專利名稱：Hla-c基因分型dna微陣列芯片試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種臨床檢測用途的基因檢測試劑盒，尤其是涉及DNA微陣列芯片試劑盒，
該試劑盒能夠高通量、高效率、高特異性對HLA-C基因進(jìn)行分型檢測。
背景技術(shù)：
HLA(Human leukocyte antigen,人類白細(xì)胞抗原)是人類主要組織相容性系統(tǒng)。組織相容性 是指不同個體間進(jìn)行組織或器官移植時，供者和受者雙方接受的程度。供受者組織不相容引 起的反應(yīng)，被證實是一種免疫反應(yīng)，它是由細(xì)胞表面同種異型抗原誘導(dǎo)的，這個代表個體特 異性的抗原稱移植抗原或組織相容性抗原，其中起主要作用的抗原稱主要組織相容性系統(tǒng) (MHS)， HLA (人類白細(xì)胞抗原)就是人類的主要組織相容性系統(tǒng)。HLA基因復(fù)合體位于人 類第6號染色體6p21J區(qū)域，具有高度單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。 HLA存在多個基因座位， 其中HLA-C座位是影響移植排斥反應(yīng)的座位之一。SNPs是決定組織相容性的本質(zhì)因素，個 體之間的SNPs差異程度決定著相容性程度。HLA-C基因座位的SNPs主要集中在第二、三 外顯子上。根據(jù)SNPs的差異特點，可以進(jìn)行基因分型，將HLA-C基因座位分成不同的型別 和亞型，型別和亞型相同者，SNPs差異較小，相容性好，反之亦然。HLA基因分型技術(shù)廣 泛應(yīng)用于造血干細(xì)胞移植、器官移植、疾病關(guān)聯(lián)研究。
HLA-C基因分型方法是從90年代開始發(fā)展起來的，目前主要包括PCR-SSP (PCR-序列 特異性引物法)、PCR-SSOP (PCR-序列特異性寡核苷酸探針法)、SBT (測序法)、FCM (流 式法)方法。這些方法目前被西方國家的少數(shù)企業(yè)壟斷，我國處于空白狀態(tài)，完全依賴進(jìn)口。 同時，這些方法也存在一些技術(shù)問題，比如引物過多造成檢測錯誤、檢測通量過小等等。
DNA微陣列法是近幾年發(fā)展起來的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、 集約化、低成本、高準(zhǔn)確性等特點，是融微電子學(xué)、牛物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計算機(jī)科學(xué)為 一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。由于該技 術(shù)可以將極其大量的探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量的生物分子進(jìn)行檢測分 析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、低通量 等不足。而且，通過設(shè)計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的 應(yīng)用價值，如基因表達(dá)譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序 (Sequencing by hybridization, SBH)等，為"后基因組計劃"時期基因功能研究及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科
4學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將DNA微陣列技術(shù)應(yīng)用于HLA-C基因分型檢測，開發(fā)了一種新型的基 因分型檢測試劑盒。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是針對HLA-C基因座位的第二、三外顯子，設(shè)計一套特異性 寡核苷酸探針(表1)，采用自動點樣機(jī)器人，將探針印制在玻片的特定區(qū)域，制成高密度 DNA微陣列(芯片分為10個檢測區(qū)，可以檢測同時檢測IO個樣本)，再配以其它必要的組 份，包括PCR引物(表2)組成完整的試劑盒。實際檢測時，取10份人基因組DNA溶液， 采用CY3標(biāo)記引物和不對稱PCR方法，擴(kuò)增出人基因組HLA-C基因的第二、三外顯子單鏈 CY3標(biāo)記片段。取DNA微陣列芯片一張，分別加入10種PCR產(chǎn)物2ul和雜交液8ul。將芯 片放在自動雜交洗滌儀內(nèi)，設(shè)定雜交溫度52t:，雜交時間30分鐘，自動洗滌吹干。取出芯 片，砍入GenePix 41Q0A.掃描儀進(jìn)行掃描，使用分析軟件對掃描圖像信號進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換 處理，并分析產(chǎn)生樣本基因型別結(jié)果。
本試劑盒采用高密度DNA微陣列技術(shù)，可以大大提高檢測通量，每張芯片可以制備用 于檢測IO個樣本的DNA微陣列，是現(xiàn)有一般檢測技術(shù)的IO倍以上；同時，由于采用了國 產(chǎn)原材料，與同類進(jìn)口產(chǎn)品相比成本得到顯著降低。
本發(fā)明的試劑盒用于用于臨床移植配型和造血干細(xì)胞庫建立HLA-C基因分型檢測。
表l HLA-C基因分型寡核苷酸探針
名稱序列(5' -3')堿基數(shù)
ClGCGAGTCCAAGAGGGGA17
C2CGTGCAGTTCGACAGCG17
C3GCCGCGGGAGCCGTGGG17
C4GGGGAGCCCCGGGCGCC17
C5ACACAGAACTACMGCG17
C6CCGAGTGMCCTGCGGA17
C7CTGCGGAAACTGCGCGG17
C8AGGCACAGGCTGACCGA17
C9AACCAGAGCGAGGACG16
C10CCTCCAGAGGATGTTTG17
CllTCTCACATCATCCAGAG17
C12CCTCCAGAGGATGTACG17
5C13GCTGCGACGTGGGGCCC17
C14CTGGGGCCGGACGGGCG17
C15TGACCAGTCCGCCTACG17
C16TGACCAGTTAGCCTACG17
C17AACGAGGATCTGCGCTC17
C18GCGGACACGGCGGCTCA17
C19GCGGACMGGCGGCTCA17
C20GGCCCGTGCGGCGGAGC17
C21GCGCAAGTTGGAGGCGG17
C22GCCCTGAATGAGGACCT17
CNGAGTATTC GGATCGGGA17
'CP..GAGTATTGGGACCGGGA.17
CN, CP分別為陰性和陽性控制探針
表2引物序列
名稱 序列(5' -3') 堿基數(shù) 特異性
PIAGTGGGCTACGTGGACGACAC21特異性擴(kuò)增HLA-C第2外顯子
P2CGCTTGTACTTCTGTGTCTCC21
P3GACGGGCGCCTCCTCCGCGGG21特異性擴(kuò)增HLA-C第3外顯子
P4CTGCGGAGCCACTCCACGCAC21
本發(fā)明用下列實施例進(jìn)行解釋，目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。 以下結(jié)合


本發(fā)明的具體實施。

圖1 HLA-C基因分型DNA微陣列雜交區(qū)和探針微陣列示意圖
1、 2芯片外觀
3雜交區(qū)及探針矩陣
具體實施例方式
實施例一
方法1: HLA-C基因分型DNA微陣列PCR引物和寡核苷酸探針的設(shè)計和合成
為了采用特異性PCR擴(kuò)增HLA-C基因座位的第2、 3外顯子，分別在第2外顯子的始端和末端設(shè)計特異性引物P1、 P2，以及在第3外顯子開始和末端設(shè)計引物P3、 P4。合成、CY3標(biāo)記、純化。引物序列見表2。
針對HLA-C基因第2、 3外顯子基因序列的多態(tài)性，設(shè)計22種分型探針，序列見表1，合成、修飾、純化。
方法2: HLA-C基因分型DNA微陣列的制備
采用基因芯片自動點樣儀，將22種分型探針和兩種對照探針點制到玻片的特定區(qū)域，制成DNA微陣列。
(1) 點樣探針溶液-將探針稀釋到5XSSC、 0.05y。SDS溶液中，終濃度為30uM;
(2) 點樣矩陣(如圖1)將探針點制在玻片上，每個探針橫向重復(fù)3點點制在雜交區(qū)內(nèi)；雜交區(qū)分成10個。
實施例二采用HLA-C基因分型用DNA微陣列檢測臨床樣本HLA-C基因型別
'取IO份己知基因型別的DNA樣本，采用CY3標(biāo)記的PCR引物，上下游引物1:30 (分子數(shù)比)不對稱PCR方法，PCR循環(huán)參數(shù)為94°C 5，； 94°C 30",58。C 30",72。C 30",40個循環(huán)；72°C 5，。
取一張微陣列玻片，分別取10種PCR產(chǎn)物各2ul加到芯片的10孔，再在各孔加入雜交液(5xSSC) 8ul,芯片放到自動雜交洗滌儀的槽內(nèi)，設(shè)定雜交溫度52'C，雜交時間40分鐘。雜交后自動洗滌和風(fēng)干。
采用GnenPk4100A掃描儀，掃描雜交信號，得到雜交結(jié)果掃描圖，并將圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)。
采用分析軟件，將以上數(shù)據(jù)自動分析轉(zhuǎn)換成為各個樣本的基因型別，檢測結(jié)果與樣本原基因型別完全相符。見表3。
表3本次檢測結(jié)果與樣本原有基因型別的比較
原基因型別本次試驗結(jié)果
樣本編號是否相符
(HLA-C*)(HLA-O)
010303， 04010303， 0401是
020202， 15020202， 1502是
030304， 05010304， 0501是
040602， 070602， 07是
050602， 080602， 08是
0612， 140312， 1403是07 0401， 16 0401， 16 是
08 0501， 17 0501， 17 是
09 0102， 18 0102， 18 是
10 0302， 0602 0302， 0602 是
實施例說明了本發(fā)明產(chǎn)品在檢測通量方面的優(yōu)勢(一次檢測IO個樣本)和檢測準(zhǔn)確性方 面的可靠性(檢測結(jié)果與原樣本結(jié)果完全相符)。
8<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
<]20> HLA-C基因分型DNA微陣列芯片試劑盒
<140> <141> <160>28
<210> 1 <211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> ]
GCGAGTCCAAGAGGGGA
<210>2 <2"> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 2
CGTGCAGTTCGACAGCG
<210>3 <211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 3
GCCGCGGGAGCCGTGGG
<210>4 <211> 17 <212>DNA
<2i3>人:—i:序列
<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以川作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 4
GGGGAGCCCCGGGCGCC
9<2〗0> 5 <2U> 17 <2]2>DNA
<2i3>人工序列
<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 5
ACACAGAACTACAAGCG
<210>6 <211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 6
CCGAGTGAACCTGCGGA
<210> 7 <211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 7
CTGCGGAAACTGCGCGG
<210> 8 <211>]7 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 8
AGGCACAGGCTGACCGA
<210>9 <211>16 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 9
AACCAGAGCGAGGACG
<210> 10<211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>纟艮據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 10
CCTCCAGAGGATGTTTG
<210> 11 <21]> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 11
TCTCACATCATCCAGAG
<21.0> 12. <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400>2
CCTCCAGAGGATGTACG
<210> 13 <211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 13
GCTGCGACGTGGGGCCC
<210> 14 <211> 17 <212> DNA <2。>人.V.序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400>〗4
CTGGGGCCGGACGGGCG
<210> 15 <211> 17
11<212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 15
TGACCAGTCCGCCTACG
<210> 16
<2ii> n
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計， <400>16 ..
TGACCAGTTAGCCTACG
以用作芯片雜交反應(yīng)探針。
<2]0> 17 '<211>]7 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 17
AACGAGGATCTGCGCTC
<210> 18 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 18
GCGGACACGGCGGCTCA
<210> 19 <211〉 17 <212> DNA <213>人丁-序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 19
GCGGACAAGGCGGCTCA
<210>20 <211> 17 <212>DNA
12<213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 20
GGCCCGTGCGGCGGAGC
<210> 21 <211> 17 <2]2>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 21
GCGCAAGTTGGAGGCGG
<210> 22 <211> 17 <212>DNA . <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 22
GCCCTGAATGAGGACCT
<210> 23 <211>7 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 23
GAGTATTCGGATCGGGA
<2〗0> 24 <211> 17 <212>DNA <213>人丁.序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。 <400> 24
GAGTATTGGGACCGGGA
<210> 25 <211>21 <212> DNA
<2]3>人i:序列
13<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR引物。 <400> 25
AGTGGGCTACGTGGACGACAC
<210>26 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR引物。 <400> 26
CGCTTGTACTTCTGTGTCTCC
<210>27 <211>21 <212>DNA <213>人工序列. <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR引物。 <400> 27
GACGGGCGCCTCCTCCGCGGG
<210>28 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR弓I物。 <400> 28
CTGCGGAGCCACTCCACGCAC
權(quán)利要求
1、一種DNA微陣列芯片檢測試劑盒，用于對HLA-C基因進(jìn)行分型檢測，該試劑盒將22種寡核苷酸探針，點制在玻片上，制成DNA微陣列芯片，配以4種引物以及其它組分，其特征在于22種寡核苷酸探針的序列分別為C15’-GCGAGTCCAAGAGGGGA-3’C25’-CGTGCAGTTCGACAGCG-3’C35’-GCCGCGGGAGCCGTGGG-3’C45’-GGGGAGCCCCGGGCGCC-3’C55’-ACACAGAACTACAAGCG-3’C65’-CCGAGTGAACCTGCGGA-3’C75’-CTGCGGAAACTGCGCGG-3’C85’-AGGCACAGGCTGACCGA-3’C95’-AACCAGAGCGAGGACG-3’C105’-CCTCCAGAGGATGTTTG-3’C115’-TCTCACATCATCCAGAG-3’C125’-CCTCCAGAGGATGTACG-3’C135’-GCTGCGACGTGGGGCCC-3’C145’-CTGGGGCCGGACGGGCG-3’C155’-TGACCAGTCCGCCTACG-3’C165’-TGACCAGTTAGCCTACG-3’C175’-AACGAGGATCTGCGCTC-3’C185’-GCGGACACGGCGGCTCA-3’C195’-GCGGACAAGGCGGCTCA-3’C205’-GGCCCGTGCGGCGGAGC-3’C215’-GCGCAAGTTGGAGGCGG-3’C225’-GCCCTGAATGAGGACCT-3’。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA微陣列芯片檢測試劑盒，其特征還在于4種引物序列分別為: PI: AGTGGGCTACGTGGACGACACP2: 5'-CGCTTGTACTTCTGTGTCTCC-3， P3: 5'-GACGGGCGCCTCCTCCGCGGG-3， P4: 5,-CTGCGGAGCCACTCCACGCAC-3，。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的副A微陣列芯片檢測試劑盒，其特征還在于采用22種寡核苷酸探 針，點制在玻片上，制成DNA微陣列，用于與樣本PCR產(chǎn)物的雜交反應(yīng)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA微陣列芯片檢測試劑盒，其特征還在于試劑盒用于臨床移植配 型和造血干細(xì)胞庫進(jìn)行HLA-C基因分型檢測。.
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臨床檢測用途的基因檢測試劑盒，尤其是涉及DNA微陣列芯片試劑盒，該試劑盒能夠高通量、高效率、高特異性對人類白細(xì)胞抗原C(HLA-C)基因進(jìn)行分型檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101487043SQ200810025868
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者何蘊(yùn)韶, 帆 張, 明 李, 鋼 程, 胡守旺 申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司;廣州達(dá)泰生物工程技術(shù)有限公司