專利名稱：診斷和監(jiān)測(cè)惡性乳腺癌的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及唾液生物標(biāo)記在診斷乳腺癌方面的用途，更具體地是涉及唾液生物標(biāo)記在診斷性區(qū)分患乳腺癌婦女、患良性腫瘤婦女和健康婦女方面的用途。
乳腺癌是導(dǎo)致美國(guó)婦女死亡的第二大病因。大約每10名婦女中有一個(gè)在她的生命中會(huì)發(fā)生乳腺癌。最近的統(tǒng)計(jì)估計(jì)有44,000名婦女將死于乳腺癌，而在未來(lái)的一年中又會(huì)有150,000名婦女被診斷為乳腺癌。
已證實(shí)乳腺癌的普查能減少乳腺癌的死亡率。研究證明，在50歲及以上的婦女中，采用乳腺造影術(shù)和臨床乳腺檢查鑒定，婦女的乳腺癌死亡率可降低20％-40％。然而，在40-49歲的婦女中，死亡率只降低了13％-23％。這些結(jié)果表明更好的鑒定方法將有可能有助于降低更年輕一些的婦女中的死亡率。
盡管體檢和乳腺造影術(shù)是乳腺癌早期檢測(cè)有用的鑒定方法，但是這些方法可能產(chǎn)生相當(dāng)多的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，尤其對(duì)于乳腺實(shí)質(zhì)組織緊密的婦女更是如此。例如，在40-49歲的婦女中，乳腺造影術(shù)檢查假陰性的概率是20-25％，在50-69歲婦女中是10％。因此，這樣的鑒定將導(dǎo)致在大量陰性活組織檢查結(jié)果中產(chǎn)生高比例的假陽(yáng)性。同時(shí)也證明，在檢測(cè)較年輕婦女的癌癥方面，這些方法缺乏靈敏性，從而導(dǎo)致高比例的假陰性。
很明顯，對(duì)于日益增加的死亡率，需要有助于診斷較年輕婦女中癌癥的鑒定方法。在乳腺造影術(shù)領(lǐng)域，日益提高的技術(shù)已使較小的乳腺病的檢測(cè)更為可靠；然而，乳腺癌領(lǐng)域的研究人員在繼續(xù)尋找其它補(bǔ)充診斷方法以進(jìn)一步加強(qiáng)癌癥鑒定，并由此降低死亡率。
在過(guò)去的三十年中，癌癥研究人員已廣泛使用檢測(cè)特異生物標(biāo)記表達(dá)的免疫組織化學(xué)方法，這些生物標(biāo)記可在某些腫瘤的診斷中用作補(bǔ)充診斷方法。(Grizzle WE.Biomarkers-The NeW Frontier in thePathology of Invasive and Preinvasive Neoplasias. Biotechnic andHistochemistry，72(2)59-61，1997；Grixxle WE，Myers RB，Manne U.TheUse of Biomarker Expression to Characterize Neoplastic Processes.Biotechnic and Histochemistry72(2)96-104，1997.)一些腫瘤標(biāo)記如c-erbB-2(erb)和組織蛋白酶-D(CD)已在組織中檢測(cè)到并表明與擴(kuò)散性病變有關(guān)。已進(jìn)行的大部分研究已使用組織和血清中的這些標(biāo)記。
至于唾液中的特異癌抗原，Chien發(fā)現(xiàn)，唾液中含有CA125，一種卵巢上皮腫瘤被公認(rèn)或接受的腫瘤標(biāo)記。(Chien DX，SchWartz PE，CA125Assays for Detecting Malignant Ovarian Tumors. Obstetrics andGynecology，75(4)701-704，1990).在比較健康對(duì)照、患良性病癥婦女和患卵巢癌婦女中的唾液CA125濃度時(shí)，Chien發(fā)現(xiàn)，與非惡性對(duì)照相比，卵巢癌組中的CA125濃度明顯更高。Boyle使用放射性標(biāo)記的寡核苷酸在患頭頸鱗狀細(xì)胞癌的個(gè)體的手術(shù)前唾液樣品中檢測(cè)并鑒定了腫瘤特異性突變，這些發(fā)現(xiàn)在所研究的71％的病人中得到證明。(Boyle JO，Mao L，Brennan JA，Koch WM，Eisele DW， Saunders JR，Sidransky D.GeneMutations in Saliva as Molecular Markers for Head and Neck SquamousCell Carcinomas.Am J Surgery.168(5)429-32，1994.)發(fā)明概述然而，這樣的抗原不能用于診斷乳腺癌，并且沒有測(cè)試前述生物標(biāo)記(例如CA125，erb和CD)在唾液中的存在。盡管現(xiàn)有技術(shù)的診斷方法已得到廣泛改進(jìn)，但是這些改進(jìn)沒有擴(kuò)展到所有診斷領(lǐng)域。因此，需要一種方法以更充分地利用最新技術(shù)進(jìn)步并將這些技術(shù)用于乳腺癌的檢測(cè)和治療。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是使用唾液作為診斷介質(zhì)并且/或者作為非創(chuàng)傷性方法的一部分來(lái)檢測(cè)和差別診斷乳腺癌，由此克服了包括上述那些方法的現(xiàn)有技術(shù)的各種不足和缺陷。
本發(fā)明的另一目的是鑒定一種或更多種唾液中存在的生物標(biāo)記，這些生物標(biāo)記具有診斷價(jià)值并且/或者可用于治療后的監(jiān)測(cè)或治療。同時(shí)，另一目的是提供一種或更多種生物標(biāo)記作為最初檢測(cè)的診斷系列的一部分，繼續(xù)鑒定以檢測(cè)婦女在接受疾病化療和/或外科手術(shù)治療之后乳腺癌的復(fù)發(fā)。
本發(fā)明的另一目的是確定用于最初檢測(cè)的生物標(biāo)記的一個(gè)或更多個(gè)適當(dāng)?shù)臐舛葏^(qū)分值(cut-off values)，繼續(xù)鑒定以檢測(cè)婦女在接受疾病化療和/或外科手術(shù)治療之后乳腺癌的復(fù)發(fā)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種使用診斷性生物標(biāo)記的血清和唾液區(qū)分濃度以比較檢測(cè)率和/或靈敏度的方法。同時(shí)，本發(fā)明的另一目的是提供一種采用受者操作曲線(receiver operator curves)及相關(guān)分析以測(cè)定對(duì)檢測(cè)和/或治療乳腺癌有診斷價(jià)值的一系列唾液生物標(biāo)記的區(qū)分濃度的方法。
本發(fā)明的另一目的是使用唾液作為介質(zhì)測(cè)定已診斷患乳腺癌的病人的結(jié)節(jié)狀態(tài)(nodal status)。同時(shí)，本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是在測(cè)定結(jié)節(jié)狀態(tài)時(shí)鑒定唾液中存在的一種或更多種生物標(biāo)記。
本發(fā)明的另一目的是使用唾液測(cè)定其中存在的生物標(biāo)記的受體狀態(tài)以作為差別診斷乳腺癌的一部分。同時(shí)，本發(fā)明也可包括一種使用唾液中存在的生物標(biāo)記的受體狀態(tài)作為腫瘤擴(kuò)散性的指示標(biāo)記的方法。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該理解本發(fā)明的一個(gè)或更多方面將達(dá)到某些目的，而一個(gè)或更多其它方面能達(dá)到某些其它目的。每一目的不會(huì)在所有情況下均勻地適用于本發(fā)明的每一方面。因此，考慮到與乳腺癌診斷有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，這些目的可看作與本發(fā)明任一方面有關(guān)的替代方案。
本發(fā)明的其它目的、特征、益處和優(yōu)點(diǎn)在此概述以及下面本發(fā)明的實(shí)施例中是顯而易見，并且對(duì)于具有癌生物標(biāo)記的性質(zhì)和檢測(cè)及其在診斷相關(guān)疾病中的用途的知識(shí)的本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，也將是非常顯而易見的。這些目的、特征、益處和優(yōu)點(diǎn)在上述內(nèi)容中并結(jié)合相關(guān)實(shí)施例、表格、數(shù)據(jù)和所有由此得出的合理推論而顯而易見。
部分地看，本發(fā)明是一種使用唾液生物標(biāo)記以差別診斷和/或檢測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)的方法。方法包括(1)使用人唾液樣品以提供該個(gè)體的可診斷乳腺癌的唾液生物標(biāo)記，(2)將該個(gè)體的生物標(biāo)記與生物標(biāo)記參照對(duì)比，并且(3)通過(guò)生物標(biāo)記對(duì)比差別鑒定所顯示的個(gè)體診斷。生物標(biāo)記參照可由一組成分組成并且可以用惡性腫瘤，良性腫瘤和對(duì)照組人群制備。每一參照成分可結(jié)合與相應(yīng)的個(gè)體生物標(biāo)記相當(dāng)?shù)囊幌盗袛?shù)值使用。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，個(gè)體生物標(biāo)記是生物標(biāo)記組的一個(gè)成分，并且參照組包含經(jīng)鑒定具有診斷價(jià)值的一個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)記。這樣的生物標(biāo)記可以包含癌抗原15-3、腫瘤抑制劑癌基因蛋白53和癌基因c-erbB-2。在本發(fā)明方法高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌基因c-erbB-2的存在和/或蛋白表達(dá)的增加可鑒定一個(gè)個(gè)體患有惡性腫瘤。
每一個(gè)個(gè)體生物標(biāo)記成分可與濃度值相結(jié)合以與相應(yīng)參照成分相比較。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，患惡性乳腺腫瘤個(gè)體的癌抗原15-3的濃度比患良性腫瘤個(gè)體的相應(yīng)濃度高至少100％。同時(shí)，在優(yōu)選的方法中，患惡性乳腺腫瘤個(gè)體的癌基因53的濃度比患良性腫瘤個(gè)體低至少約25％。這樣的差別鑒定可以單獨(dú)使用或與一種或更多種測(cè)試和檢測(cè)乳腺癌的診斷方法結(jié)合使用。
部分地看，本發(fā)明是一種手術(shù)后監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)的方法。方法包括提供摘除惡性腫瘤手術(shù)后的個(gè)體，使用來(lái)自該個(gè)體的唾液樣品制備手術(shù)后生物標(biāo)記組；將該個(gè)體的手術(shù)后生物標(biāo)記組與手術(shù)前生物標(biāo)記參照組對(duì)比，并且通過(guò)監(jiān)測(cè)相關(guān)生物標(biāo)記組中的至少一種成分來(lái)鑒定惡性腫瘤的存在。
通常，在此方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體進(jìn)行手術(shù)后化療。化療可以包括但不限于環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶治療方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)生物標(biāo)記組都包含c-erbB-2成分，手術(shù)后這一成分的測(cè)定表明腫瘤的復(fù)發(fā)。選擇性地，兩個(gè)生物標(biāo)記組都可以包含腫瘤抑制劑癌基因蛋白53成分。手術(shù)后這一成分的缺少表明腫瘤抑制作用。
部分地看，本發(fā)明是一種利用內(nèi)源編碼蛋白濃度以診斷乳腺癌的方法。方法包括使用來(lái)自一個(gè)個(gè)體的唾液樣品以提供可診斷乳腺癌的蛋白生物標(biāo)記，將該個(gè)體蛋白生物標(biāo)記與參照蛋白對(duì)比，并且通過(guò)測(cè)定該個(gè)體蛋白生物標(biāo)記的濃度高于參照蛋白來(lái)診斷該個(gè)體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物標(biāo)記蛋白組是生物標(biāo)記組的一個(gè)成分。同樣，參照蛋白可以是參照組的一個(gè)成分。不管怎樣，可以使用惡性腫瘤、良性腫瘤和對(duì)照組人群制備任何這樣的蛋白作為參照。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，單個(gè)蛋白生物標(biāo)記是癌抗原15-3或選擇性地，癌基因c-erbB-2的表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明的生物標(biāo)記可以包含已經(jīng)或可以得到生物化學(xué)、生理學(xué)或結(jié)構(gòu)鑒定的由任何癌基因物質(zhì)編碼的蛋白表達(dá)產(chǎn)物、其片斷或生物衍生物、或其配體或抗體。
例如，CA15-3已鑒定為粘質(zhì)糖蛋白并證明為診斷指示劑。更具體性地，CA15-3是由命名為Mab D11-5和Mab DF3的兩個(gè)單克隆抗體識(shí)別的癌相關(guān)抗原。Mab D11-5是針對(duì)人乳汁脂肪珠膜的抗原制備的，而MabDF3是針對(duì)來(lái)自人乳腺癌的膜碎片制備的。
已觀察到，在一些腫瘤中高水平存在能將細(xì)胞轉(zhuǎn)化成惡性的c-erbB-2癌基因(也稱為HER-2/neu)。[Zhou et al.，Cancer Research，476123(1987)；Berger et al.，Cancer Research，481238(1988)；Kraus etal.，The EMBO Journal，6(3)605(1987)；and Slamon et al.，Science，235177(1987)]。c-erbB-2癌基因的表達(dá)及其在細(xì)胞內(nèi)膜中的定位看來(lái)與癌癥緊密相關(guān)[Kraus et al.，id；Slamon et al.，id；Drebin et al.，Cell，41695(1985)；and Di Fiore et al.，Science，237178(1987)]；實(shí)際上，至少在某些病例中，它可能是癌發(fā)展過(guò)程中的最初事件[Muller et al，Cell，54105(1988)]。c-erbB-2蛋白在正常細(xì)胞上的過(guò)量表達(dá)看來(lái)導(dǎo)致這些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為或成為腫瘤細(xì)胞。
當(dāng)然，可以在緊鄰病癥的地方找到這樣的轉(zhuǎn)化的證據(jù)。然而診斷應(yīng)用的許多方面的基礎(chǔ)是一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即過(guò)量表達(dá)c-erbB-2的細(xì)胞將c-erbB-2外結(jié)構(gòu)域插入鄰近組織。c-erbB-2的衍生物也在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的表達(dá)細(xì)胞的血清中發(fā)現(xiàn)。
已鑒定一種分子量為約75千道爾頓(kd)的糖蛋白構(gòu)成了約185kd糖蛋白(gp185)即c-erbB-2的外結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)“gp75”已由其核苷酸和氨基酸序列精確定義；gp75外結(jié)構(gòu)域包括從大約氨基酸數(shù)22(絲氨酸；ser-22)到大約氨基酸數(shù)653(絲氨酸；ser-653)的區(qū)域及其相應(yīng)的核苷酸序列。氨基酸序列代表gb75的非糖基化形式，此形式預(yù)計(jì)具有與其相對(duì)應(yīng)的分子量。
gp75蛋白和多肽由gp75外結(jié)構(gòu)域DNA序列(編碼從約ser-22到約ser-653的核苷酸)編碼或由該gp75 DNA序列的片段編碼。因此短語(yǔ)“gp75蛋白和多肽”定義為包括具有與gp75蛋白和多肽基本上相同的氨基酸序列或其部分和/或基本上相同的生物功能的蛋白和/或多肽。
本發(fā)明表明，這樣的蛋白物質(zhì)，一旦在其它地方發(fā)現(xiàn)，也可以在唾液中得到鑒定并進(jìn)一定得到分析。例如在本文中其它地方所討論的，已經(jīng)在六個(gè)健康、年齡相當(dāng)?shù)膵D女中測(cè)定了癌基因HER-2/neu是否存在于刺激整體(Stimulated Whole，SWS)，腮腺(P2)，下頜下/舌下(S2)和/或小腺體(Minor，M2)的唾液分泌中。齒齦縫液體(GCF)也因其與唾液的關(guān)系得到測(cè)試。HER-2/neu分析通過(guò)ELISA進(jìn)行。分析HER-2/neu在血清中的濃度并與其在唾液中的濃度對(duì)比。分析表明，HER-2/neu存在于SWS(40.71單位/ml)，P2(15.71單/ml)和S2(14.08單位/ml)中，而在M2和GCF中僅以痕量存在。與腺分泌物相比，SWS產(chǎn)生最高水平的HER-2/neu。總的來(lái)看，正如所預(yù)計(jì)的，HER-2/neu的最高濃度出現(xiàn)在血清中。然而，當(dāng)用總蛋白對(duì)HER-2/neu的濃度進(jìn)行校正時(shí)，通過(guò)比較，更高濃度存在于P2分泌物中(72.78單位/ml)，并且SWS(34.01單位/ml)和S2(34.95單位/ml)中分泌的數(shù)量更少。
這樣的結(jié)果表明，蛋白HER-2/neu存在于唾液中并主要由腮腺轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果也表明，HER-2/neu可以從血清被動(dòng)擴(kuò)散到間質(zhì)組織，然后通過(guò)唾液分泌到口腔中。有關(guān)唾液成分和唾液分泌機(jī)理正在不斷增加的研究(見唾液分泌的腺體機(jī)理，Garrett等(1998)編輯(1999)及其中所引用的參考文獻(xiàn))正在證明本領(lǐng)域與血清和唾液蛋白有關(guān)的技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，除了本文描述的c-erbB-2蛋白，一些與乳腺癌或其它致癌疾病明顯相關(guān)的蛋白也已經(jīng)或可能以與上述c-erbB-2癌基因相似的方式得到分析或鑒定。正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員以及隨后了解本發(fā)明的人員所公知的，這些其它的明顯與疾病相關(guān)的蛋白表達(dá)，不論是否在在緊鄰病癥的地方得到鑒定或持續(xù)被發(fā)現(xiàn)，都可以在唾液中得到測(cè)定并且如本文所述的可以經(jīng)鑒定用作診斷相關(guān)疾病的唾液生物標(biāo)記。
生物標(biāo)記及其相關(guān)的本發(fā)明的方法可以用于檢測(cè)乳腺癌并提供一種經(jīng)濟(jì)有效的對(duì)乳腺造影術(shù)的補(bǔ)充診斷測(cè)試。而且，這些唾液生物標(biāo)記也可與內(nèi)科醫(yī)生和自我乳腺檢查相結(jié)合，有助于減少乳腺癌的發(fā)病率和死亡率，從而降低國(guó)家的健康醫(yī)療費(fèi)用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是健康對(duì)照、患良性病癥個(gè)體和患原位腫瘤個(gè)體的平均值的對(duì)比，比較了唾液和血清介質(zhì)＝erb對(duì)照(唾液)＜erb癌組(唾液)單向樣品測(cè)試方法t測(cè)試(平均值比恒量)t-值＝14.31，p-0.0001；＝erb對(duì)照(血清)＜erb癌組(血清)單向樣品t-測(cè)試(平均值比恒量)t-值＝10.33，p＜0.0001；#＝CA 15-3對(duì)照&良性(唾液)＜CA15-3癌組(唾液)Anova p＜0.05；##＝CA15-3對(duì)照&良性(血清)＜CA15-3癌組(血清)Anova p＜0.01。
圖2是各診斷情況下唾液和血清CA 15-3濃度(單位/mg蛋白)的表格對(duì)比。
圖3是各診斷情況下唾液和血清e(cuò)rb濃度(單位/mg蛋白)的表格對(duì)比。
圖4是各診斷情況下唾液和血清EGFR濃度(fmol/mg蛋白)的表格對(duì)比。
圖5是各診斷情況下唾液和血清總蛋白濃度(mg/ml)的表格對(duì)比。
圖6是各診斷情況下唾液和血清p53濃度(pmol/mg蛋白)的表格對(duì)比。
圖7是各診斷情況下唾液和血清CD濃度(pmol/mg蛋白)的表格對(duì)比。
圖8表示對(duì)各種血清和唾液erb特征分析的平均和標(biāo)準(zhǔn)誤差值。
圖9表示從所示研究組得到的調(diào)查數(shù)據(jù)，證明本發(fā)明的效用。
圖10表示惡性腫瘤階段測(cè)定的erb值。
圖11表示與本發(fā)明各種診斷方法相對(duì)應(yīng)的一系列erb和CA15-3濃度的區(qū)分值。
圖12a表示對(duì)照組、診斷患有良性病癥的實(shí)驗(yàn)組以及診斷患乳腺癌的實(shí)驗(yàn)組的唾液c-erbB-2(單位/ml)的圖示平均值，95％置信區(qū)間以及區(qū)分值(110單位/ml)。
圖12b表示對(duì)照組、診斷患有良性病癥的實(shí)驗(yàn)組以及診斷患有乳腺癌的實(shí)驗(yàn)組的唾液c-erbB-2(單位/mg蛋白)的圖示平均值，95％置信區(qū)間以及區(qū)分值(110單位/ml)。
圖13a表示對(duì)照組、診斷患有良性病癥的實(shí)驗(yàn)組以及診斷患乳腺癌的實(shí)驗(yàn)組的血清c-erbB-2(單位/ml)的圖示平均值，95％置信區(qū)間以及區(qū)分值(2000單位/ml)。
圖13b表示對(duì)照組、診斷患有良性病癥的實(shí)驗(yàn)組以及診斷患乳腺癌的實(shí)驗(yàn)組的血清c-erbB-2(單位/mg蛋白)的圖示平均值，95％置信區(qū)間以及區(qū)分值(50單位/ml)。
圖14a表示對(duì)照組、診斷患有良性病癥的實(shí)驗(yàn)組以及診斷患乳腺癌的實(shí)驗(yàn)組的唾液CA15-3(單位/ml)的圖示平均值，95％置信區(qū)間以及區(qū)分值(4.0單位/ml)。
圖14b表示對(duì)照組、診斷患有良性病癥的實(shí)驗(yàn)組以及診斷患乳腺癌的實(shí)驗(yàn)組的血清CA15-3(單位/ml)的圖示平均值，95％置信區(qū)間以及區(qū)分值(20單位/ml)。
圖15表示唾液c-erbB-2單位/ml(--)、唾液c-erbB-2單位/mg蛋白(...)和唾液CA15-3單位/ml(_.._)的受者操作特征(receiveroperating characteristic，ROC)曲線(靈敏度1-靈敏度)的圖示；每條曲線下的面積百分比如下c-erbB-2～76％，約110單位/ml的區(qū)分值；c-erbB-2/tp～77％，約100單位/mg蛋白的區(qū)分值；CA15-3～71％，約4單位/ml的區(qū)分值。
圖16圖示血清c-erbB-2單位/ml(--)、血清c-erbB-2單位/mg蛋白(...)和血清CA15-3單位/ml(_.._)的受者操作特征(ROC)曲線(靈敏度1-靈敏度)的圖示；每條曲線下的面積百分比如下c-erbB-2～77％，約2000單位/ml的區(qū)分值；c-erbB-2/tp～76％，約50單位/mg蛋白的區(qū)分值；CA15-3～71％，約20單位/ml的區(qū)分值。
本發(fā)明的實(shí)施例以下非限制性實(shí)施例和數(shù)據(jù)舉例說(shuō)明了與本發(fā)明方相關(guān)的各個(gè)方面和特征，包括由此得到的令人驚奇和出乎意料的結(jié)果。
對(duì)于下面的實(shí)施例和數(shù)據(jù)，研究對(duì)象群體由來(lái)自普通人群(對(duì)照)以及密西西比(Mississippi)大學(xué)醫(yī)療中心(UMMC)腫瘤學(xué)系和外科診所的21名婦女組成。將來(lái)自周圍社區(qū)的有乳腺腫塊的婦女送到UMMC檢查。對(duì)每個(gè)病人進(jìn)行徹底的體檢和乳腺癌鑒定。在臨床初診和接受任何治療之前從每位婦女身上收集唾液和血清樣品，之后的最終病理學(xué)診斷評(píng)估表明個(gè)體或者患有良性腫瘤，或者患有乳腺癌(原位)。調(diào)查者最初不了解這些研究對(duì)象的診斷結(jié)果，直至病理學(xué)家給出最后診斷結(jié)果并且病人接受進(jìn)一步治療。這些研究對(duì)象由各種族混合組成，年齡在30-80歲之間。
排除假陽(yáng)性結(jié)果。最初預(yù)計(jì)現(xiàn)在的方法會(huì)分別由于外在的身體和環(huán)境因素如雌激素水平和吸煙產(chǎn)生假陽(yáng)性。然而，已排除這樣的因素是導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的因素。也排除了種族、年齡、月經(jīng)情況、用藥情況和健康狀況是產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的因素。
如下所示，使用所提及的商用試劑盒及相關(guān)試劑、方法和/或技術(shù)進(jìn)行分析。來(lái)自Triton Diagnostics的試劑在市場(chǎng)上不再有售。來(lái)自CIS BioInternational的試劑盒特別有用并提供增強(qiáng)的靈敏性，對(duì)于erb標(biāo)記尤其如此。實(shí)施例1統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析使用SPSSTM統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。比較對(duì)照、良性腫瘤和乳腺癌的平均標(biāo)記值進(jìn)行以描述性分析。
不平衡數(shù)據(jù)差異的單向分析、一般線性模型方法用于比較患乳腺癌人群與非癌人群的平均值。使用一般線性模型擬出的多項(xiàng)式很容易解釋說(shuō)明并適用于所有的樣品規(guī)模，包括那些太小的樣品，以維持適當(dāng)?shù)亩嘣治?。圖基因果分析(Tukey post-hoc analysis)用于重要的線性模型。
考慮到對(duì)照和良性病癥中未能測(cè)到唾液和血清中的erb，進(jìn)行了單向樣品t-測(cè)試。由于樣品規(guī)模小，關(guān)于標(biāo)記組特異性和靈敏度的問題沒有涉及，但將會(huì)在以后的研究中探討。實(shí)施例2樣品收集刺激整體的唾液樣品使用一小塊石蠟作為刺激劑收集5分鐘時(shí)間(Navasesh，1982)17。唾液流速由重量分析測(cè)定。所有樣品都在早晨收集，因此控制了任何生理節(jié)奏可能對(duì)標(biāo)記濃度產(chǎn)生的影響。將樣品冷凍用于進(jìn)一步分析。在收集唾液的同時(shí)由抽血者抽取血液。在收集樣品時(shí)沒有參加者顯出口腔中有癌癥或癌癥前期病癥。
將冷凍的唾液樣品化凍并于500-1500G離心20分鐘以沉淀細(xì)胞和粘液素以便提取生物標(biāo)記蛋白。對(duì)澄清的唾液抽提液和來(lái)自血液樣品的血清進(jìn)行總蛋白和生物標(biāo)記組分析。實(shí)施例3總蛋白使用比色分析法測(cè)定總蛋白濃度，此方法基于拷馬斯亮藍(lán)G-250染料隨不同蛋白濃度發(fā)生的顏色變化(Bio-Rod試劑盒)。在分光光度計(jì)上于595nm測(cè)量吸光率。從用牛γ-球蛋白標(biāo)準(zhǔn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定樣品的總蛋白濃度。實(shí)施例4CA15-3CA15-3分析使用EIA試劑盒(CIS Bio International)測(cè)定。CA15-3分析是雙位點(diǎn)固相酶免疫分析。將CA15-3分子連接在兩個(gè)單克隆抗體之間，第一個(gè)單克隆抗體與ELISA固相結(jié)合，第二個(gè)抗體與辣根過(guò)氧化酶連接(酶共軛物)。洗滌后，酶反應(yīng)產(chǎn)生與分析中存在的CA 15-3量成正比的顏色。使用分光光度計(jì)于490nm讀取吸光率并從用已知濃度配體繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。將CA15-3分析用于分析血清樣品。以唾液上清替代血清進(jìn)行唾液CA15-3測(cè)定。用于測(cè)試的抗體不與其它已知腫瘤標(biāo)記(CEA，CA19-9CA125)發(fā)生交叉反應(yīng)，并且唾液濃度大大高于分析所需的檢測(cè)較低限度。CA15-3濃度以單位/mg蛋白表示。實(shí)施例5erb和泛嗜p53erb和泛嗜p53分析使用ELISA試劑盒測(cè)定(OncogeneResearch，Co.)。在此研究中，以血清和唾液上清代替組織抽提液作為分析樣品。對(duì)結(jié)合水平進(jìn)行比色測(cè)定，并且由酶反應(yīng)形成的顏色強(qiáng)度與存在的靶蛋白成正比。在微量滴定板分光光度計(jì)中于490nm讀取吸光率并從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算配體濃度。erb和泛嗜p53的數(shù)據(jù)分別表示為單位/mg蛋白和pmol/mg蛋白。用于測(cè)試的抗體不與其它已知腫瘤標(biāo)記發(fā)生交叉反應(yīng)并且唾液濃度大大高于分析所需的檢測(cè)較低濃度。實(shí)施例6組織蛋白酶-D分析使用酶免疫分析(EIA)試劑盒(Triton Diagnostics，Inc.)。將對(duì)CD特異的一種單克隆抗體和一種多克隆抗體與唾液和血清樣品同時(shí)溫育。溫育過(guò)程中，存在于唾液和血清樣品中的CD與兩種抗CD抗體結(jié)合。單克隆抗體與生物素結(jié)合，引起形成的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合到抗生物素蛋白鏈霉素覆蓋的試管上。洗滌試管以去除未結(jié)合的物質(zhì)。在第二次溫育中，將與辣根過(guò)氧化酶共軛結(jié)合的抗-兔抗體加入試管。然后共軛物結(jié)合到復(fù)合物上。通過(guò)第二次洗滌去除未結(jié)合的復(fù)合物。然后將試管與TMB底物溶液一起溫育以顯色。然后加入磷酸終止酶反應(yīng)。使用分光光度計(jì)于450nm測(cè)定顯出的顏色強(qiáng)度。樣品值從曲線確定(pmol/mg蛋白)，曲線通過(guò)對(duì)針對(duì)已知濃度的對(duì)照的吸光率值繪圖得到。實(shí)施例7表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)EGFR分析使用EIA試劑盒(Triton Diagnostics，Inc.)測(cè)定。將抗-EGFR共軛物與唾液和血清樣品一起溫育。溫育過(guò)程中，EGFR蛋白與抗-EGFR共軛物結(jié)合。單克隆抗體之一與辣根過(guò)氧化酶結(jié)合。在第二次溫育過(guò)程中，所得免疫復(fù)合物通過(guò)“連接溶液”結(jié)合到涂覆的聚苯乙烯試管上。輕倒去除未結(jié)合物質(zhì)。然后將試管與TMB底物溶液一起溫育以顯色。然后加入磷酸終止酶反應(yīng)。使用分光光度計(jì)于450nm測(cè)定顯出的顏色強(qiáng)度。樣品值從曲線確定(fmol/mg蛋白)，曲線通過(guò)對(duì)針對(duì)已知濃度的對(duì)照的吸光率值繪圖得到。
對(duì)于所有免疫分析的功能，它們都易受到各種干擾。研究者進(jìn)行了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試以控制這些問題。對(duì)于配體回收，研究者能夠確定從唾液和血清樣品中回收的標(biāo)記(配體)的量。五個(gè)已知標(biāo)記含量的唾液和血清樣品被連續(xù)稀釋。所有稀釋液中的三種標(biāo)記。針對(duì)預(yù)期值對(duì)數(shù)據(jù)繪圖以測(cè)定稀釋液的線性度。劑量反應(yīng)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之間沒有顯著差異，并且截距與零點(diǎn)之間也沒有顯著差異。在樣品分析過(guò)程中，研究者對(duì)所有標(biāo)記的分析使用了適當(dāng)?shù)年?yáng)性和陰性對(duì)照。進(jìn)行分析時(shí)，一些測(cè)試樣品含有與過(guò)量配體預(yù)保溫的初級(jí)抗體以控制假陰性。另外，將測(cè)試樣品與過(guò)量的自由初級(jí)抗體一起預(yù)保溫以確定是否信號(hào)已被去除。這些額外測(cè)試在樣品分析過(guò)程中提供了額外的質(zhì)量保證。分析時(shí)，所有樣品一式三份重復(fù)進(jìn)行。
對(duì)照組由15名婦女組成(年齡42.4歲)，良性腫瘤組由8名婦女組成(年齡45.3歲)，而乳腺癌組由12名婦女組成(年齡49歲)。診斷患有良性病癥的研究對(duì)象由患纖維腺瘤(n＝4)、脂肪瘤(n＝1)和纖維瘤(n＝3)的婦女組成。患乳腺癌的婦女診斷患有小葉癌(n＝1)、滲透性導(dǎo)管癌(n＝9)和原位導(dǎo)管癌(n＝2)。所有患乳腺癌的研究對(duì)象為結(jié)節(jié)(node)陰性并且沒有轉(zhuǎn)移的跡象。在癌癥組中的五位癌癥研究對(duì)象是缺齒的，而非癌組中只有2人是缺齒的。其它所有研究對(duì)象都是有齒的。三組的平均值在圖1中表示，并且在圖2-7中圖示說(shuō)明。
如圖1和2中所示，對(duì)照和良性病癥組之中CA15-3的平均值比癌癥組的平均值低約45-50％。統(tǒng)計(jì)顯著度對(duì)于唾液在p＜0.05水平，對(duì)于血清在p＜0.01水平。
參照?qǐng)D1和3，沒有在對(duì)照或良性病癥組的唾液或血清中檢測(cè)到erb。相反，癌癥組表現(xiàn)出erb的存在，并且t-測(cè)試表明顯著更高的濃度(p＜0.001)。
另外，與癌癥組相比，對(duì)照和良性病癥組中p53的水平約高25％。(圖1和6)。由于p53突變反映癌基因的失效，引起腫瘤抑制，研究者預(yù)計(jì)，與患乳腺癌的那些婦女相比，對(duì)照中的p53值會(huì)更高。如隨后附圖中所示，當(dāng)交叉比較三組婦女時(shí)，CD和EGFR的唾液和血清水平?jīng)]有表現(xiàn)出象CA 15-3、erb和p53一樣的腫瘤特異性。實(shí)施例8a對(duì)于唾液中標(biāo)記組的存在，也著手解決了幾個(gè)技術(shù)問題。其中一個(gè)問題是確定來(lái)自口腔上皮的細(xì)胞是否可能與唾液中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記水平有關(guān)。為解決這個(gè)問題，將唾液樣品離心并將上清與沉淀分離。將取自上清的樣品置于玻片上，染色并顯微檢驗(yàn)細(xì)胞的存在。檢驗(yàn)表明，上清中沒有細(xì)胞。接著，將沉淀懸浮于磷酸緩沖鹽水中。分析上清和懸浮的沉淀中是否存在生物標(biāo)記。結(jié)果表明了上清中生物標(biāo)記的水平，但懸浮的沉淀中沒有生物標(biāo)記，說(shuō)明生物標(biāo)記來(lái)源于唾液而不是來(lái)自細(xì)胞。實(shí)施例8b使用分泌性IgA(slgA)作為對(duì)照蛋白進(jìn)行第二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以比較患和不患乳腺癌的個(gè)體。slgA是唾液中主要的免疫球蛋白，它來(lái)自唾液腺，其中腮腺是主要的合成腺。此抗體由存在于大小唾液腺中的免疫細(xì)胞合成，為IgA二聚體。因?yàn)槠錅p緩病原襲擊的作用，slgA被認(rèn)為是口腔的第一道防線。此唾液蛋白與乳腺癌無(wú)關(guān)并被選作為對(duì)照蛋白。使用ELISA方法，檢測(cè)來(lái)自癌和非癌組的唾液中的SlgA。此檢測(cè)的結(jié)果表明，患癌(χ11.7ng/ml)與不患癌(χ14.3ng/ml)的個(gè)體之間沒有顯著差異，說(shuō)明只有表現(xiàn)增加的那些蛋白才是與乳腺癌相關(guān)的那些標(biāo)記。實(shí)施例8c進(jìn)行第三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以確定口腔健康對(duì)標(biāo)記水平的影響。將患牙周病的少量個(gè)體與健康對(duì)照和幾名缺齒的研究對(duì)象對(duì)比。結(jié)果表明，患牙周病的個(gè)體、口腔健康的個(gè)體與缺齒的個(gè)體之間沒有顯著差異。實(shí)施例8d進(jìn)行第四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以確定月經(jīng)周期對(duì)唾液標(biāo)記水平的影響。收集兩名月經(jīng)正常的健康婦女的唾液樣品，從她們?cè)陆?jīng)周期開始到結(jié)束止每天收集。結(jié)果表明在月經(jīng)周期期間，唾液標(biāo)記的濃度沒有明顯波動(dòng)。標(biāo)記濃度在30天期間保持相對(duì)穩(wěn)定，證明了最小程度的個(gè)體差異(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例8e進(jìn)行另一實(shí)驗(yàn)以確定唾液腺成分的來(lái)源。收集腮腺、下頜下腺、舌下腺及其它小腺體的分泌物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些標(biāo)記主要由腮腺分泌。發(fā)現(xiàn)腮腺分泌物的濃度比下頜下腺和舌下腺的濃度許多倍。其它小腺的影響幾乎不能測(cè)定。另外，標(biāo)記濃度看來(lái)與流速無(wú)關(guān)。
如上所述，可測(cè)水平的乳腺癌標(biāo)記CA15-3、erb、EGFR、CD和p53存在于患惡性乳腺病的婦女的唾液和血清中。這些標(biāo)記也可在患良性乳腺病的婦女和完全健康的個(gè)體的唾液和血清中測(cè)到。這些結(jié)果表明，與患乳腺癌的個(gè)體相比，非癌個(gè)體中的CA15-3和erb水平更低(圖1)。而p53則相反。
也考慮到并解決了幾個(gè)可能的混淆因素。因此，可以確定1)來(lái)自口腔上皮的細(xì)胞與標(biāo)記無(wú)關(guān)，2)使用slgA作為對(duì)照蛋白，只有增加的那些蛋白才是與乳腺癌相關(guān)的那些標(biāo)記，3)牙周病的存在與標(biāo)記的水平無(wú)關(guān)，4)月經(jīng)周期對(duì)唾液標(biāo)記的水平?jīng)]有影響，5)標(biāo)記主要從腮腺分泌出來(lái)，以及6)標(biāo)記與流速無(wú)關(guān)。
相似的研究包括三組婦女I組是對(duì)照組。這一組由來(lái)自密西西比大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(VMMC)的無(wú)癥狀個(gè)體組成，對(duì)照組的健康狀況通過(guò)調(diào)查確定。
II組(良性腫瘤組)和III組(惡性腫瘤組)由來(lái)自周圍社區(qū)并送由UMMC腫瘤學(xué)系內(nèi)科醫(yī)生鑒定的有乳腺腫塊的連續(xù)個(gè)體組成。每名病人都接受了徹底的體檢和乳腺癌鑒定。在最初臨床約見和接受任何治療之前從每位婦女身上收集唾液和血清樣品。得自病理學(xué)報(bào)告的最終診斷評(píng)估確定該個(gè)體是應(yīng)該分到II組(良性腫瘤組)還是分到III組(診斷患有乳腺癌的組)。根據(jù)由美國(guó)聯(lián)合癌癥委員會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定病期和結(jié)節(jié)狀態(tài)。
在簽署IRB許可的同意書時(shí)，對(duì)所有參加者進(jìn)行簡(jiǎn)要調(diào)查。這些數(shù)據(jù)由面試者收集并包括涉及年齡、種族、吸煙狀況、用藥史和病史以及月經(jīng)狀況的信息。
與上述方法和/或?qū)嵤├嗨疲碳ふw唾液樣品使用一小塊樹脂作為刺激劑、按照標(biāo)準(zhǔn)化收集方法收集5分鐘時(shí)間。收集后，分裝并冷凍樣以用于分析。唾液流速由重量分析測(cè)定。所有樣品都在早晨收集，由此控制任何生理節(jié)奏可能對(duì)標(biāo)記濃度產(chǎn)生的影響。在收集唾液的同時(shí)，由抽血者抽取血液。
將冷凍的樣品化凍，并分析唾液和來(lái)自血液樣品的血清中的總蛋白和c-erbB-2的濃度。
同時(shí)分析樣品中的CA15-3。CA15-3作為診斷標(biāo)記的作用在文獻(xiàn)中已有記載并用作參照標(biāo)記或“診斷金標(biāo)準(zhǔn)”，通過(guò)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)比較c-erbB-2標(biāo)記的效力。
使用二辛可寧酸方法(Pierce Chemical，Co.)對(duì)唾液樣品進(jìn)行蛋白分析，二辛可寧酸是對(duì)亞銅離子高度敏感和高選擇性的檢測(cè)試劑。此方法測(cè)定0.5-20mg/ml的蛋白濃度。在此分析中，二辛可寧酸作為Cu+1的螯合劑，在蛋白存在的情況下形成有色螯合物。將小份唾液(100μl)滴于微量滴定板中并向加樣孔加入pierce BCS蛋白分析試劑。樣品于37℃保溫30分鐘并在微量滴定板分光光度計(jì)中于562nm讀取光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出每一物質(zhì)的最終濃度，并且數(shù)據(jù)以mg/ml表示。
使用來(lái)自O(shè)ncogene Research Products的ELISA試劑盒分析血清和唾液胞外結(jié)構(gòu)域c-erbB-2抗原的水平。以全唾液代替血清作為分析樣品。基本分析包括所進(jìn)行的結(jié)合水平的比色分析，并且酶反應(yīng)形成的顏色強(qiáng)度與存在的靶蛋白成正比。在微量滴定板分光光度計(jì)中于490nm讀取吸光率并且從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算配體濃度。c-erbB-2數(shù)據(jù)以單位/ml和單位/mg蛋白表示并報(bào)道以使這些發(fā)現(xiàn)可與先前文獻(xiàn)中的結(jié)果相比較。
使用來(lái)自CIS Bio International的EIA試劑盒測(cè)定CA15-3實(shí)驗(yàn)。CA15-3分析是雙位點(diǎn)固相酶免疫分析。將CA15-3分子連接在兩個(gè)單克隆抗體之間，第一個(gè)單克隆抗體與ELISA固相結(jié)合，第二個(gè)抗體與辣根過(guò)氧化酶連接(酶共軛物)。洗滌后，酶反應(yīng)產(chǎn)生與分析中存在的CA15-3量成正比的顏色。使用分光光度計(jì)于490nm(辣根過(guò)氧化酶)讀取吸光率并從用已知濃度配體繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。將CA15-3分析用于分析血清樣品。以全唾液替代血清進(jìn)行唾液CA15-3測(cè)定。CA15-3濃度以單位/ml表示。
統(tǒng)計(jì)分析同樣使用SPSSTM統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。從四個(gè)不同的方面分析這些數(shù)據(jù)。開始，針對(duì)每一組總結(jié)唾液和血清標(biāo)記濃度，并且對(duì)來(lái)自調(diào)查的人口和補(bǔ)充數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性分析。重點(diǎn)是種族、病史、吸煙狀況、用藥情況和月經(jīng)狀況與c-erbB-2濃度之間的關(guān)系。按腫瘤類型、病期和結(jié)節(jié)狀態(tài)總結(jié)數(shù)據(jù)。由于癌癥組婦女較少，原發(fā)性腫瘤(T)和結(jié)節(jié)狀態(tài)(N)亞類的數(shù)目有所重疊。將原發(fā)性腫瘤類二分為T1和大于T1類，而結(jié)節(jié)狀態(tài)分別簡(jiǎn)化為結(jié)節(jié)陰性和結(jié)節(jié)陽(yáng)性。
差異的單向分析(ANOVA)用于比較三組的乎均標(biāo)記值，重點(diǎn)是乳腺癌與非癌組的之間的比較。Dunnett’s測(cè)試用于校正多項(xiàng)比較。
唾液和血清c-erbB-2水平之間以及唾液和血清中c-erbB-2和CA15-3濃度之間的可能相關(guān)性通過(guò)Pearson’s相關(guān)系數(shù)研究。因?yàn)檫@些濃度的一部分的分布是不對(duì)稱的，所以使用每個(gè)數(shù)值的平方根轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)。實(shí)施例9進(jìn)行受者操作特性(ROC)分析以研究每一生物標(biāo)記的適當(dāng)區(qū)分值。使用對(duì)照和癌癥組的平均值作為起始區(qū)分值，分別將每一標(biāo)記的濃度記錄為二分變量。對(duì)于每一標(biāo)記，評(píng)估區(qū)分值在平均值的正向(＞χ)和反向(＜χ)方向的增加范圍。將乳腺癌二分為陽(yáng)性和陰性。對(duì)于每一區(qū)分值，使用Two-by-two表計(jì)算每一生物標(biāo)記檢測(cè)疾病的靈敏度和特異性值。對(duì)唾液和血清中的c-erbB-2和CA15-3濃度繪制ROC曲線(靈敏度1-特異性)。使用形成ROC曲線下最大面積百分比的區(qū)分值來(lái)確定每一標(biāo)記的最佳區(qū)分值。見Wilcosky TC.，第三章，選擇和評(píng)估標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)。于Hulka BS，Wilcosky TC，GriffithJD，eds流行病學(xué)中的生物標(biāo)記，NewYork，Oxford Universisity Press，1990，pp.36-42；以及SPSS for Windows，release 9.0.chicago；SPSS，1999。實(shí)施例10對(duì)三組婦女進(jìn)行調(diào)查得來(lái)的人口統(tǒng)計(jì)和補(bǔ)充數(shù)據(jù)總結(jié)于圖8和9。進(jìn)行種族、吸煙狀況、用藥情況和月經(jīng)狀況頻度比較。三組之間的種族、吸煙狀況和月經(jīng)狀況有明顯不同。與高加索人相比，更多的非裔美國(guó)人患乳腺癌和良性腫瘤病癥。同樣，與非吸煙者相比，明顯更多的吸煙者患乳腺癌和良性腫瘤病癥。至于月經(jīng)狀況，與來(lái)月經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女相比，更多的月經(jīng)期婦女患乳腺癌和良性腫瘤病癥。對(duì)于每一組，根據(jù)健康狀況(如對(duì)照、良性、癌癥)比較平均c-erbB-2值。沒有顯著的可報(bào)道的歸因于每組婦女內(nèi)這些差異(健康狀況)的對(duì)c-erbB-2濃度的影響。年齡比較沒有得出c-erbB-2值的組間顯著差異，并且采用回歸模型時(shí)不與c-erbB-2值線性相關(guān)。
進(jìn)一步分析表明，患乳腺癌婦女產(chǎn)生比良性腫瘤和對(duì)照組婦女明顯高得多的可檢測(cè)的c-erbB-2唾液水平。三組唾液標(biāo)記濃度的平均值、平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差以及95％置統(tǒng)區(qū)間示于圖8，12-14。如圖8中所示，對(duì)照和良性腫瘤組的c-erbB-2平均值比癌癥組的平均值低50％-57％。在這些婦女中存在相關(guān)血清c-erbB-2水平的強(qiáng)平行響應(yīng)，相關(guān)范圍為55％-64％。盡管在相對(duì)于總蛋白校正之前，血清中濃度大約比唾液中濃度高15倍。
良性腫瘤的大部分是纖維腺瘤或纖維囊性腫瘤?；歼@些良性腫瘤的婦女中，纖維腺瘤和纖維囊性腫瘤中存在的唾液c-erbB-2濃度之間差異極小。兩名婦女呈現(xiàn)有充滿液體的囊腫，兩名婦女有良性鈣化。對(duì)于充滿液體的囊腫，血清和唾液的c-erbB-2值比纖維腺瘤和纖維囊性腫瘤組統(tǒng)計(jì)上更低。同樣，對(duì)于這兩組良性腫瘤，血清中的反應(yīng)與唾液中的反應(yīng)相似，盡管觀察到的平均濃度的排列順序在纖維腺瘤和纖維囊性組之間相反。
在癌癥組中腫瘤的絕大部分是滲透性導(dǎo)管癌(n＝19)。一名婦女患滲透性小葉癌，三名患導(dǎo)管癌，而七名患混合型惡性乳腺癌。這些組的平均唾液和血清c-erbB-2濃度大大高于對(duì)良性腫瘤觀察到的數(shù)值。
至于癌腫瘤的病期，有一名0期(T0N0M0)病人，六名I期(T1N0M0)，八名IIA期(T2N0M0)，三名IIB期。IIB組由一名T2N1M0和二名T3N0M0組成。有二名IIIA期，由一名T3N0M0和一名T3N2M0組成；三名IIIB期，由一名T3N3M0和二名T4N1M0組成；7名病人在得到此實(shí)施例數(shù)值時(shí)尚未分期。
有7名患乳腺癌的研究對(duì)象是結(jié)節(jié)陽(yáng)性的，16名是結(jié)節(jié)陰性。所有診斷為癌癥的個(gè)體都沒有遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的跡象。原發(fā)性腫瘤的亞類與T1和大于T1以及結(jié)節(jié)陽(yáng)性和結(jié)節(jié)陰性組重疊(圖10)。這些分析表明，c-erbB-2唾液和血清濃度沒有與腫瘤大小有關(guān)的差異，但是無(wú)論對(duì)于何種診斷介質(zhì)，結(jié)節(jié)陽(yáng)性和結(jié)節(jié)陰性之間都有更大的c-erbB-2濃度差異(圖10)。實(shí)施例11第二水平的分析比較了患乳腺癌婦女、患良性病癥婦女和健康對(duì)照婦女的組平均值。進(jìn)行了三組之間唾液c-erbB-2不平衡數(shù)據(jù)的單向ANOVA，并發(fā)現(xiàn)在F＝13.83顯著；P＜0.0001水平。Dunnett’s C因果分析表明，在癌癥組和腫瘤及對(duì)照組之間顯示有P＜0.001水平的顯著差異。
對(duì)于三組婦女之間的血清c-erbB-2，也證實(shí)了相似的結(jié)果?？侫NOVA于F＝19.95顯著；P＜0.0001水平而因果分析于P＜0.001水平顯著(癌癥＞兩個(gè)非癌癥組)。
對(duì)于CA15-3，總ANOVA于F＝5.94顯著；P＜0.04水平而因果分析于P＜0.05水平顯著(癌癥＞非健康對(duì)照組)。相似地，三組婦女之間血清c-erbB-2的結(jié)果于F＝20.96顯著；P＜0.0001水平而因果分析于P＜0.001水平顯著(癌癥＞健康對(duì)照組)。
相對(duì)于總蛋白濃度校正的唾液和血清c-erbB-2水平數(shù)據(jù)表現(xiàn)與未校正數(shù)據(jù)相同的結(jié)果。唾液c-erbB-2的總ANOVA于F＝13.80顯著；P＜0.0001水平而因果分析于P＜0.001水平顯著(癌癥＞兩個(gè)非癌癥組)。三組婦女之間的血清c-erbB-2結(jié)果于F＝14.45顯著；P＜0.0001水平而因果分析于P＜0.001水平顯著(癌癥＞兩個(gè)非癌癥組)。實(shí)施例12第三水平的分析(相關(guān)系數(shù))揭示了血清和唾液c-erbB-2之間于r＝0.51的顯著中度相關(guān)性；P＜0.0001水平。在血清c-erbB-2與血清CA15-3濃度之間于r＝0.40有顯著的中度相關(guān)性；P＜0.001水平。至于用總蛋白校正的血清c-erbB-2濃度及其與CA 15-3的相關(guān)性，結(jié)果顯示出顯著的中度相關(guān)性r＝0.36；P＜0.001水平。用總蛋白校正的唾液c-erbB-2濃度與用總蛋白校正的血清c-erbB-2濃度之間發(fā)現(xiàn)于r＝0.39的輕微關(guān)系；P＜0.001水平。實(shí)施例13受者操作曲線的比較(第四水平分析)表明，唾液c-erbB-2濃度的區(qū)分值是110單位/ml，血清c-erbB-2濃度的區(qū)分值是2000單位/ml(圖11、12a和13a)。也對(duì)用總蛋白校正的唾液和血清c-erbB-2濃度進(jìn)行了受者操作特性曲線的比較。這些數(shù)值對(duì)于唾液和血清c-erbB-2濃度是100單位/ml和50單位/ml(圖11和12b以及13b)。唾液CA15-3測(cè)定得出4.0單位/ml區(qū)分值(圖11和14a)。與15-40單位/ml的文獻(xiàn)值相比，血清CA 15-3的區(qū)分值是20單位/ml(圖11和14b)。
使用前述區(qū)分值，唾液和血清c-erbB-2分別能檢測(cè)到患癌癥研究對(duì)象的87％和94％(圖11)。用總蛋白校正的唾液和血清c-erbB-2濃度檢測(cè)到研究對(duì)象的77％和84％。這與唾液和血清CA15-3標(biāo)記的62％和75％相當(dāng)。CA15-3水平能檢測(cè)到65％的惡性病癥(圖11、15和16)。實(shí)施例14前面涉及c-erbB-2癌蛋白的研究，在關(guān)于病期、腫瘤類型，結(jié)節(jié)包含和轉(zhuǎn)移存在的研究的各種類型人群中各有不同。另外，各種分析技術(shù)已被用于研究組織和血清中的c-erbB-2蛋白。對(duì)于血清，大多數(shù)研究已使用酶基免疫分析。這些技術(shù)在分析靈敏性方面有所不同，并且使用單克隆抗體或多克隆抗體。在文獻(xiàn)中使用過(guò)的一些試劑盒已經(jīng)缺貨并且不再對(duì)研究人員供應(yīng)。本文的這些發(fā)現(xiàn)與使用相似樣品大小、病期和分析技術(shù)的研究一致。
前面實(shí)施例的結(jié)果表明，患乳腺癌婦女中的唾液c-erbB-2和血清c-erbB-2水平增高(圖8和12-14)。對(duì)于乳腺癌病人中增高的血清c-erbB-2水平，本研究的發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)中存在的其它發(fā)現(xiàn)，特別是那些鑒定非轉(zhuǎn)移癌癥的發(fā)現(xiàn)一致。文獻(xiàn)中只有一次報(bào)道涉及患乳腺癌婦女中增高的唾液c-erbB-2濃度，且是本研究作者進(jìn)行的初步研究，這一早期研究使用ELA(Triton，Co.)分析來(lái)測(cè)定唾液和血清c-erbB-2濃度。那一研究的結(jié)果也揭示了患乳腺癌婦女中顯著更高的唾液c-erbB-2濃度。與使用相同樣品的第一次研究的分析法相比，本研究中采用的分析法比最初的分析法靈敏五倍。實(shí)施例15良性和惡性腫瘤的對(duì)比得出了可能有用的信息。患纖維腺瘤和纖維囊性病癥的研究對(duì)象產(chǎn)生相似的唾液和血清c-erbB-2濃度(圖9)。對(duì)于血清，這一發(fā)現(xiàn)與Breuer(1998)得到的結(jié)果一致。在此研究中，診斷患滲透性導(dǎo)管癌的研究對(duì)象占癌癥人群的大部分。因此，沒有進(jìn)行各種惡性乳腺病癥之間的對(duì)比。實(shí)施例16原發(fā)性腫瘤數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析揭示，對(duì)于T1組和大于T1組，沒有實(shí)質(zhì)的唾液或血清c-erbB-2濃度的差異(圖10)、這一觀察結(jié)果確與Watanabe(1994)和Kynast(1993)的發(fā)現(xiàn)一致。這一發(fā)現(xiàn)也表明，c-erbB-2受體狀態(tài)可能對(duì)腫瘤擴(kuò)散性有比對(duì)腫瘤體積更好的指示性。實(shí)施例17對(duì)于結(jié)節(jié)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)陽(yáng)性病人的c-erbB-2水平與結(jié)節(jié)陰性病人相比有所提高(圖9)。實(shí)施例18數(shù)據(jù)表明，可溶性唾液c-erbB-2濃度和血清c-erbB-2水平之間的相關(guān)性(r＝0.51；P＞0.0001)。不清楚的可變性可能是因?yàn)槿M婦女間各類個(gè)體的合并以及研究者沒有洞悉c-erbB-2蛋白從腫瘤位點(diǎn)移動(dòng)并進(jìn)入口腔(擴(kuò)散、滲漏、主動(dòng)運(yùn)輸)的真正機(jī)制。c-erbB-2蛋白變得可溶的過(guò)程也未得到充分了解，可能是一部分不清楚的可變性的解釋。目前正在進(jìn)行的進(jìn)一步研究就是探究這些疑問。用總蛋白校正的唾液和血清c-erbB-2濃度之間的相關(guān)性是r＝0.39；p＜0.001。實(shí)施例19發(fā)現(xiàn)了血清c-erbB-2濃度和血清CA15-3水平之間的關(guān)系(r＝0.40，P＞0.001)。這一相關(guān)性與Krainer所報(bào)道的結(jié)果(r＝0.396；P＞0.002)一致。當(dāng)用總蛋白濃度校正血清c-erbB-2濃度時(shí)，血清c-erbB-2濃度和血清CA15-3水平之間的相關(guān)性是r＝0.36，P＜0.001。
另外，前面的實(shí)施例數(shù)據(jù)也表明，作為診斷標(biāo)記，唾液c-erbB-2和血清c-erbB-2的水平可能與唾液CA15-3和血清CA15-3的水平相當(dāng)(圖11、15和16)。唾液和血清c-erbB-2的濃度可以分別檢測(cè)到患癌癥研究對(duì)象的87％和94％。用總蛋白校正的唾液和血清c-erbB-2濃度分別檢測(cè)到研究對(duì)象的77％和84％。這與唾液和血清CA15-3標(biāo)記的62％和75％相當(dāng)。CA15-3水平于20單位/ml區(qū)分值可檢測(cè)到75％的惡性病癥。制造商建議15單位/ml區(qū)分值，并且的確使靈敏度增加到97％；然而，當(dāng)進(jìn)行這一調(diào)整時(shí)，導(dǎo)致如Stenman(1991)所預(yù)計(jì)的特異性急劇下降(35％)。相反，當(dāng)區(qū)分值升至40單位/ml時(shí)，分析法檢測(cè)癌癥的能力降至小于30％。這與Safi(1991)和Stenman(1991)的發(fā)現(xiàn)一致。血清c-erbB-2水平，無(wú)論是否已相對(duì)于總蛋白校正，都保留60％水平的特異性幅度和高于90％的靈敏度。實(shí)施例20來(lái)自健康調(diào)查、涉及年齡、種族、吸煙狀況、全身疾病情況、處方藥的使用和月經(jīng)狀況的信息也得到分析。這些分析確認(rèn)了來(lái)自以前研究者發(fā)表的報(bào)道的結(jié)果，即這些變化對(duì)唾液和血清c-erbB-2沒有影響。因此，對(duì)年齡(Watanabe，1994)、吸煙狀況(Breuer，1998)和月經(jīng)狀況(Breuer，1998)的發(fā)現(xiàn)得到其它研究的支持，然而，我們的研究與Breuer(1998)也有不一致的地方，Breuer(1998)觀察到與年齡相關(guān)的對(duì)標(biāo)記濃度的影響。Breuer(1998)報(bào)道了在絕經(jīng)期婦女中，年齡與c-erbB-2水平顯著相關(guān)。
作為診斷介質(zhì)，唾液有幾個(gè)生物化學(xué)優(yōu)點(diǎn)。唾液是一種澄清、無(wú)色液體，而血清可能在患脂血癥時(shí)變成乳狀、在血細(xì)胞由于損傷溶血時(shí)變成紅色以及在有肝病時(shí)變成黃疸。這些在正常血清及由于疾病而改變的血清中的顏色波動(dòng)可能影響比色分析如ELISA，使之難以形成始終如一的空白，并且在與分析標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定透明度相比時(shí)，干擾血清分析的真實(shí)數(shù)值。既然血清含有比唾液更多的蛋白，那么在分析其它痕量因子(即癌基因)時(shí)，可能導(dǎo)致更大的非特異性干擾的危險(xiǎn)，以及因子和大量血清蛋白之間流體靜力學(xué)(和其它)相互作用的更大可能性。
從供應(yīng)角度來(lái)說(shuō)，唾液的收集安全、無(wú)創(chuàng)傷(即無(wú)針刺)并且相對(duì)簡(jiǎn)單，而且可以重復(fù)收集又不會(huì)使病人感到不適。
由本發(fā)明帶來(lái)的診斷益處包括婦女中乳腺癌的總體管理。乳腺癌在早期的診斷可以使婦女在選擇各種治療方案時(shí)有更多的選擇機(jī)會(huì)。基于唾液的測(cè)試也可用于癌癥病人的術(shù)后管理。腫瘤摘除之后，應(yīng)伴隨預(yù)期的標(biāo)記濃度的下降并且逐漸穩(wěn)定在正常水平，這預(yù)示著病人已經(jīng)痊愈。相反，唾液標(biāo)記持續(xù)地高水平可能是腫瘤復(fù)發(fā)或持續(xù)的征兆。唾液也是鑒測(cè)化療效果的經(jīng)濟(jì)有效的方法。如果治療方案有效，病人應(yīng)該會(huì)有標(biāo)記濃度的下降。
盡管本發(fā)明的原理已結(jié)合具體實(shí)施方案得到描述，但是應(yīng)當(dāng)清楚地理解，這些描述以及本文所選的表格和數(shù)據(jù)僅僅是為了舉例并不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。例如，在沒有限制的情況下，本文描述的方法可擴(kuò)展到膽囊、結(jié)腸、直腸、胰腺和口腔癌癥的診斷和監(jiān)測(cè)。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特征將從以下權(quán)利要求中變得顯而易見，正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所理解的，其范圍由合理的等效物確定。
權(quán)利要求
1.一種使用唾液生物標(biāo)記在人體受檢對(duì)象中差別診斷乳腺癌的方法，所述方法包括使用來(lái)自人體受檢對(duì)象的唾液樣品以提供可診斷乳腺癌的個(gè)體唾液生物標(biāo)記；將上述個(gè)體生物標(biāo)記與生物標(biāo)記參照組對(duì)比，所述參照組包含生物標(biāo)記成分；并且通過(guò)對(duì)比差別鑒定所顯示的上述受檢對(duì)象的診斷。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的生物標(biāo)記參照包括使用惡性腫瘤，良性腫瘤和對(duì)照組人群制備的成分組。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的個(gè)體生物標(biāo)記是生物標(biāo)記組的一個(gè)成分，所述生物標(biāo)記組包含癌抗原15-3，腫瘤抑制劑癌基因蛋白53和癌基因c-erbB-2中的至少一個(gè)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的參照生物標(biāo)記成分組包括每一所述成分的數(shù)值范圍。
5.權(quán)利要求3的方法，其中癌基因c-erbB-2和所述癌基因c-erbB-2的蛋白表達(dá)中至少一個(gè)的存在可鑒定所述受檢對(duì)象患有惡性乳腺癌。
6.權(quán)利要求3的方法，其中每一種所述成分與一濃度值相結(jié)合。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述患惡性乳腺腫瘤的受檢對(duì)象的癌抗原15-3的濃度比所述患良性腫瘤的受檢對(duì)象高至少100％。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述患惡性乳腺腫瘤的受檢對(duì)象的癌蛋白53的濃度比所述患良性腫瘤的受檢對(duì)象低至少25％。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的差別鑒定是對(duì)所述受檢對(duì)象進(jìn)行乳腺癌檢測(cè)的初步診斷方法的補(bǔ)充。
10.一種手術(shù)后監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的方法，所述方法包括提供人體受檢對(duì)象，所述對(duì)象處于惡性腫瘤摘除手術(shù)之后；使用來(lái)自所述受檢對(duì)象的唾液樣品制備手術(shù)后生物標(biāo)記組；將所述受檢對(duì)象的所述手術(shù)后生物標(biāo)記組與之手術(shù)前生物標(biāo)記參照組對(duì)比；并且通過(guò)監(jiān)測(cè)所述生物標(biāo)記組中的至少一種成分來(lái)測(cè)定惡性腫瘤的存在。
11.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括對(duì)所述受檢對(duì)象進(jìn)行手術(shù)后化療。
12.權(quán)利要求11的方法，其中一個(gè)所述化療包括環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶的治療性劑量。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述的手術(shù)前和所述的手術(shù)后生物標(biāo)記組包含c-erbB-2生物標(biāo)記成分。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述的手術(shù)前和所述的手術(shù)后生物標(biāo)記組包含腫瘤抑制劑癌基因蛋白53生物標(biāo)記成分。
15.一種采用內(nèi)源編碼蛋白的濃度以診斷乳腺癌的方法，所述方法包括使用來(lái)自人體對(duì)象的唾液樣品以提供可診斷乳腺癌的個(gè)體蛋白生物標(biāo)記；將所述個(gè)體蛋白生物標(biāo)記與參照蛋白濃度對(duì)比；并且通過(guò)測(cè)定所述個(gè)體蛋白生物標(biāo)記的濃度高于所述參照蛋白來(lái)診斷所述受檢對(duì)象。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物標(biāo)記蛋白是個(gè)體生物標(biāo)記組的一個(gè)成分。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物標(biāo)記蛋白是癌抗原15-3。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物標(biāo)記蛋白是癌基因c-erbB-2的表達(dá)產(chǎn)物。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述參照蛋白是分別針對(duì)惡性腫瘤、良性腫瘤和對(duì)照組人群制備的。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述參照蛋白是生物標(biāo)記組的一個(gè)成分。
全文摘要
在1)健康婦女、2)患良性乳腺病的婦女、以及3)已診斷患有乳腺癌的婦女群體的唾液中檢測(cè)了一組用于診斷和治療乳腺癌的生物標(biāo)記。在所有三組婦女的唾液中發(fā)現(xiàn)了公認(rèn)的腫瘤標(biāo)記c－erbB－2(erb)、癌抗原15－3(CA15－3)以及腫瘤抑制劑癌基因蛋白53(p53),然而經(jīng)測(cè)定,癌癥病人中erb和CA15－3的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康對(duì)照和良性腫瘤病人的唾液水平。相反,與患乳腺癌和良性腫瘤的那些婦女相比,對(duì)照中的泛嗜p53水平更高。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1349611SQ00806967
公開日2002年5月15日 申請(qǐng)日期2000年3月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月1日
發(fā)明者查爾斯·F·斯特雷克福斯, 勒諾·G·比格勒, 詹姆斯·T·西格彭 申請(qǐng)人:密西西比大學(xué)醫(yī)療中心