S．A．，807308；Kozbor等(1983)，今日免疫學(xué)，47279；Olsson等(1982)，酶學(xué)方法，93。
如上述，sc—TCR蛋白可按標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)輕易地修飾以提高對(duì)目的配體的特異性結(jié)合。例如，目的sc—TCR可通過(guò)分離有肽連接序列如上述連接的合適V—α和V—β鏈的編碼DNA區(qū)段而制備。必要時(shí)DNA可與Ig—CL連接，然后在目的V—α或V—β鏈內(nèi)進(jìn)行誘變?nèi)缍c(diǎn)誘變。誘變方法的實(shí)例有丙氨酸掃描誘變(參見(jiàn)如Nisbet，I．T．等，(1985)基因分析技術(shù)2，23；Hines，J．C．，基因(1980)11，207；亦參見(jiàn)Sambrook等，文獻(xiàn)同上)。若要調(diào)節(jié)sc—TCR融合蛋白的特異性結(jié)合親和力，所選突變常為可影響sc—TCR互補(bǔ)決定區(qū)(即CDR，有時(shí)稱為高變區(qū))的結(jié)合親和力的那些氨基酸替換。更特別地，這種氨基酸替換可以是保守或非保守替換，在本文中指sc—TCR中一個(gè)氨基酸被另一個(gè)氨基酸替換。在一些實(shí)例中，替換包括一個(gè)氨基酸被具有基本相似的化學(xué)特點(diǎn)的另一個(gè)氨基酸替換(保守的)。在另一些實(shí)例中，替換包括一個(gè)氨基酸被具有基本不同化學(xué)特點(diǎn)的另一個(gè)氨基酸替換(非保守的)。因此，sc—TCR中酪氨酸殘基被苯丙氨酸殘基替換代表的是保守型氨基酸替換，而丙氨酸殘基被脯氨酸殘基替換代表的是非保守替換。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將能理解，誘變還可包括改變分隔sc—TCR之V—α和V—β鏈的肽連接序列的長(zhǎng)度或氨基酸組成。此外，可誘變Ig—CL鏈或片段以按需要改變其長(zhǎng)度或氨基酸組成。但在大多數(shù)實(shí)例中，誘變針對(duì)的是V—α或V—β鏈，在融合蛋白的V—α或V—β鏈中平均產(chǎn)生一個(gè)氨基酸替換的突變。誘變程度可通過(guò)對(duì)誘變后V—α或V—β鏈的DNA測(cè)序而方便地進(jìn)行分析。
優(yōu)選地，V—α或V—β鏈的誘變將使sc—TCR融合蛋白對(duì)配體的特異性結(jié)合水平比天然TCR增加至少約2倍。
盡管是不太優(yōu)選的方法，仍可用已知的化學(xué)誘變技術(shù)按所需對(duì)sc—TCR融合蛋白進(jìn)行修飾。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)能抑制配體和T細(xì)胞受體間特異性結(jié)合的分子的方法。該方法包括在有能特異性結(jié)合T細(xì)胞受體的配體存在時(shí)溫育單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白，在有該配體和目的分子存在時(shí)溫育該單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白；評(píng)價(jià)在有和無(wú)該分子時(shí)，該配體和該單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白之間的相互作用，其中有該分子時(shí)融合蛋白與配體間的相互作用比無(wú)該分子時(shí)弱說(shuō)明該分子能抑制該配體和該T細(xì)胞受體之間的特異性結(jié)合。必要時(shí)此方法可用sc—TCR分子取代sc—TCR融合蛋白。
本文中術(shù)語(yǔ)抗體一般指完整的免疫球蛋白，也指能與該可溶性融合蛋白的sc—TCR分子結(jié)合的免疫活性片段。免疫球蛋白及其免疫活性片段包含抗體結(jié)合位點(diǎn)(即能特異性結(jié)合融合蛋白的peritope)?？贵w片段的實(shí)例有，如Fab、F(v)、Fab’、F(ab’)2片段、還原免疫球蛋白的二硫鍵得到的“半分子”、單鏈免疫球蛋白或其它合適抗原結(jié)合片段(參見(jiàn)如Bird等(1988)，科學(xué)，242；Huston等(1988)，PNAS(USA)，855879；Webber等(1995)，分子免疫學(xué)，32249)?？贵w或其免疫活性片段可以是動(dòng)物的(如小鼠或大鼠等嚙齒類)、或嵌合形式(參見(jiàn)Morrison等(1984)，PNAS，816851；Jones等(1986)，自然，321)。
術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或類似術(shù)語(yǔ)指在此公開(kāi)的、能結(jié)合另一分子而形成特異性結(jié)合對(duì)的分子。但此分子不識(shí)別或結(jié)合其它分子，正如蛋白印跡ELISA、RIA、移動(dòng)抑制試驗(yàn)、酶免疫分析、競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)、飽和試驗(yàn)或領(lǐng)域內(nèi)已知的其它蛋白結(jié)合試驗(yàn)所測(cè)定?？倕⒁?jiàn)Ausubel等，文獻(xiàn)同上；Sambrook等，文獻(xiàn)同上；Harlow和Lane，文獻(xiàn)同上以及其中引用的有關(guān)檢測(cè)分子間特異性結(jié)合之方法實(shí)例的參考文獻(xiàn)。
相當(dāng)純的可溶性融合蛋白或核酸均至少約90—95％純，優(yōu)選至少98—99％純或更純，以便藥用。一旦部分純化或達(dá)到實(shí)質(zhì)性純度，該可溶性融合蛋白就可用于治療(包括離體地)，或如本文所述在開(kāi)發(fā)或執(zhí)行體外或體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)應(yīng)用。
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以下非限制性實(shí)施例用以舉例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1—可溶性sc—TCR融合蛋白的構(gòu)建小鼠DO11．10細(xì)胞TCR的DNA序列已有報(bào)道(Kappler，J．等PNAS(1994)91 8462)。該TCR識(shí)別并結(jié)合I—AdMHCⅡ類分子中跨越第323—329位氨基酸的小雞卵白蛋白肽(即OVA)。編碼TCR的DNA一般按Kappler&Marrack，文獻(xiàn)同上所述方法進(jìn)行制備。
可簡(jiǎn)述為，用oligo—dT包被的磁珠按廠家(Dynal)建議從1×106個(gè)DO11．10細(xì)胞中分離mRNA。將含C—α特異性“反向(back)”引物KC113(SEQ ID NO．6)與D011．10 mRNA的混合物溫育制成TCRα鏈的cDNA。再向混合物中加入常規(guī)量的核苷酸和逆轉(zhuǎn)錄酶以形成cDNA。用相似的方法，但用“反向”引物KC111(SEQ ID NO．4)替換KC113引物制備β鏈cDNA。以α鏈cDNA為模板，用引物KC112(SEQ ID NO．5)和KC113進(jìn)行PCR以擴(kuò)增一段650 bp的5’XhoⅠ—3’XmaⅠα鏈片段。一段750bp的鏈片段用引物KC111和KC110(SEQ ID NO．3)經(jīng)PCR擴(kuò)增而得，其5’和3’端分別有SfiⅠ和SpeⅠ位點(diǎn)。
由D011．10TCR構(gòu)建sc—TCR，其中有共價(jià)連接的V—α和V—β鏈。有時(shí)，V—α鏈還包含C—α鏈片段和C—β鏈片段(見(jiàn)圖5)。一般Cα鏈片段長(zhǎng)約9個(gè)氨基酸，但在以下實(shí)施例4中公開(kāi)了更大的C—α鏈。C—β鏈通常在緊鄰全長(zhǎng)C—β鏈中的第127位半胱氨酸殘基之前的第126位氨基酸處被截短。我們發(fā)現(xiàn)，帶有該半胱氨酸殘基對(duì)sc—TCR表達(dá)極其不利。
實(shí)施例2—用于在大腸桿菌中表達(dá)sc—TCR融合蛋白的載體包含與噬菌體衣殼蛋白(基因Ⅲ或基因Ⅷ)融合的sc—TCR分子的編碼DNA區(qū)段的DNA載體的構(gòu)建已述于上述未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)?？珊?jiǎn)述為，為構(gòu)建這些編碼可溶性融合蛋白的DNA載體，對(duì)選自上述未決的美國(guó)專利申請(qǐng)的DNA載體進(jìn)行修飾。參見(jiàn)實(shí)施例4—7。
A．DNA載體pJRS149DNA載體pJRS149是具有pBluScriptTM(Invitrogen)骨架的噬菌粒。
B．DNA載體pKC12如圖1所示，將編碼噬菌體基因Ⅲ的DNA克隆至pKC12載體。
C．DNA載體pKC14和pKC15
以fd tet噬菌體(ATCC錄入號(hào)37000)為模板，用OPR156(“正向”，SEQ ID NO．58)和OPR157(“反向”，SEQ ID NO．59)引物PCR擴(kuò)增噬菌體基因Ⅷ的DNA序列。再將基因Ⅷ的PCR產(chǎn)物以XmaⅠ—EcoRⅠ片段形式克隆至載體pLL001中，產(chǎn)生載體pKC14。pLL001質(zhì)粒衍生自PUC—19DNA，其中在多接頭區(qū)含有XmaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)。此位點(diǎn)便于亞克隆基因Ⅷ片段。此外，pLL001載體可作為穿梭載體用于克隆基因ⅧDNA。將一段96bpNcoⅠ—EcoRⅠ片段如圖1所示克隆至pJRS149載體中，便可由pKC14衍生載體pKC15。NcoⅠ—EcoRⅠ片段包含有多克隆位點(diǎn)(如SfiⅠ，NcoⅠ，SpeⅠ，XhoⅠ和XmaⅠ)的合成性多接頭、pe1B前導(dǎo)序列、phoA啟動(dòng)子和基因Ⅷ基因。載體pKC15帶有源自pJRS149骨架的另一個(gè)pe1B前導(dǎo)序列，能使基因克隆處于雙順?lè)醋硬倏v子控制之下。
D．DNA載體pKC16和pKC18以α鏈cDNA為模板，使用引物KC113(SEQ ID NO．6)(“正向”)和KC112(SEQ ID NO．5)(“反向”)擴(kuò)增TCRV—α、C—α基因，可從pKC16克隆XhoⅠ—XmaⅠ片段。以β鏈cDNA為模板、以KC11O(SEQ ID NO．3)(“正向”)和KC111(SEQ ID NO．4)(“反向”)為引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到V—β、C—β基因片段，并克隆至pKC15中，形成pKC18。
E．DNA載體pKC27、pKC42和pKC44經(jīng)退火引物JA301(SEQ ID NO．95)和JA302(SEQ ID NO．96)制備(G4S)4多接頭，構(gòu)建載體pKC27。再將接頭以SpeⅠ—XhoⅠ片段的形式克隆至pKC15載體。然后分別將V—α13．1和V—β、C—β區(qū)克隆至pKC27 DNA。簡(jiǎn)短說(shuō)，V—α13．1基因片段經(jīng)利用引物KC114(SEQ ID NO．7)(“正向”)和KC126(“反向”)(SEQ ID NO．19)、以載體pKC16 DNA為模板的PCR擴(kuò)增而得。將V—α13．1基因作為SfiⅠ—SpeⅠ片段克隆至pKC42。pKC18用XhoⅠ和XmaⅠ消化后凝膠純化V—β 8．2和C—β鏈DNA。將此片段克隆至pKC42，制成pKC44載體?？傊?，pKC44載體包括sc—TCR，此sc—TCR是在phoA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下的sc—TCR／基因Ⅷ融合蛋白。
F．pKC12、pKC45、pKC46和pKC51 DNA載體從pKC12構(gòu)建載體pKC45、pKC46和pKC51的過(guò)程見(jiàn)圖3，并如下述。
修飾pKC12載體以使編碼實(shí)施例1之sc—TCR的DNA在lacZ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)。簡(jiǎn)短說(shuō)，將已退火的引物KC134(SEQ ID NO．27)(“正向”)和KC135(SEQ ID NO．28)(“反向”)克隆至pKC12，使pKC12得到修飾，而產(chǎn)生載體pKC45。這樣的修飾在已帶有SfiⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)的pKC12多接頭區(qū)加入了XmaⅠ位點(diǎn)。此外，pKC45在EE—標(biāo)記的5’端連接了編碼基因Ⅲ的DNA序列，還含有琥珀終止密碼子。
琥珀終止密碼子使sc—TCR融合蛋白在諸如XL1—blue的lacIq琥珀抑制子宿主內(nèi)的表達(dá)減少至約15—20％。為了將編碼sc—TCR／基因Ⅲ融合蛋白的DNA克隆至pKC45，用SfiⅠ和XmaⅠ切割pKC44 DNA。然后對(duì)sc—TCR片段進(jìn)行凝膠純化，克隆至pKC45，產(chǎn)生pKC46。sc—TCR在pKC46中的插入如圖3示，它與EE標(biāo)記和基因Ⅲ衣殼蛋白融合。
用XmaⅠ和EcoRⅠ消化pKC44和pKC46載體，使sc—TCR／基因Ⅷ融合蛋白受控于lacZ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制?；颌鳧NA序列自消化后的pKC44DNA分離，作為SfiⅠ—EcoRⅠ片段克隆至凝膠純化的載體pKC46 DNA中，產(chǎn)生pKC51。將pKC51中的sc—TCR插入片段與基因Ⅷ衣殼蛋白融合。與載體pKC46不同的是，pKC51載體不包含EE標(biāo)記或琥珀終止密碼子。
實(shí)施例3—將編碼融合蛋白的DNA克隆至DNA載體pEN2實(shí)施例1產(chǎn)生的可溶性sc—TCR的表達(dá)可通過(guò)如圖4示亞克隆至pEN2載體而增加。pEN2載體包括phoA啟動(dòng)子、基因10核糖體結(jié)合點(diǎn)及已修飾的pelB前導(dǎo)序列。在pEN2骨架中插入sc—TCR的pKC60和pKC67如圖5示及下述。
A．構(gòu)建DNA載體pKC60pKC60載體通過(guò)將一段1204 bp的SfiⅠ—EcoRⅠ片段導(dǎo)入pEN2而得。SfiⅠ—EcoRⅠ片段由V—α、V—β和C—β區(qū)組成。該片段是通過(guò)以pKC51的DNA為模板、用引物KC114(“正向”SEQ ID NO．7)和JWTCR208(“反向”SEQ ID NO．75)擴(kuò)增而得。JWTCR209引物在C—β區(qū)3’端包含EE標(biāo)記和XmaⅠ位點(diǎn)。XmaⅠ位點(diǎn)的加入有利于基因Ⅲ和基因Ⅷ的基因克隆。pKC60載體通過(guò)將上述sc—TCR XmaⅠ—EcoRⅠ片段克隆至pEN2載體而得。
B．構(gòu)建DNA載體pKC61為產(chǎn)生截短的sc—TCR，用引物KC115(“正向”SEQ ID NO．8)和JWTCR209(“反向”SEQ ID NO．74)經(jīng)PCR擴(kuò)增pKC46的V—α、V—β序列。將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆至載體pKC60，產(chǎn)生載體pKC61。pKC61再在其EE標(biāo)記序列的3’端加入6Xhis標(biāo)記而修飾。
C．構(gòu)建pKC62和pKC64 DNA載體編碼噬菌體基因Ⅲ的DNA以TCR215(SEQ ID NO 6F)和218(SEQ IDNO 64)為引物、pKC46載體DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后克隆至pKC60以產(chǎn)生載體pKC64?；颌幕蛞訲CR212(SEQ ID NO 71)和213(SEQ IDNO 70)為引物、pKC51載體DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，再克隆至pKC60以產(chǎn)生載體pKC62。
D．DNA載體pKC63和pKC65的構(gòu)建基因Ⅲ(pKC65)和基因Ⅷ(pKC63)融合蛋白的相應(yīng)目的基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆至pKC61載體骨架中。pKC65和pKC63因此都含有引物序列中編碼的6xHis尾。
E．DNA載體pKC66和pKC67的構(gòu)建以pKC51的DNA為模板、用引物KC114(正向SEQ ID NO7)和JWTCR217(反向SEQ ID NO66)擴(kuò)增包含V—α以及C—α鏈片段前8個(gè)氨基酸的SfiⅠ—SpeⅠ片段，制備pKC66和pKC67載體。為產(chǎn)生pKC66和pKC67載體，用KC114和JWTCR217引物擴(kuò)增TCR DNA，然后將擴(kuò)增的DNA亞克隆至已用SfiⅠ和SpeⅠ消化了的pKC62或pKC60中。這些載體各包含C—α區(qū)N端的8個(gè)氨基酸殘基。將載體用于構(gòu)建下述TCR文庫(kù)。載體pKC66包含基因Ⅷ的基因。
正如未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)所述，DNA載體pKC46(pSUN18)和pKC62(pSUN19)已依照布達(dá)佩斯條約保藏于12301 Parklawn大街，Rockville，MD的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。這些DNA載體是于1997年2月26日保藏在ATCC的，錄入號(hào)為97895(pSUN18)和97896(pSUN19)。DNA載體pKC62(pSUN19)有phoA啟動(dòng)子、修飾的pelB序列、基因10核糖體結(jié)合點(diǎn)及噬菌體基因Ⅷ啟動(dòng)子。DNA載體pKC46(pSUN18)有1acZ啟動(dòng)子、EE標(biāo)記及噬菌體基因Ⅲ蛋白。這些DNA載體可在大腸桿菌或其它合適的宿主中按常規(guī)方法培養(yǎng)。
DNA載體pKC46(pSUN18)和pKC62(pSUN19)均設(shè)計(jì)為能容納多種Vα、Vβ—Cβ及多肽連接序列。兩種DNA載體的Vα鏈可用SfiⅠ和SpeⅠ經(jīng)限制性消化切出。Vβ—Cβ鏈可經(jīng)XhoⅠ—XmaⅠ限制性消化切出。此外，這些DNA載體使得能夠經(jīng)SpeⅠ和XhoⅠ限制性消化而替換肽連接序列。
實(shí)施例4—載體pKC24、pKC73、pKC74、pKC75的構(gòu)建如下述構(gòu)建DNA載體以作為與小鼠IgGκ鏈的融合蛋白形式表達(dá)實(shí)施例1中的D011．11 sc—TCR。
為制備帶有編碼與小鼠IgGκ鏈融合之DO11．11 sc—TCR的DNA區(qū)段的DNA載體，用引物KC114(SEQ ID NO7)和KC117(SEQ ID NO 10)經(jīng)PCR再次擴(kuò)增pKC16的VαCα鏈，產(chǎn)生5’SfiⅠ—3’SpeⅠ片段。將此DNA克隆至pKC15并測(cè)序。將正確片段限制性消化，連接至已被SfiⅠ—SpeⅠ消化的pKC15 DNA中，產(chǎn)生pKC24載體。pKC15和pKC16構(gòu)建體的衍化已在上述實(shí)施例2C和2D中有述。
然后以pKC24 DNA為模板、用引物KC114(SEQ ID NO7)和KC165(SEQ ID NO 131)、KC114和KC166(SEQ ID NO 132)以及KC114和KC167(SEQ ID NO 133)經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生附加了不同長(zhǎng)度C—α鏈的V—α鏈。將這些PCR產(chǎn)物克隆至pGEM—T Easy載體系統(tǒng)(Promega)以便測(cè)定DNA序列。將正確片段經(jīng)限制性消化并克隆至表達(dá)載體pKC60。在所有三個(gè)片段中，C—α鏈片段均結(jié)束于半胱氨酸殘基。這一“終末”半胱氨酸殘基被變?yōu)榻z氨酸殘基，但內(nèi)部的所有半胱氨酸殘基均未突變。最后的構(gòu)建體pKC73帶有C—α鏈的22個(gè)氨基酸，pKC74有72個(gè)氨基酸，pKC75有90個(gè)氨基酸(即完整C—α鏈)。pKC73、pKC74和pKC75 DNA載體插入物圖示于圖9A。
V—βC—β鏈用引物JWTCR222(SEQ ID NO．60)和JWTCR208(SEQ IDN0．75)PCR擴(kuò)增為5’SfiⅠ—3’XmaⅠ片段。測(cè)序后，克隆至表達(dá)載體作為只有β鏈的陰性對(duì)照。
實(shí)施例5—可溶性DO11．10 sc—TCR融合蛋白的構(gòu)建在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中和表達(dá)能夠大量生產(chǎn)的可溶性sc—TCR將是非常合乎需要的。為提高可溶性蛋白表達(dá)的水平，將sc—TCR構(gòu)建體克隆至哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
按上述實(shí)施例3A，E制備的大腸桿菌DNA構(gòu)建體pKC60和pKC67用引物KC169(SEQ ID NO．143)和KC170(SEQ ID N0．144)再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生5’AgeⅠ—3’BstBⅠ sc—TCR—IgGκ鏈(Cκ)融合基因。TCR—IgCκ表達(dá)載體的構(gòu)建如下載體骨架為質(zhì)粒pCDNA3(Invitrogen)。用HindⅢ／XhoⅠ切割該質(zhì)粒，并插入“輕鏈多接頭”DNA區(qū)段以產(chǎn)生開(kāi)始的“輕鏈載體”。此接頭包含限制性位點(diǎn)Hindm、KpnⅠ、ClaⅠ、PmlⅠ、EcoRV、AgeⅠ、XmaⅠ、BamHⅠ和XhoⅠ以便于隨后經(jīng)克隆產(chǎn)生質(zhì)粒pCDNA．LCPL。將帶有輕鏈前導(dǎo)序列、抗CKMBκ輕鏈基因組片段和3’UTR的SmaⅠ／BclⅠDNA區(qū)段克隆至pCDNA3．LCPL的EcoRV／BamHⅠ位點(diǎn)。此片段中的小鼠κ內(nèi)含子、外顯子和3’UTR衍生自Richard Near博士提供的pNeo／26—IOVL(Near，R等，(1990)，分子免疫學(xué)2791—909)。然后進(jìn)行誘變以消除NruⅠ(209bp)、MluⅠ(229bp)和BstBⅠ(2962bp)，并導(dǎo)入NheⅠ(1229bp)和BamHⅠ(1214bp)位點(diǎn)，產(chǎn)生pCDNA3mut．LCPL．LCVK。
載體再經(jīng)進(jìn)一步修飾以除去可變的輕鏈CKMB Vκ。具體做法是，用EcoRV／XhoⅠ消化質(zhì)粒pCDNA3mut．LCPL．LCVK，插入帶有EcoRV、AgeⅠ、BstBⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)的接頭寡核苷酸片段，產(chǎn)生pSUN9。
D011．10 sc—TCR用引物對(duì)KC169正向(5’gAg gTg ACC ggT gAg CagTAC g TTT gTC TgC Tcg gCC CCA g—3’)和KC170反向(5’gTg gAg TTCgAA Aag TgT ACT TAC g TTT gTC TgC Tcg gCC CCA g—3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，作為AgeⅠ／BstBⅠ片段克隆至pSUN6載體，以構(gòu)建pSUN27載體(pKC60—M)并表達(dá)該載體得到sc—TCR—κ恒定區(qū)融合蛋白。
pSun27模板DNA也可用引物KC169(SEQ ID NO．143)和KC201(SEQID NO．145)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生不含IgGκ鏈融合體的5’AgeⅠ—3’BstBⅠsc—TCR。pKC73、pKC74和pKC75 DNA也可用引物對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生sc—TCR和sc—TCR—IgG Cκ融合片段，以連接至適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體中。
例如，將D011．10 sc—TCR—IgG Cκ融合片段克隆至pGEM—T Easy載體系統(tǒng)(Promega)以便DNA測(cè)序。將正確片段限制性消化并克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。所得哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含CMV啟動(dòng)子、新霉素抗性基因、小鼠IgGκ前導(dǎo)序列、小鼠κ內(nèi)含子和小鼠κ恒定區(qū)外顯子序列。所得載體命名為pKC60－M(pSUN27)和pKC67—M。這些載體的sc—TCR插入物如圖9A所示。載體如圖10所示。
用冷PBS清洗CHO細(xì)胞以備轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞重懸浮于PBS中并與10—40μg PvuI線性化的pKC60KM混合。冰上置10分鐘后，細(xì)胞用設(shè)置為傳送250伏、960μFd脈沖的Gene Pulser(BioRad)進(jìn)行電穿孔。經(jīng)脈沖的細(xì)胞置于冰上，加入10％IMDM培養(yǎng)基(IMDM、10％FBS、2mM谷氨酰胺、5000單位／ml青霉素、5000μg／ml鏈霉素)。將細(xì)胞稀釋后加入96孔板中。37℃10％CO2溫育過(guò)夜后，將細(xì)胞培養(yǎng)于新霉素選擇性培養(yǎng)基(IMDM、0．77 mg／ml G418)中，每3—7天換一次培養(yǎng)基。“模擬”轉(zhuǎn)染用細(xì)胞和PBS進(jìn)行，作為陰性對(duì)照。
用抗獨(dú)特型抗體、抗D011．10TCR mAb、KJ—1在ELISA試驗(yàn)中篩選表達(dá)可溶性sc—TCR—IgG Cκ分子的轉(zhuǎn)染體。已公開(kāi)的關(guān)于sc—TCR的報(bào)道已證實(shí)，功能性TCR與對(duì)抗獨(dú)特型單克隆抗體(mAb)的結(jié)合之間具有十分密切的關(guān)系，即抗獨(dú)特型mAb所識(shí)別的sc—TCR可主要識(shí)別MHC相關(guān)肽。參見(jiàn)Relter，Y．等，(1995)免疫2，281—287。為篩選轉(zhuǎn)染體，96孔板用KJ—1的碳酸氫鈉緩沖液，pH 8．2被動(dòng)包被過(guò)夜。在試驗(yàn)日，用3—5％脫脂奶粉(NFDM)封閉板至少1小時(shí)。洗滌各孔，將轉(zhuǎn)染體上清加入板中。溫育并洗板后，板上加生物素化的抗CβmAb H57—597(ATCC錄入號(hào)HB—218)作用30分鐘，然后洗板并與鏈霉抗生物素蛋白—HRP溫育。加入TMB底物，用1N硫酸猝滅反應(yīng)，經(jīng)讀取450nM的吸收值而鑒別出陽(yáng)性孔。大腸桿菌中產(chǎn)生的sc—TCR的純化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。
鑒別出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染體較多，但只選用來(lái)自最高稀釋板的克隆作擴(kuò)大培養(yǎng)。4克隆在自原始96孔板開(kāi)始傳代之前，再次用ELISA檢驗(yàn)。根據(jù)這一定量篩選，克隆產(chǎn)生的可溶性DO11．10 sc—TCR—IgG Cκ均在200—400ng／ml的范圍內(nèi)。這些資料明確指示，可溶性sc—TCR—IgG Cκ融合蛋白具有正確折疊的Vα和Vβ對(duì)。
載體pSUN27已按布達(dá)佩斯條約保藏于上述地址的ATCC。該DNA載體于1997年9月17日保藏于ATCC，錄入號(hào)209276。載體pSUN27包括CMV啟動(dòng)子、小鼠輕鏈前導(dǎo)序列、Kozak共有序列、小鼠Cκ基因內(nèi)含子和外顯子序列。參見(jiàn)圖10，及Near等，文獻(xiàn)同上。
載體pSUN27經(jīng)設(shè)計(jì)能使各種sc—TCR分子與小鼠Cκ融合。例如，為將所需sc—TCR分子插入pSUN27載體，載體的多接頭序列可用限制酶AgeⅠ和BstBⅠ消化并連接至已用AgeⅠ和BstBⅠ或ClaⅠ消化的sc—TCR分子上。此外，載體pSUN9能容納多種Ig—CL鏈或其它Ig—CL鏈片段。例如，為構(gòu)建含有人類Cκ鏈的可溶性融合蛋白，可用BstBⅠ和XhoⅠ消化pSUN9。人類κ片段是將pDRHK載體用EcoNⅠ和XhoⅠ消化得到的，并克隆至pSUN9的BstBⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)。
載體pDRHK已按布達(dá)佩斯條約存放于上述地址的ATCC。該DNA載體于1997年9月17日存放于ATCC，錄入號(hào)209274。載體pDRHK為哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，包括CMV啟動(dòng)子、小鼠IgCκ前導(dǎo)肽、克隆區(qū)、小鼠κ內(nèi)含子和人類κ恒定區(qū)外顯子序列。
圖12顯示了由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的單鏈TCR(DO11．10)—κ融合體的蛋白印跡。上清取自親和純化之前(第2道)和層析收集部分(第3道)。將5μl樣品與2x SDS裂解緩沖液按1∶1的比例混合，在12％SDS—PAGE上按變性及非還原條件電泳。用兩步檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)蛋白。首先，將膜用生物素標(biāo)記的H57 mAb(1∶5000的稀釋度)進(jìn)行探測(cè)，然后，使膜與鏈霉抗生物素蛋白辣根過(guò)氧化酶(1∶2500)一起溫育。數(shù)據(jù)表明CHO細(xì)胞表達(dá)了sc—TCR—κ融合體，提示與CNBr活化的sepahrose珠偶聯(lián)的H57mAb可用于從培養(yǎng)上清中有效取出sc—TCR—κ融合體。
圖13顯示了純化的sc—TCR(DO11．10)—κ融合體的蛋白印跡。對(duì)含有sc—TCR—κ融合體(參見(jiàn)圖12)的培養(yǎng)上清300ml進(jìn)行H57 mAb親和柱層析。按標(biāo)準(zhǔn)的親和層析過(guò)程進(jìn)行，用0．1M甘氨酸pH3．0從層析柱中洗脫sc—TCR—κ融合體。第1道代表大腸桿菌中產(chǎn)生的sc—TCR(DO11．10)(陽(yáng)性對(duì)照)，遷移到大約50千道爾頓(kD)。第2—4道代表純化的sc—TCR(D011．10)—κ融合體從最高濃度(第2道)到最低濃度(第4道)的稀釋液。膜用與圖12所述基本相同的方法探測(cè)。
圖14顯示純化的sc—TCR—κ融合體的考馬斯亮蘭染色。純化經(jīng)兩個(gè)抗體親和柱完成。第一步，使含有sc—TCR—κ融合體的培養(yǎng)上清通過(guò)KJ—1抗體柱。KJ—1是識(shí)別D011．10TCR中正確配對(duì)的Vα和Vβ鏈的抗克隆型mAb。第1(最強(qiáng))—3(最弱)道代表純化的sc—TCR—κ融合體的各等份。從KJ—1層析柱收集含有純化sc—TCR—κ融合體的級(jí)分后，使樣品通過(guò)H57 mAb柱。第5和6道說(shuō)明正確大小的蛋白分子的富集。將樣品在12％SDS—PAGE上按變性和非還原條件電泳，然后用考馬斯亮蘭染色。
另外還進(jìn)行了三結(jié)構(gòu)域sc—TCR—κ融合體和四結(jié)構(gòu)域sc—TCR—κ融合體瞬時(shí)表達(dá)的研究。COS細(xì)胞分別用質(zhì)粒pKC60—M(pSUN27)、三結(jié)構(gòu)域sc—TCR或pKC75—M、四結(jié)構(gòu)域sc—TCR進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，取1ml培養(yǎng)上清與0．5μgmAb F23．1(抗Vb8．2)一起溫育過(guò)夜。第二天用山羊抗小鼠抗體包被的磁珠(Dynal)使sc—TCR—κ融合體與F23．1mAb形成的免疫復(fù)合體沉淀。充分洗滌后，將磁珠懸浮于1x SDS裂解液10μl中并煮沸。在12％SDS—PAGE上按變性和非還原條件電泳并轉(zhuǎn)移蛋白后，用生物素標(biāo)記的H57mAb和鏈霉抗生物素蛋白—HRP偶聯(lián)物探測(cè)尼龍膜上的sc—TCR—κ融合分子。結(jié)果如圖15所示。第1道為陰性對(duì)照F23．1，與模擬轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的上清一起溫育；第2道為pSUN27(三結(jié)構(gòu)域sc—TCR，由Vα—VβCβ—κ融合體組成)；第4和5道為pKC75—M的兩種不同分離物(四結(jié)構(gòu)域sc—TCR，另包含Cα片段)。顯然，四結(jié)構(gòu)域sc—TCR—κ融合體的表達(dá)即使不比三結(jié)構(gòu)域sc—TCR的好，也是同水平的，而且不同于pSUN27 sc—TCR—κ融合體的表達(dá)，pKC75—M融合體的均二聚體和單體以大致相等比例存在。
圖16顯示瞬時(shí)表達(dá)的sc—TCR(DO11．10)—κ融合變體的ELISA。sc—TCR融合體的分析用夾心ELISA進(jìn)行，其中利用KJ—1抗克隆型mAB進(jìn)行捕獲，用生物素標(biāo)記的H57mAB及鏈霉抗生物素蛋白HRP檢測(cè)結(jié)合的sc—TCR—κ融合體。
圖17顯示檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中sc—TCR(p—149)—κ融合蛋白表達(dá)的夾心ELISA。各孔用特異于Vα2．3的mAb包被，結(jié)合的sc—TCR融合體用抗Vβ11的mAb或mAb H57檢測(cè)。
圖18顯示sc—TCR p149和sc—TCR p149—κ融合蛋白在COS細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)。所設(shè)計(jì)的sc—TCR為含有或不含有κ恒定區(qū)的Vα—Cα8．2—Vβ／Cβ。表達(dá)的蛋白用夾心ELISA檢測(cè)，其中細(xì)胞用α—Vα2．1mAb包被，受體通過(guò)與α—Vβ11．0生物素標(biāo)記的mAb和鏈霉抗生物素蛋白—HRP偶聯(lián)物結(jié)合而檢測(cè)。
實(shí)施例6—可溶性p—149 sc—TCR融合蛋白在大腸桿菌中的構(gòu)建和表達(dá)T細(xì)胞克隆p149識(shí)別受HLA—A2．1限制化的Hu野生型p53的一段肽(STPPPGTRV)。參見(jiàn)Theobald，M．等(1995)PNAS(USA)92，11993—11997。T細(xì)胞受體基因已如上述克隆為三結(jié)構(gòu)域單鏈形式，以產(chǎn)生可溶性TCR和功能性受體分子。
簡(jiǎn)短說(shuō)，自T細(xì)胞克隆分離mRNA，用Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)制備cDNA。以此cDNA為模板用引物KC171(SEQ ID NO．134)和KC173(SEQ ID NO．136)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以產(chǎn)生5’SfiⅠ—3’SpeⅠ Vβ鏈片段，再用引物KC171(SEQ ID NO．134)和KC174(SEQ ID NO．137)進(jìn)行PCR產(chǎn)生其中含有Cβ鏈的7個(gè)氨基酸的相似Vβ片段。相同的cDNA再作為PCR模板，以引物KC172(SEQ ID NO．135)和KC176(SEQ ID N0．138)產(chǎn)生5’XhoⅠ—3’XmaⅠ VβCβ鏈片段。Cβ鏈在緊鄰其全長(zhǎng)鏈中第127位半胱氨酸殘基之前被截短。
將α和β鏈片段克隆至pGEM—T Easy載體系統(tǒng)進(jìn)行DNA測(cè)序。將正確片段限制性消化，克隆至表達(dá)載體pKC60或pKC67，以產(chǎn)生Vα—(G4S)4—VβCβsc—TCR分子。
pKC60和pKC67載體用相應(yīng)限制酶消化以切出上述編碼單鏈分子的基因片段，并連接p—149α和β鏈片段。新載體命名為pNAG1和pNAG2。pNAG1和pNAG2的DNA插入物如圖9B示。
含VβCβ基因的DNA區(qū)段用引物KC199(SEQ ID NO．139)和KC176(SEQ ID NO．138)PCR擴(kuò)增為5’SfiⅠ—3’XmaⅠ片段。經(jīng)測(cè)序并克隆至表達(dá)載體作為只含β鏈的陰性對(duì)照。
K91大腸桿菌細(xì)胞用sc—ICR構(gòu)建體pNAG1轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在高磷酸鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜以防止蛋白誘導(dǎo)，然后洗滌細(xì)胞，重新懸浮于缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基中以使sc—TCR蛋白表達(dá)。簡(jiǎn)短說(shuō)，在搖瓶中培養(yǎng)過(guò)夜后，細(xì)胞在缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基中多次洗滌。sc—TCR融合蛋白的表達(dá)通過(guò)將洗過(guò)的細(xì)胞重新懸浮于缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基中而啟動(dòng)。誘導(dǎo)約4小時(shí)后，收獲細(xì)胞。通常4小時(shí)的誘導(dǎo)時(shí)間可得到合適水平的可溶性sc—TCR融合蛋白，蛋白印跡可檢測(cè)。受控于phoA啟動(dòng)子對(duì)照的sc—TCR融合蛋白可通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)在3和10升發(fā)酵罐或其它大批量制備容器如生物反應(yīng)器中，而獲得較高產(chǎn)量(如約10—400mg之間)。
我們發(fā)現(xiàn)，sc—TCR融合蛋白在慢誘導(dǎo)條件下的表達(dá)促進(jìn)了融合蛋白的可溶性表達(dá)。
實(shí)施例7—可溶性p—149 sc—TCR融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的構(gòu)建和表達(dá)用大腸桿菌DNA構(gòu)建體pNAG1和pNAG2作模板，以引物KC203(SEQ IDNO．140)和KC204(SEQ ID NO．141)進(jìn)行PCR產(chǎn)生5’AgeⅠ—3’ClaⅠ sc—TCR—κ鏈融合片段?？捎靡颣C203(SEQ ID NO．140)和KC205(SEQ IDNO．142)經(jīng)PCR擴(kuò)增相同的模板DNA而產(chǎn)生5’AgeⅠ—3’ClaⅠ sc—TCR，以表達(dá)不含κ鏈的蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞用此DNA轉(zhuǎn)染，經(jīng)ELISA方法篩選sc—TCR蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例8—sc—TCR融合蛋白株的生產(chǎn)比較合乎需要的是選擇特定的大腸桿菌菌株以使sc—TCR融合蛋白的可溶性表達(dá)達(dá)到最高水平。例如，可分析好幾株已知的大腸桿菌菌株表達(dá)sc—TCR融合蛋白的能力(如XL1—B、MM294、TB1、UT5600和K91Kan)。簡(jiǎn)短說(shuō)，宿主細(xì)胞株可用如pKC60、pKC73、pKC74或pKC75轉(zhuǎn)化，在適于所編碼的sc—TCR融合蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)。然后在磷酸鹽培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株。sc—TCR融合蛋白的誘導(dǎo)通過(guò)在缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而進(jìn)行。sc—TCR表達(dá)水平可經(jīng)多種常規(guī)方法測(cè)定，包括用特異性識(shí)別sc—TCR融合蛋白的抗體進(jìn)行探測(cè)的蛋白印跡。
簡(jiǎn)短說(shuō)，蛋白印跡操作如下在12％SDS—PAGE凝膠上加50D／ml轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮液5μl，按標(biāo)準(zhǔn)的蛋白印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移至印跡膜上。用如抗EE標(biāo)記的抗體(得到加利福尼亞圣迭戈的圣迭戈大學(xué)Gernot Walter’s實(shí)驗(yàn)室許可)探測(cè)印跡膜可檢測(cè)sc—TCR?；蛘撸捎闷渌笶E抗體和EE標(biāo)記(如Pharmacia的類似產(chǎn)品)。抗體結(jié)合后，加入山羊抗小鼠HRP標(biāo)記的偶聯(lián)物(Jackson實(shí)驗(yàn)室)。
未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)中發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌K91KAN菌株十分適于表達(dá)含sc—TCR分子的融合蛋白，尤其是pKC60載體。K91KAN菌株可產(chǎn)生大量的本發(fā)明之sc—TCR融合蛋白。
實(shí)施例9—sc—TCR融合蛋白的純化在此公開(kāi)的sc—TCR融合蛋白必要時(shí)可從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中按常規(guī)方法經(jīng)免疫層析純化。包含噬菌體衣殼蛋白的sc—TCR融合蛋白的純化方案已在未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第09／813，781號(hào)中公開(kāi)。
簡(jiǎn)言之，其中一個(gè)適宜純化方案如下。層析柱可按每ml蛋白A包被的sepharose磁珠與約5mg倉(cāng)鼠抗小鼠αβTCR抗體H57—597(ATCC錄入號(hào)HB—218)偶聯(lián)。將發(fā)酵罐中生產(chǎn)的細(xì)胞糊50g溶于100ml溶解液(O．05M Tris，pH8．0，150mM NaCl和5mM EDTA)得到大腸桿菌裂解物。重新懸浮的細(xì)胞兩次通過(guò)French Press進(jìn)行裂解。不溶物經(jīng)10，000g離心20分鐘除去。留下上清，以0．2ml／min的流速上樣于抗體柱。隨后用20倍柱體積的PBS洗層析柱，結(jié)合的sc—TCR融合蛋白用0．1M甘氨酸pH3．0洗脫，按1ml級(jí)分收集于含有0．05ml 2M Tris，pH8．0的管中。將含有sc—TCR的級(jí)分集中，對(duì)4升PBS透析過(guò)夜。第二天將純化的蛋白用centricon過(guò)濾器(分子量截留值100)濃縮5—10倍。
sc—TCR融合蛋白制備物可用好幾種方法評(píng)估其純度，如SDS—PAGE凝膠電泳再考馬斯亮蘭染色。蛋白完整性可用上述實(shí)施例5的方法測(cè)定，或用抗體H57—597測(cè)定。或者，對(duì)于可操作連接有EE標(biāo)記的DNA載體，可用EE標(biāo)記抗體作探針。EE抗體識(shí)別一個(gè)9氨基酸的線性表位?？埂狦lu—Glu(EE)EEEEYMPME(SEQ ID NO 98)。
實(shí)施例10—sc—TCR融合蛋白的鑒定公開(kāi)于未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)的以下試驗(yàn)可用于鑒定本發(fā)明的sc—TCR融合蛋白。
A．分子量如上述實(shí)施例5就D011．10 sc—TCR融合蛋白所指出，其它sc—TCR融合蛋白的分子量可經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)SDS—PAGE凝膠電泳再染色如銀染色或考馬斯亮蘭染色而測(cè)定。美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)提供了對(duì)sc—TCR分子用SDS—PAGE電泳測(cè)定分子量的實(shí)施例。預(yù)計(jì)大多數(shù)sc—TCR蛋白的分子量在40—60Kd之間，優(yōu)選在約45—58Kd之間。
B．抗體競(jìng)爭(zhēng)一套抗αβTCR mAb可用于鑒定本文公開(kāi)的sc—TCR融合蛋白，尤其是含小鼠κ鏈的蛋白。例如，倉(cāng)鼠mAb H57—597可識(shí)別C—β區(qū)的一個(gè)表位。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)分析結(jié)合單鏈可變區(qū)鏈上空間位置接近之表位的選定抗體之間的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)是有可能的。例如，MR5—2和H57—597抗體可用于對(duì)包含合適Vα，Vβ區(qū)的sc—TCR融合蛋白上的表位作圖。如未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)所公開(kāi)，已發(fā)現(xiàn)MR5—2和H57—597抗體識(shí)別的表位在空間位置上十分接近?？捎闷渌贵w進(jìn)一步鑒定可溶性融合蛋白中的sc—TCR部分，包括那些特異性識(shí)別標(biāo)記物如9氨基酸EE序列的抗體。
C．構(gòu)象折疊有多種抗獨(dú)特型mAb可用于檢驗(yàn)本文之sc—TCR融合蛋白中Vα，β區(qū)是否正確折疊。例如，如未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)公開(kāi)，pKC60 DNA載體編碼的融合蛋白確能正確折疊，證據(jù)是它可結(jié)合抗Vβ8．2抗體(MR5—2和F23．1)以及抗獨(dú)特型mab KJ1(Kappler&Marrack博士所贈(zèng))。簡(jiǎn)言之，將sc—TCR融合蛋白與抗Vβ8．2抗體一起于4℃溫育過(guò)夜，第二天與山羊抗小鼠抗體包被的磁珠(Dynal)結(jié)合。室溫(RT)再溫育該材料1小時(shí)。按常規(guī)過(guò)程使免疫復(fù)合體沉淀。然后用0．5ml PBS+0．5M NaCl充分洗滌磁珠以除去非特異結(jié)合的蛋白。經(jīng)4次洗滌后，將磁珠重新懸浮于含或不含β—巰基乙醇的SDS裂解液50μ1中，煮沸3分鐘。取出磁珠，將溶液上樣于12％SDS—PAGE凝膠上，在120伏電壓下電泳1小時(shí)。電泳樣品，用HRP標(biāo)記的抗TCR抗體(得自Pharmingen的H57)或抗EE標(biāo)記抗體探測(cè)印跡膜進(jìn)行蛋白印跡。
上述實(shí)施例5公開(kāi)了可用于檢驗(yàn)DO11．10sc—TCR融合蛋白是否正確折疊的特殊抗獨(dú)特型抗體。
D．表面等離子體激元共振(BioCore)表面等離子體激元共振可用于鑒定本發(fā)明之sc—TCR融合蛋白。例如，如未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)所公開(kāi)，pKC51編碼的sc—TCR融合蛋白可以用表面等離子體激元共振鑒定。融合蛋白用標(biāo)準(zhǔn)的夾心試驗(yàn)檢測(cè)，首先將sc—TCR分子捕獲在包被有MR5—2或H57抗體的生物傳感器芯片上(按廠商Pharmacia建議)。通常，若用其中一種抗體捕獲sc—TCR融合蛋白，另一種抗體則用于形成三明治復(fù)合體。數(shù)據(jù)表明，這兩種抗體識(shí)別可變區(qū)鏈的不同區(qū)域并競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合sc—TCR。
超抗原(即SAg)無(wú)需MHC形式的呈遞便能結(jié)合某些V—β鏈。TCR和SAg之間的相互作用發(fā)生在V—β鏈的第4高變區(qū)(HV4)。由于SAg與HV4區(qū)的相互作用依賴于構(gòu)象，故可應(yīng)用表面等離子體激元共振測(cè)定sc—TCR融合蛋白是否能結(jié)合包被在芯片上的SAg。已知SAg能與TCR V—β8．2結(jié)合。已報(bào)道的用表面等離子體激元共振的最高親和力為5×10—5摩爾，由此使相互作用與TCR—MHC／肽的相互作用相當(dāng)。
對(duì)包含可結(jié)合超抗原之單鏈可變區(qū)的sc—TCR融合蛋白的構(gòu)建也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其中，如未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)所公開(kāi)，被稱為SEC3的鏈球菌SAg(毒素技術(shù)，Tampa F1．)可結(jié)合包含V—β8．2區(qū)的sc—TCR分子。如已公開(kāi)，超抗原經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)化學(xué)法偶聯(lián)到芯片上。純化的融合蛋白以2μl／min的流速通過(guò)芯片，濃度范圍約2μM—16μM。作為對(duì)照，融合蛋白對(duì)空白芯片的非特異結(jié)合與對(duì)SEC3包被芯片的特異性結(jié)合的測(cè)定實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行。有關(guān)結(jié)合的數(shù)據(jù)通過(guò)比較sc—TCR與這兩種芯片結(jié)合的差別進(jìn)行總結(jié)。數(shù)據(jù)表明，sc—TCR分子與芯片上的SEC3 SAg之間存在特異性相互作用。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明sc—TCR分子包含一個(gè)正確構(gòu)象的V—β8．2區(qū)。
未決的美國(guó)專利申請(qǐng)第08／813，781號(hào)公布，pKC60載體產(chǎn)生的融合蛋白根據(jù)Biocore的測(cè)定可與SEC3超抗原結(jié)合。相關(guān)的Biocore實(shí)驗(yàn)可對(duì)本發(fā)明之能結(jié)合超抗原的sc—TCR融合蛋白進(jìn)行以測(cè)定是否正確折疊。
實(shí)施例11—融合蛋白在OVA特異性T細(xì)胞雜交瘤結(jié)合試驗(yàn)中的活性檢驗(yàn)包含sc—MHCⅠ類或Ⅱ類分子的MHC復(fù)合體功能的試驗(yàn)已由上述已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及上述未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454公開(kāi)。更具體地說(shuō)，公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US97／01617公開(kāi)了T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞試驗(yàn)、用于這類試驗(yàn)的細(xì)胞(如DO11．10)、帶有共價(jià)連接或非共價(jià)結(jié)合的呈遞肽(如OVA或HSV gD12肽)的sc—MHCⅠ類和Ⅱ類分子。
已公開(kāi)的試驗(yàn)均特別適于測(cè)定本文sc—TCR融合蛋白的功能。一般而言，這些試驗(yàn)都是基于細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，可用于測(cè)定sc—TCR融合蛋白的功能及生物活性。例如，上述實(shí)施例1和2中產(chǎn)生的可溶性融合蛋白可用于阻斷DO11．10細(xì)胞中超抗原或抗原參與MHC分子中。根據(jù)上述方法，相互作用通過(guò)測(cè)量IL—2的產(chǎn)量而檢測(cè)。
A)細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞試驗(yàn)已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454公開(kāi)了一種T細(xì)胞雜交瘤試驗(yàn)。這類試驗(yàn)可方便用于檢驗(yàn)本發(fā)明之sc—TCR融合蛋白的功能。
簡(jiǎn)言之，DO11．10T細(xì)胞雜交瘤系可表達(dá)特異于小雞卵白蛋白之17氨基酸肽片段(第323—339位氨基酸)的細(xì)胞表面T細(xì)胞受體。OVA肽由表達(dá)小鼠Ⅱ類MHC分子I—Ad的APC呈遞給DO11．10細(xì)胞。當(dāng)肽被適當(dāng)APC呈遞時(shí)，DO11．10細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL—2進(jìn)行應(yīng)答，而IL—2的產(chǎn)生可用來(lái)衡量T細(xì)胞的活化。一項(xiàng)T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞試驗(yàn)的實(shí)例如下述。
將sc—IAd／OVA復(fù)合體與sc—TCR融合蛋白一起稀釋在DPBS(無(wú)Mg2+和Ca2+離子)中，并用來(lái)包被96孔板。優(yōu)選地，sc—IAd／OVA肽包括共價(jià)連接的呈遞肽。室溫溫育過(guò)夜后，各孔用無(wú)Mg2+和Ca2+離子的DPBS洗兩次。將約1×105DO11．10細(xì)胞在包被或未包被0．5μg MHC／肽分子的孔中37℃溫育4或7小時(shí)。在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，sc—TCR融合蛋白可與DO11．10細(xì)胞一起加入。
為證實(shí)DO11．10細(xì)胞系衍生的sc—TCR融合蛋白(參見(jiàn)上述實(shí)施例1和2)的特異性，可應(yīng)用第二種T細(xì)胞雜交瘤(gD)，該雜交瘤也是IAd限制性的，但能識(shí)別HSV肽。gD T細(xì)胞雜交瘤已公開(kāi)于PCT申請(qǐng)PCT／US97／01617中。利用該試驗(yàn)可證實(shí)sc—TCR融合蛋白能抑制DO11．10雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL—2，而對(duì)gD 12T細(xì)胞雜交瘤的IL—2生產(chǎn)抑制效應(yīng)很小(如果有的話)。在含完全培養(yǎng)基(RPMI 1640，添加了10％FBS、青霉素／鏈霉素和L—谷氨酰胺)的96孔平底板上進(jìn)行培養(yǎng)。溫育4或7小時(shí)后，用IL—2夾心ELISA法分析培養(yǎng)上清中是否有IL—2。
適于檢測(cè)IL—2的方案已公開(kāi)在已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454和08／596，387中。適宜的IL—2夾心ELISA實(shí)驗(yàn)程序基本如PharMingen所述進(jìn)行。簡(jiǎn)短說(shuō)，用50μl的2μg／ml大鼠抗小鼠IL—2抗體包被各孔。4℃溫育過(guò)夜后抗體通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散而結(jié)合到塑料上。用PBS／0．5％吐溫20洗板兩次，然后每孔加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫溫育4小時(shí)。再用PBS／吐溫洗板六次，然后加入第二抗體即生物素化的大鼠抗小鼠IL—2抗體。將該抗體室溫溫育1小時(shí)，然后用PBS／吐溫洗板六次。最后，每孔加入100μl的25μg／ml鏈霉抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶，室溫溫育30分鐘。用PBS／吐溫洗板8次后，加入100μl ABTS底物，在OD405nm讀取信號(hào)。通過(guò)對(duì)IL—2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪圖而定量確定產(chǎn)生的IL—2的濃度。
用于活化DO11．10和gD12細(xì)胞的I—Ad／肽分子的最佳劑量為可提供略次于最強(qiáng)應(yīng)答的劑量。因此，實(shí)驗(yàn)可在包被了0．5μg I—Ad／肽的孔中溫育4或7小時(shí)而完成。
通常可檢驗(yàn)本發(fā)明之可溶性sc—TCR融合蛋白阻止DO11．10細(xì)胞產(chǎn)生IL—2的量于10—9—10—4M濃度范圍的能力。可用約10∶1至1∶1摩爾比的可溶性sc—TCR和包被于板上的可溶性I—Ad／肽分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。濃度可根據(jù)需要調(diào)節(jié)。最佳情況下，與可溶性sc—TCR融合蛋白預(yù)先溫育后DO11．10的IL—2產(chǎn)量比gD12的IL—2產(chǎn)量減少，說(shuō)明可溶性sc—TCR融合蛋白能以TCR特異性方式抑制免疫應(yīng)答。
由于TCR與MHC／肽的結(jié)合親和力較低，故在抑制試驗(yàn)中用sc—TCR融合蛋白并非總能觀察到IL—2產(chǎn)生減少。但通過(guò)如下述產(chǎn)生多價(jià)sc—TCR融合蛋白可提高相互作用的親和力。通過(guò)提高sc—TCR融合蛋白的親和力(并阻止它們解離)，幾乎沒(méi)有TCR能有機(jī)會(huì)結(jié)合MHC／肽復(fù)合體。
實(shí)施例12—多價(jià)融合蛋白的制備有好幾種已知方法可用于制備多價(jià)分子。多價(jià)sc—TCR融合蛋白可通過(guò)將本發(fā)明之sc—TCR融合蛋白按標(biāo)準(zhǔn)方法生物素化，再在加入鏈霉抗生物素蛋白后交聯(lián)分子而制備。生物素—鏈霉抗生物素蛋白的偶聯(lián)可產(chǎn)生多價(jià)sc—TCR融合蛋白，通常為四聚體形式。
這樣的多價(jià)sc—TCR融合蛋白也可通過(guò)將融合蛋白根據(jù)已知方法(參見(jiàn)如Newman，S．L．等，免疫學(xué)雜志(1995)154，753)共價(jià)連接于膠乳珠(Polysciences，Inc．Warrington，PA)上而制備。例如，sc—TCR融合蛋白可直接通過(guò)氨基或二硫基與膠乳珠偶聯(lián)。用鏈霉抗生物素蛋白或可特異性結(jié)合sc—TCR的抗體包被膠乳珠都可使sc—TCR的變性減至最小。例如，如果sc—TCR如上述包括EE標(biāo)記，便可用EE標(biāo)記抗體包被膠乳珠。
實(shí)施例13—sc—TCR融合蛋白體外對(duì)抗原刺激的T細(xì)胞增殖的影響可檢驗(yàn)本發(fā)明之sc—TCR融合蛋白抑制抗原刺激的T細(xì)胞增殖的能力。
例如，在上述已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454的一個(gè)實(shí)施方法中，T細(xì)胞首先從哺乳動(dòng)物如小鼠中分離。例如，用于完全弗氏佐劑中的50μg OVA323—339—KLH皮下接種于BALB／C小鼠(MHCⅡ類I—Ad)的尾根部可得到OVA致敏的T細(xì)胞(參見(jiàn)Harlow&Lane，文獻(xiàn)同上)。例如，可間隔7天進(jìn)行兩次免疫接種，第二次注射的一周后，可處死小鼠，取出腹股溝淋巴結(jié)和體側(cè)淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液。然后將單細(xì)胞懸液在尼龍纖維和Sephadex G—10柱上溫育以耗盡抗原呈遞細(xì)胞?？蓪⒓兓腡細(xì)胞群再單與Click’s培養(yǎng)基溫育，或與溶于Click’s培養(yǎng)基中的sc—TCR融合蛋白一起溫育。
BALB／c小鼠的活化B細(xì)胞可作為APC用于常規(guī)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)中。例如，B細(xì)胞可制備如下加50μg／ml LPS(即脂多糖)將脾細(xì)胞培養(yǎng)48—72小時(shí)，此時(shí)可通過(guò)在Ficoll／Hypaque(Pharmacia)上經(jīng)密度梯度離心分離活化的細(xì)胞。用OVA 323—339肽對(duì)活化B細(xì)胞脈沖3小時(shí)，充分洗滌，用多聚甲醛固定以抑制B細(xì)胞增殖，再加入純化T細(xì)胞本身中或T細(xì)胞加上sc—TCR融合蛋白混合物中。參見(jiàn)細(xì)胞免疫學(xué)可選方法，(1980)B．B．Mishell&S．M．Hiigi W．H．Freeman and Co．San Francisco。
可加入上述實(shí)施例1—2所制備的sc—TCR融合蛋白以抑制T細(xì)胞對(duì)APC的結(jié)合。
可在96孔圓底微滴板上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)，試驗(yàn)在37℃、5％CO2中進(jìn)行3—5天?？捎肳ST—1(Boehringer Manngeim)試劑對(duì)板上的孔脈沖4小時(shí)，然后終止培養(yǎng)。再記錄培養(yǎng)物的光密度。sc—TCR融合蛋白存在時(shí)肽反應(yīng)性T細(xì)胞增殖的程度可指示小鼠經(jīng)免疫接種后發(fā)生的TH細(xì)胞應(yīng)答(即克隆擴(kuò)充)。
實(shí)施例14—sc—TCR融合蛋白體內(nèi)對(duì)抗原刺激的T細(xì)胞增殖的影響還可按上述已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US95／09816以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454和08／596，387中公開(kāi)的方法檢驗(yàn)本發(fā)明之sc—TCR融合蛋白體內(nèi)對(duì)T細(xì)胞克隆擴(kuò)充的抑制。
例如，三個(gè)檢驗(yàn)組可如下設(shè)置可對(duì)15只BALB／c小鼠腹膜內(nèi)(IP)注射完全弗氏佐劑中的約10—100μg OVA 323—339—KLH偶聯(lián)物，以誘導(dǎo)對(duì)OVA 323—339肽的免疫應(yīng)答。免疫前1天以及OVA—KLH免疫的2天后，5只小鼠IP注射由D011．10細(xì)胞產(chǎn)生的sc—TCR融合蛋白(實(shí)施例1和2)約10—100μg的PBS溶液。sc—TCR融合蛋白將與I—Ad／OVA MHCⅡ類分子結(jié)合，減少或消除TCR分子參與抗原特異性T細(xì)胞。剩下10只小鼠可作為對(duì)照。例如其中5只可接受PBS，另5只接受sc—TCR融合蛋白。免疫的10天后處死小鼠。取出淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液。使該懸液在尼龍纖維和Sephdex G—10柱上溫育以耗盡抗原呈遞細(xì)胞。
所得純化T細(xì)胞群可與被OVA 323—339肽脈沖的APC一起溫育?？捎肂ALB／c小鼠的活化B細(xì)胞作為增殖試驗(yàn)中的APC。B細(xì)胞的制備如下將小鼠脾細(xì)胞與50μg／ml LPS混合培養(yǎng)48—72小時(shí)，此時(shí)可在Lymphoprep上經(jīng)密度梯度離心分離活化的細(xì)胞。然后用OVA 323—339肽對(duì)活化B細(xì)胞進(jìn)行脈沖3小時(shí)，充分洗滌，用多聚甲醛固定以抑制B細(xì)胞增殖，再加至純化的T細(xì)胞中。
可在96孔圓底微滴板上進(jìn)行T細(xì)胞增殖試驗(yàn)，試驗(yàn)條件為37℃、5％CO2，3—5天。可用WST—1試劑對(duì)板上的孔脈沖4小時(shí)，然后終止培養(yǎng)并讀取不同吸光度。該試驗(yàn)中肽反應(yīng)性T細(xì)胞增殖的程度可指示小鼠免疫后發(fā)生的TH細(xì)胞應(yīng)答(即克隆擴(kuò)充)。預(yù)計(jì)sc—TCR融合蛋白與OVA—KLH或與HSV—KLH一起注射，將能限制克隆擴(kuò)充量及后續(xù)OVA反應(yīng)性T細(xì)胞系的體外增殖，而不影響HSV反應(yīng)性T細(xì)胞系的擴(kuò)充。
實(shí)施例15—小鼠自身免疫病的抑制試驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎(EAE)是一種自身免疫病，一般被認(rèn)為是多發(fā)性硬化癥的動(dòng)物模型。兩種蛋白的致腦炎區(qū)髓鞘脂堿性蛋白(MBP第91—103位氨基酸)和蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP第139—151位氨基酸)已得到鑒定。參見(jiàn)Martin，R．等(1992)免疫學(xué)年鑒10153。
在SJL小鼠中，經(jīng)致腦炎肽免疫或MBP反應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移后可誘發(fā)EAE。為測(cè)定可溶性抗MBP 91—103或抗PLP 139—151 T細(xì)胞受體的治療能否預(yù)防T細(xì)胞活化后的EAE進(jìn)程，可對(duì)SJL小鼠體內(nèi)注射MBP 91—103和PLP 139—151反應(yīng)性T細(xì)胞母細(xì)胞。適于檢測(cè)這類小鼠中T細(xì)胞擴(kuò)充的試驗(yàn)已公開(kāi)于上述已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454中。
正如上述已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454所述，在SJL小鼠背部免疫接種于完全弗氏佐劑中的約400μg MBP91—103可誘導(dǎo)EAE。10—14天后，如上述收獲定域引流(regional draining)淋巴結(jié)細(xì)胞，在24孔板上按每孔6×106細(xì)胞的量加入RPMI 1640培養(yǎng)基／10％胎牛血清／1％青霉素／鏈霉素／50μg／ml MBP 1．5 ml進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)4天的體外刺激后，通過(guò)Ficoll／Hypaque密度梯度離心(Pharmacia)收獲MBP 91—103反應(yīng)性T細(xì)胞母細(xì)胞，用PBS洗兩次，然后每只小鼠注射1．3 ×1O7細(xì)胞。
接受了致腦炎性MBP 91—103反應(yīng)性T細(xì)胞的小鼠可再在當(dāng)天、第3和7天靜脈注射含有特異于MBP 91—103之Vαβ鏈的sc—TCR融合蛋白100μg、含有特異于PLP 139—151之Vαβ鏈的sc—TCR融合蛋白100μg(陰性對(duì)照)、或生理鹽水(空白對(duì)照)(總劑量為300μg)?？蛇M(jìn)行臨床和組織學(xué)評(píng)估以證實(shí)對(duì)MBP 91—103+IA有反應(yīng)性的sc—TCR分子抑制小鼠EAE的進(jìn)程。
如上述已公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT／US95／09816、PCT／US97／01617號(hào)以及未決的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08／382，454所述，為了用PLP肽139—151誘導(dǎo)SJL小鼠的EAE，可對(duì)小鼠免疫接種溶于PBS并按1∶1的比例與包含4mg／ml結(jié)核分枝桿菌H37Ra的完全弗氏佐劑混合的PLP肽139—151。小鼠可隨后接種152μg肽佐劑復(fù)合體。當(dāng)天及48小時(shí)后，所有動(dòng)物接受400ng百日咳毒素。然后如上述進(jìn)行EAE的過(guò)繼轉(zhuǎn)移。
根據(jù)上述方法(參見(jiàn)實(shí)施例1)，可自正常及患有EAE病的SJC小鼠獲得TCR DNA。此TCR DNA可用于構(gòu)建sc—TCR，用于與適當(dāng)DNA載體連接形成本發(fā)明之包含小鼠κ鏈或其合適片段的sc—TCR融合蛋白。然后可根據(jù)上述實(shí)施例表達(dá)并在必要時(shí)純化PLP或MBP反應(yīng)性sc—TCR融合蛋白。還可再檢驗(yàn)sc—TCR融合蛋白預(yù)防EAE發(fā)展的能力。
本文就本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述。但本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員清楚，理解了本文公開(kāi)內(nèi)容后，可在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)進(jìn)行各種修改和改進(jìn)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人Sunol Molecular Corporation(ⅱ)發(fā)明題目可溶性單鏈T細(xì)胞受體蛋白(ⅲ)序列數(shù)146(ⅳ)通訊地址(A)地址Dike，Bronstein，Roberts & Cushman，LLp(B)街名130 Water Street(C)城市Boston(D)州名(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編02109(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ的Windows 2．0版(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8／943，086(B)申請(qǐng)日1997年10月2日(ⅷ)代理人／代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名Corless, Peter F(B)登記號(hào)33，860(C)參考／文檔號(hào)47594—PCT(ⅸ)電信信息(A)電話617—523—3400(B)電傳617—523—6440(C)電報(bào)(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1CGGCCATGGC CCAGCTGCAG ACTAGTGC 28(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2GGCCGCACTA GTCTGCAGCT GGGCCATGGC CGGCT35(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3CTCGCGGCCC AGCCGGCCAT GGCCGAGGCT GCAGTCACCC AAAGC 45(2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4CTTCCTCACT AGTACAGTCT GCTCGGCCCC AG32(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5GATGGCCTCG AGGAGCAGGT GGAGCAGCTT 30(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6GACTAGCCCG GGACAGGGAA CGTCTGAACT GGG 33(2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7CTCGCGGCCC AGCCGGCCAT GGCCGAGCAG GTGGAGCAGC TTCCT 45(2)SEQ ID NO8的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8CTCGCGCTCG AGGAGGCTGC AGTCACCCAAAGC 33(2)SEQ ID NO9的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9CTCGCGCCCG GGACAGTCTG CTCGGCCCCA GGC 33(2)SEQ ID NO10的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10CTCGCGACTA GTACAGGGAA CGTCTGAACT GGG33(2)SEQ ID NO11的資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11CTCGCGCCCG GGGTCTGCTC GGCCCCAGGC30(2)SEQ ID NO12的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12CTCGCGACTA GTGGGAACGT CTGAACTGGG30(2)SEQ ID NO13的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13CTCGCGACTA GTGTCTGCTC GGCCCCAGGC 30(2)SEQ ID NO14的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14
CTCGCGCCCG GGGGGAACGT CTGAACTGGG 30(2)SEQ ID NO15的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15CTCGCGCTCG AGCGAGGCTG CAGTCACCCA AAGC 34(2)SEQ ID NO16的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16GGGGGGCCCG GGGCTGAGGG TGACGATCCC GCAAAAG 37(2)SEQ ID NO17的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度67個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17CTAGTCTGGT GGCGGTGGCA GCGGCGGTGG TGGTTCCGGT GGCGGCGGTT CTGGCGGTGG 60CGGTTCC 67(2)SEQ ID NO18的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度67個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18TCGAGGAACC GCCACCGCCA GAACCGCCGC CACCGGAACC ACCACCGCCG CTGCCACCGC60CACCAGA 67(2)SEQ ID NO19的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19GTGCTCACTA GTGTTTGGCT CTACAGTGAG TTTGGTG 37(2)SEQ ID NO20的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO20GATGGCTCGA GTGAGCAGGT GGAGCAGCTT CCT 33(2)SEQ ID NO21的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21
CTAGTCCCCG GGTACAACTG TGAGTCTGGT TCC 33(2)SEQ ID NO22的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22CTCGAGACTA GTTACAACTG TGAGTCTGGT TCC 33(2)SEQ ID NO23的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO23CGGCCGAGGA AGAAGAGTAC ATCCCGATGG ATC 33(2)SEQ ID NO24的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO24GGGCCATCCA TCGGGATGTA CTCTTCTTCC TCGGCCGGCT 40(2)SEQ ID NO25的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO25CCGGGGAGGA AGAAGAGTAC ATCCCGATGG ATTGAG 36(2)SEQ ID NO26的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO26AATTCTCAAT CCATCGGGAT GTACTCTTCT TCCTCC 36(2)SEQ ID NO27的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO27GCCCGGGACT AGTGC 15(2)SEQ ID NO28的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO28GGCCGCACTA GTCCCGGGCT GCA 23(2)SEQ ID NO29的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度75個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO29CTAGTCCCCG GGTCATCAAG CGGCGCCTTC CATCGGCATG TACTCTTCTT CCTCTACAAC60TGTGAGTCTG GTTCC 75(2)SEQ ID NO30的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度72個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO30CAGTCCCCG GGTCATCAAG CGGCGCCTTC CATCGGCATG TACTCTTCTT CCTCGTCTGC 60TCGGCCCCAG GC 72(2)SEQ ID NO31的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO31CTAGTCCCCG GGTACAACTG TGAGTCTGGT TCC 33(2)SEQ ID NO32的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO32CCGGGGAGGA AGAAGAGTAC ATGCCGATGG AAGGCGCCGC TTAGC 45(2)SEQ ID NO33的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO33CCTCCTTCTT CTCATGTACG GCTACCTTCC GCGGCGAATC GGGCC 45(2)SEQ ID NO34的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO34GATCAGCCCG GGGAGGCTGC AGTCACCCAA AGC 33(2)SEQ ID NO35的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO35CTAGTCCCCG GGACAGTCTG CTCGGCCCCA CCG 33(2)SEQ ID NO36的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO36CCGGGGAGGA AGAAGAGTAC ATGCCGATGG AAGGCGCCGC TC 42(2)SEQ ID NO37的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO37CCTCCTTCTT CTCATGTACG GCTACCTTCC GCGGCGAGGG CC42(2)SEQ ID NO38的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO38CGCCGCTCAC CATCACCATC ATCACTGATG AC 32(2)SEQ ID NO39的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO39GGCGAGTGGT AGTGGTAGTA GTGACTACTG GGCC 34(2)SEQ ID NO40的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO40GATCAGGGCG CCGCTACTGT TGAAAGTTGT TTA33(2)SEQ ID NO41的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO41CTGATCGGAT CCTCATTAAA GCCAGAATGG AAA33(2)SEQ ID NO42的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO42CCGGGCTAAG CGGCGCCTTC CATCGGCATG TACTCTTCTT CCTCC 45(2)SEQ ID NO43的資料(ⅹ)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO43CCGGGAGCGG CGCCTTCCAT CGGCATGTAC TCTTCTTCCT CC 42(2)SEQ ID NO44的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO44CCGGGTCATC AGTGATGATG GTGAGCG G35(2)SEQ ID NO45的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO45GCTCGAGCTT ACTCC 15(2)SEQ ID NO46的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO46CGCTCATTAG GCGG 14(2)SEQ ID NO47的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO47GTGTACTTCT GTGCC 15(2)SEQ ID NO48的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO48CTGTGAGTCT GGTTC 15(2)SEQ ID NO49的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO49GCAGGTTCTG GGTTC 15(2)SEQ ID NO50的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO50CATTTACTAA CGTCTGG17(2)SEQ ID NO51的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO51CGCCTGGTAC TGAGC 15(2)SEQ ID NO52的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO52CCTCAACCTC CTGTC 15(2)SEQ ID NO53的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO53CTTATTCCGT GGTGTC 16(2)SEQ ID NO54的資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO54CCACCCTCAG AACCG 15(2)SEQ ID NO55的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO55GAATTTACCG TTCCAG 16(2)SEQ ID NO56的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO56CTTTAGCGTC AGACTG 16(2)SEQ ID NO57的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO57
GAAACGCAAA GACACC 16(2)SEQ ID NO58的資料(ⅹ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO58GGGGGGCCCG GGCTGCTGAG GGTGACGATC CCGCAAAAG 39(2)SEQ ID NO59的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO59GGGGGGGAAT TCTATTAGCT TGCTTTCGAG GTGAATTTC 39(2)SEQ ID NO60的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO60GAGCACGGCC CAGCCGGCCA TGGCCGAGGC TGCAGTCACC C 41(2)SEQ ID NO61的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度69個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO61GAGCACGAGA CTAGTAGCAC GAACAACACG GTCGTCGATC GGTTCCGGCG GGTTTGGCTC60TACAGTGAG69(2)SEQ ID NO62的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度86個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰⅰ)序列描述SEQ ID NO62GATCCCTCCT GGACACGCAG GATGGAAGGA AGCTGCTCCA CCTGCTCAGC ACGAACAACA60CGGTCGTCGA TCGGTTCCGG CGGGGC 86(2)SEQ ID NO63的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度86個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO63CATGGCCCCG CCGGAACCGA TCGACGACCG TGTTGTTCGT GCTGAGCAGG TGGAGCAGCT60TCCTCCCATC CTGCGTGTCC AGGAGG 86(2)SEQ ID NO64的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO64GAGGTGGAAT TCTATTAAGA CTCCTTATTA CGCAGTATG 39(2)SEQ ID NO65的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO65GAGGAGGTGG TGACTAGTAG CAGGTTCTGG TGGGTTCTGG ATGTTTGGCT CTACAGTGAG 60(2)SEQ ID NO66的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度57個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO66GAGGAGGTGG TGACTAGAAG CAGGTTCTGG GTTCTGGATG TTTGGCTCTA CAGTGAG 57(2)SEQ ID NO67的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO67GAGGTGGAAT TCTATTAGTG ATGATGGTGA TGGTGAGACT CCTTATTACG C51(2)SEQ ID NO68的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO68GAGGTGCCCG GGACTGTTGA AAGTTGTTTA GC 32(2)SEQ ID NO69的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO69GAGGTGGAAT TCTATTAGTG ATGATGGTGA TGGTGGCTTG CTTTCGAGG49(2)SEQ ID NO70的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO70GAGGTGGAAT TCTATTAGCT TGCTTTCGAG G 31(2)SEQ ID NO71的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO71GAGGTGCCCG GGGCTGAGGG TGACGATCCC G 31(2)SEQ ID NO72的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO72AATTCTCATC AGTGATGATG GTGATGGTGC30(2)SEQ ID NO73的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO73CCGGGCACCA TCACCATCAT CACTGATGAG30(2)SEQ ID NO74的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度56個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO74GTGGAGCCCG GGTTCCATCG GCATGTACTC TTCTTCCTCT ACAACTGTGA GTCTGG 56(2)SEQ ID NO75的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度64個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO75GAGGTGGAAT TCTCACCCGG GTTCCATCGG CATGTACTCT TCTTCCTCGT CTGCTCGGCC60CCAG 64(2)SEQ ID NO76的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度61個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO76GAGGTGCTGC AGGTTCCATC GGCATGTACT CTTCTTCCTC GTCTAGACGG CCCCAGGCCT60C61(2)SEQ ID NO77的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型；線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO77GTGGAGCTGC AGGGTCTAGA CGGCCCCAGG CCTC34(2)SEQ ID NO78的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度59個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO78GTGGAGCTGC AGGTGATCCA CCCCCTCCAG ATCCACCCCC TCCGTCTGCT CGGCCCCAG 59(2)SEQ ID NO79的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO79GTGGAGAAGC TTTGCCGAGC AGGTGGAGCA GC 32(2)SEQ ID NO80的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO80GGGGGGGAGG TGCTGGAGCG AGGCAGCAGT CACC34(2)SEQ ID NO81的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO81GAGCCCACTA GTTTGGCTCT ACAGTGAGTT TGGTG 35(2)SEQ ID NO82的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度65個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO82CTAGACCAGC AAATCTGCAC CCACAGAATC CCTAGGACAG CTCCCAGGTT CCTCTGCATG 60GTGGA 65(2)SEQ ID NO83的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度65個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO83AGCTTCCACC ATGCAGAGGA ACCTGGGAGC TGTCCTAGGG ATTCTGTGGG TGCAGATTTG 60CTGGT 65(2)SEQ ID NO84的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO84GATCGGTCTA GAGGTGAGCA GGTGGAGCAG CTTCC 35(2)SEQ ID NO85的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO85GCCTGGAGAC TCAGCCATG 19(2)SEQ ID NO86的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO86GAAGTACATG GCTGAGTCTC C21(2)SEQ ID NO87的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO87GATGAACGTT CCAGATTCCA TGG 23(2)SEQ ID NO88的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO88CCCAAATCAA TGTGCCGAAA AC 22(2)SEQ ID NO89的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度53個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO89CTAGAACACA GGAGACTGGA GAGCACGAAG AAGAGCCTGG AGCCCATGGT GGA 53(2)SEQ ID NO90的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO90GCTCTCCTTG TAGGCCTGAG20(2)SEQ ID NO91的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO91GTACTTCTGT GCCAGCGGTG20(2)SEQ ID NO92的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO92GAGCAATTAT AGCTACTGCC TG 22(2)SEQ ID NO93的資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO93GGTCTGGAGG CCTTGTATCC 20(2)SEQ ID NO94的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度53個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO94AGCTTCCACC ATGGGCTCCA GGCTCTTCTT CGTGCTCTCC AGTCTCCTGT GTT 53(2)SEQ ID NO95的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度65個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO95TCGAGGAACC GCCACCGCCA GAACCGCCGC CACCGGAACC ACCACCGCCG CTGCCACCGC 60CACCA 65(2)SEQ ID NO96的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度65個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO96CTAGTGGTGG CGGTGGCAGC GGCGGTGGTG GTTCCGGTGG CGGCGGTTCT GGCGGTGGCG 60GTTCC 65(2)SEQ ID NO97的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO97(2)SEQ ID NO98的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO98Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu15(2)SEQ ID NO99的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度63個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO99ATGAAATACC TGCTGCCGAC CGCAGCTGCT GGTCTGCTGC TGCTGGCGGC CCAGCCGATG 60GCC 63(2)SEQ ID NO100的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO100Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Gln Pro Ala Met20(2)SEQ ID NO101的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO101GCCGGCCATG GCCRGTGCTG TCRTCTCTC 30(2)SEQ ID NO102的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO102GCCGGCCATG GCCGAMRCCM ARGTSACCC 29(2)SEQ ID NO103的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO103GCCGGCCATG GCCGATGTGA AAGTAACCC 29(2)SEQ ID NO104的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO104GCCGGCCATG GCCGAMRCWG MCRTYTMCC 29(2)SEQ ID NO105的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO105GCCGGCCATG GCCARKGCTG GDGTCACTC 29(2)SEQ ID NO106的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO106GCCGGCCATG GCCAATGCCG GCGTCATGC 29(2)SEQ ID NO107的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO107GCCGGCCATG GCCGRTRCTG GAGTCTCCC 29(2)SEQ ID NO108的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO108GCCGGCCATG GCCGATGCTR GARTCACCC 29(2)SEQ ID NO109的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO109GCCGGCCATG GCCGATTCTG GAGTCACAC 29(2)SEQ ID NO110的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO110GCCGGCCATG GCCGAYGCTG GWGTTATCC 29(2)SEQ ID NO111的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO111GCCGGCCATG GCCGATGCTG RYRTTAYCC 29(2)SEQ ID NO112的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO112GCCGGCCATG GCCGAAGCTG GAGTTACTCA G 31(2)SEQ ID NO113的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO113GCCGGCCATG GCCGATGCTA CTATTCATCA ATGGCC 36(2)SEQ ID NO114的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO114GCTGCCACCG CCACCCACCT TGTTCAGGTC C31(2)SEQ ID NO115的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO115GCTGCCACCG CCACCCACGT TTTCAGGTCC 30(2)SEQ ID NO116的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO116GGAGGCGGCG GTTCTGCTAA GGAGACCACMC AGCC34(2)SEQ ID NO117的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO117GGAGGCGGCG GTTCTCAGAA GRTAACTCAA RCSC 34(2)SEQ ID NO118的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO118GGAGGCGGCG GTTCTCAGTC KGTGASCCAG C 31(2)SEQ ID NO119的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO119GGAGGCGGCG GTTCTCAGAG AGTGACTCA GCC 33(2)SEQ ID NO120的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO120GGAGGCGGCG GTTCTCWGMA SGTGRAACAA RGTCC 35(2)SEQ ID NO121的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO121GGAGGCGGCG GTTCTCAGCA AGTTAAGCAA AATTC35(2)SEQ ID NO122的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO122GGAGGCGGCG GTTCTGAGAR TGTGGRGCWG CATC 34(2)SEQ ID NO123的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO123GGAGGCGGCG GTTCTAAKGA RGTGGMGCAG RRTYC35(2)SEQ ID NO124的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO124GGAGGCGGCG GTTCTCAGCT GCTGGAGCAG AG 32(2)SEQ ID NO125的資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO125GGAGGCGGCG GTTCTCAAMA GRKAGAASAG RATYC35(2)SEQ ID NO126的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO126GGAGGCGGCG GTTCTGGACA AARCMTTGAR CAG 33(2)SEQ ID NO127的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO127GGAGGCGGCG GTTCTAAGGA CCAAGTGTTT CAG 33(2)SEQ ID NO128的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO128
TTCATAGACT AGTAGGGTCA GGGTTCTGG 29(2)SEQ ID NO129的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO129GGTGGCGGTG GCAGCGGCGG TGGTGGTTCC GGAGGCGGCG GTTCT45(2)SEQ ID NO130的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度47個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO130CCACCGCCAC CGTCGCCCGC CACCACCAAG GCCATCCGCC GCCAAGA 47(2)SEQ ID NO131的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度O個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO131gAggAggTggTgACTAgTgCTgAgggTgCTgTCCTgAg(2)SEQ ID NO132的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO132GAGGAGGTGA CTAGTGCTGG TGAAGCTTGT CTGG 34(2)SEQ ID NO133的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO133GAGGAGGTGG TGACTAGTAC TGGGAACGTC TGAACTGGG 39(2)SEQ ID NO134的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO134GAGGTGGAGG CCCAGCCGGC CATGGCCCAG GTGAGACAAA G 41(2)SEQ ID NO135的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO135GAGGTGGAGC TCGAGCAATG CTGCTGGTGT CATCCAAAC 39(2)SEQ ID NO136的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO136GAGGTGGAGA CTAGTGTCAA GGTTGACCTG AAG 33(2)SEQ ID NO137的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO137GAGGTGGAGA CTAGTAGCAG GTTCTGGGTT CTG 33(2)SEQ ID NO138的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO138GAGGTGGAGC CCGGGGTCTG CTCGGCCCCA GGC 33(2)SEQ ID NO139的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO139GGCCCAGCCG CCAATGCTGG TGTCATCCAAAC AC32(2)SEQ ID NO140的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO140GAGGTGACCG GTCAGCAGGT GAGACAAAGT CC 32(2)SEQ ID NO141的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO141GTGGAGATCG ATAAAGTGTA CTTACGTTTG TCTGCTCGGC CCCAG45(2)SEQ ID NO142的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度53個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO142GTGGAGATCG ATAAGTGTAC TTACGTTTTC ATTAACAGTC TGCTCGGCCC CAG 53(2)SEQ ID NO143的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO143GAGGTGACCG GTGAGCAGGT GGAGCAGCTT CC 32(2)SEQ ID NO144的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO144GTGGAGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTGT CTGCTCGGCC CCA 43(2)SEQ ID NO145的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO145GTGGAGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTTC ATTAGTCTGC TCGGCCCCA 49(2)SEQ ID NO146的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO146Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val1 權(quán)利要求
1．包含與單鏈T細(xì)胞受體共價(jià)連接的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段的可溶性融合蛋白，其中單鏈T細(xì)胞受體包含通過(guò)肽連接序列共價(jià)連接的V—α鏈和V—β鏈。
2．權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中V—α鏈C端通過(guò)肽連接序列與V—β鏈N端共價(jià)連接。
3．權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中V—β鏈C端通過(guò)肽連接序列與V—α鏈N端共價(jià)連接。
4．權(quán)利要求2的可溶性融合蛋白，其中還包含共價(jià)連接于V—β鏈C端與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或片段的N端之間的C—β鏈或片段。
5．權(quán)利要求2的可溶性融合蛋白，其中還包含共價(jià)連接于V—α鏈C端與肽連接序列N端之間的C—α鏈或片段。
6．權(quán)利要求4的可溶性融合蛋白，其中還包含共價(jià)連接于V—α鏈C端與肽連接序列N端之間的C—α鏈或片段。
7．權(quán)利要求6的可溶性融合蛋白，其中C—α鏈片段長(zhǎng)約5—90個(gè)氨基酸。
8．權(quán)利要求6的可溶性融合蛋白，其中C—β鏈片段長(zhǎng)約50—126個(gè)氨基酸。
9．權(quán)利要求6的可溶性融合蛋白，其中肽連接序列長(zhǎng)約2—25個(gè)氨基酸。
10．權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)為Cκ鏈或Cκ鏈片段。
11．權(quán)利要求10的可溶性融合蛋白，其中Cκ鏈片段長(zhǎng)約90—110個(gè)氨基酸。
12．含有依次共價(jià)連接的以下部分的可溶性融合蛋白1)V—α鏈，2)肽連接序列，3)V—β鏈，4)C—β鏈片段，以及5)Cκ鏈、Cλ鏈或它們的片段之一。
13．權(quán)利要求12的可溶性融合蛋白，其中還包含共價(jià)連接于V—α鏈和肽連接序列之間的C—α鏈或片段。
14．權(quán)利要求12的可溶性融合蛋白，其中還包含共價(jià)連接于該可溶性融合蛋白上的至少一個(gè)蛋白標(biāo)記。
15．權(quán)利要求14的可溶性融合蛋白，其中還包含共價(jià)連接于C—β鏈片段和Cκ鏈、Cλ鏈或它們的片段之間的蛋白標(biāo)記。
16．通過(guò)使權(quán)利要求15的可溶性融合蛋白與能切割該蛋白標(biāo)記的試劑接觸而產(chǎn)生的單鏈T細(xì)胞受體。
17．權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中V—α鏈和V—β鏈與細(xì)胞毒性T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體V鏈有至少90％相同。
18．權(quán)利要求16的單鏈T細(xì)胞受體，其中該單鏈T細(xì)胞受體的V區(qū)已人源化。
19．權(quán)利要求18的單鏈T細(xì)胞受體，其中該單鏈T細(xì)胞受體的C區(qū)已人源化。
20．含有依次共價(jià)連接的以下部分的單鏈T細(xì)胞受體1)V—α鏈，2)C—α鏈或其片段，3)肽連接序列，4)V—β鏈，和5)C—β鏈或其片段。
21．權(quán)利要求12的可溶性融合蛋白，其中還包括共價(jià)連接的效應(yīng)物分子。
22．權(quán)利要求21的可溶性融合蛋白，其中該效應(yīng)物分子為細(xì)胞毒素或適于診斷或成像研究的可檢測(cè)性標(biāo)記的分子。
23．包含共價(jià)連接之兩序列的DNA區(qū)段，第一序列編碼單鏈T細(xì)胞受體，該單鏈T細(xì)胞受體包含由肽連接序列共價(jià)連接的V—α鏈和V—β鏈，第二序列編碼Cκ鏈、Cλ鏈或它們的片段，其中該DNA區(qū)段還包含啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)及與第一序列可操作連接的前導(dǎo)序列。
24．權(quán)利要求23的DNA區(qū)段，其中由第一序列編碼的單鏈T細(xì)胞受體包含V—α鏈C端由肽連接序列共價(jià)連接于V—β鏈N端。
25．權(quán)利要求23的DNA區(qū)段，其中由第一序列編碼的單鏈T細(xì)胞受體包含V—β鏈C端由肽連接序列共價(jià)連接于V—α鏈N端。
26．權(quán)利要求23的DNA區(qū)段，其中由第一序列編碼的單鏈T細(xì)胞受體還包含共價(jià)連接于V—β鏈C端和第二序列所編碼的Cκ鏈、Cλ鏈或其片段的N端之間的C—β鏈片段。
27．權(quán)利要求23的DNA區(qū)段，其中由第一序列編碼的單鏈T細(xì)胞受體還包含共價(jià)連接于V—α鏈C端和肽連接序列N端之間的C—α鏈片段。
28．包含可溶性融合蛋白編碼序列的DNA區(qū)段，該蛋白序列中包含依次共價(jià)連接的以下部分1)V—α鏈，2)肽連接序列，3)V—β鏈，4)C—β鏈片段，以及5)Cκ鏈、Cλ鏈或它們的片段之一。
29．權(quán)利要求28的DNA區(qū)段，其中還包含編碼位于V—α鏈和肽連接序列之間的C—α鏈片段的序列。
30．權(quán)利要求28的DNA區(qū)段，其中還包含編碼前導(dǎo)序列的序列、轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)及啟動(dòng)子。
31．權(quán)利要求30的DNA區(qū)段，其中還包含編碼一個(gè)或多個(gè)蛋白標(biāo)記的序列。
32．權(quán)利要求30的DNA區(qū)段，其中啟動(dòng)子為phoA，前導(dǎo)序列為大腸桿菌的pelB，其中該DNA區(qū)段還包含來(lái)自基因10序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
33．權(quán)利要求30的DNA區(qū)段，其中啟動(dòng)子為與巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子元件可操作連接的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，前導(dǎo)序列為小鼠κ鏈前導(dǎo)序列。
34．包含權(quán)利要求20或28的DNA區(qū)段的DNA載體。
35．對(duì)包含共價(jià)連接于單鏈T細(xì)胞受體上的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段的可溶性融合蛋白進(jìn)行分離的方法，該方法包括將包含該融合蛋白編碼序列的DNA載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在可使該融合蛋白表達(dá)的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，及從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化該融合蛋白以分離該可溶性融合蛋白。
36．權(quán)利要求35的方法，其中該方法還包括使宿主細(xì)胞或培養(yǎng)后基質(zhì)的提取物與能特異性結(jié)合該融合蛋白的抗體接觸。
37．分離可溶性單鏈T細(xì)胞受體的方法，該方法包括將包含可溶性單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白編碼序列的DNA載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述融合蛋白包含與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或片段共價(jià)連接的單鏈T細(xì)胞受體，在可使該可溶性單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白表達(dá)的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，和從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化該單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白；及將融合的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段與單鏈T細(xì)胞受體分開(kāi)，以分離該可溶性單鏈T細(xì)胞受體。
38．分離可溶性單鏈T細(xì)胞受體的方法，該方法包括將包含單鏈T細(xì)胞受體編碼序列的DNA載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在可使該單鏈T細(xì)胞受體表達(dá)的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)該哺乳動(dòng)物細(xì)胞，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化該單鏈T細(xì)胞受體以分離單鏈T細(xì)胞受體。
39．誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括將融合有免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段的單鏈T細(xì)胞受體以有效量施用于該哺乳動(dòng)物，其中該免疫應(yīng)答能使該哺乳動(dòng)物對(duì)致病性T細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體表位產(chǎn)生免疫。
40．抑制哺乳動(dòng)物內(nèi)T—細(xì)胞活化的方法，包括將融合有免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段的單鏈T細(xì)胞受體以有效量施用于該哺乳動(dòng)物。
41．可特異性結(jié)合T細(xì)胞受體之抗體的制備方法，該方法包括將融合有免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段的單鏈T細(xì)胞受體以有效量施用于哺乳動(dòng)物。
42．由權(quán)利要求41的方法制備的抗體。
43．對(duì)包含能特異性結(jié)合單鏈T細(xì)胞受體之配體的細(xì)胞進(jìn)行殺傷的方法，該方法包括提供包含有依次共價(jià)連接的以下部分的可溶性單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白1)V—α鏈，2)肽連接序列，3)V—β鏈，4)Cκ鏈、Cλ鏈或其片段之一，和5)效應(yīng)物分子，使該可溶性單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白與具有能特異性結(jié)合該單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白之配體的細(xì)胞進(jìn)行接觸；及由該單鏈T細(xì)胞受體融合蛋白殺死該細(xì)胞。
44．權(quán)利要求43的方法，其中該細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了完全可溶并有功能的單鏈T細(xì)胞受體蛋白。一方面,本發(fā)明涉及含有共價(jià)連接于單鏈T細(xì)胞受體上的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段的可溶性融合蛋白,其中該單鏈T細(xì)胞受體包含由肽連接序列共價(jià)連接的V－α鏈和V－β鏈。該單鏈T細(xì)胞受體蛋白具有多種用途,包括可用于篩選能表達(dá)目的MHC－肽復(fù)合體的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1279690SQ98811223
公開(kāi)日2001年1月10日 申請(qǐng)日期1998年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月2日
發(fā)明者J·A·魏旦茨, K·F·卡德, H·C·王 申請(qǐng)人:蘇諾爾分子公司