專利名稱：：診斷或預測乳腺癌的進程的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分子診斷領域，特別是乳腺癌的分子診斷。背景淋巴結累及是許多實體瘤的最強預后因子，病理學家和外科醫(yī)生對淋巴結微轉移的檢測非常感興趣.目前的淋巴結評價包含H&E-染色的組織切片的顯微鏡檢查，且受到3個主要限制(a)容易錯過單個的腫瘤細胞或細胞的小病灶；(b)不能迅速地得到結果，意味著崗哨淋巴結(SLN)操作中的任何陽性結果需要去除腋窩淋巴結的二次手術，和(c)僅僅研究1個或2個組織切片，因而每個淋巴結的絕大部分未被檢測。連續(xù)切片可以輔助克服取樣誤差的問題，且免疫組織化學(IHC)可以輔助鑒別單獨的腫瘤細胞。但是，這些方法的組合，對于常規(guī)分析過于昂貴和耗時，被限于特殊的情況，例如SLN檢查。手術判斷經(jīng)?；谑中g中的淋巴結的冷凍切片分析；但是，這些方法的靈敏度相對較差，相對于標準的H&E病理學，其范圍為50-70%,導致不可接受的二次手術高比例。不具有淋巴結累及的0和I期乳腺癌患者的5年存活率分別是92%和87%。另一方面，具有淋巴結累及的晚期乳腺癌患者的5年存活率顯著降低。例如，II期乳腺癌的存活率僅僅是75%，111期是46%，IV期是13"A。盡管淋巴結陰性的乳腺癌患者具有提高的存活率，20-30%組織學上淋巴結陰性的患者會遭受疾病復發(fā)。這很可能是由于目前的檢測微轉移的技術的限制，包括與淋巴結取樣和檢測單獨的肺瘤細胞或小肺瘤病灶的較差靈敏度有關的問題。除了對乳腺癌淋巴結轉移的更精確和靈敏的檢測的需要外，還存在對手術邊緣的更精確檢測的需要，尤其是在手術中的場合。聚合酶鏈式反應(PCR)是分子生物學領域的有力工具，其可以用于該場合。該技術允許復制/擴增小量的核酸片段，至可以以有意義方式分析的量。而且，隨著實時定量RT-PCR(Q-RT-PCR)的發(fā)展，該技術已經(jīng)變得更可靠，以及更容易自動化。Q-RT-PCR不易受到污染，且會提供基因表達的定量。在手術中的淋巴結測定中，這樣的定量可以用于檢測微轉移。盡管存在它的優(yōu)點，分子診斷中的PCR具有幾個限制，使它難以應用于典型的臨床診斷場合，尤其是在手術中的場合。一個這樣的限制是，進行PCR診斷典型地消耗的時間。典型的PCR反應消耗數(shù)小時，而不是幾分鐘。如果要在手術中使用該技術，必須縮短進行PCR反應所消耗的時間。而且，盡管Q-RT-PCR可以提供定量的結果，迄今為止尚不知道;^于這樣的技術區(qū)分陽性和陰性結果的截止值，也不清楚哪些核酸片段被最好地檢測并與微轉移的存在相關聯(lián)。也存在擴增和檢測核酸片段的其它方法，且都具有類似的問題。能克服現(xiàn)存困難的手術中的分子淋巴結測定，會被醫(yī)學界很好地接受。細胞角蛋白19(也稱作角蛋白19，CK19和KRT19)已經(jīng)被公認為有用的檢測上皮細胞的基因。幾種身體區(qū)室(包括血液，骨髄和淋巴結)中的這些細胞的檢測，與幾種癌癥的轉移有關，包括乳腺癌。CK19mRNA的檢測，經(jīng)常伴有4個假基因的存在(1個在染色體6上，1個在染色體4上，2個在染色體12上)。這些假基因的序列不具有允許區(qū)別剪接的mRNA和DNA的內(nèi)含子區(qū)，且與完整的CK19mRNA序列具有最高達90%同源性。已經(jīng)證實，能區(qū)別CK19mRNA和CKWDNA、且也能區(qū)別CK19mRNA和4個假基因的引物和探針的設計是一項挑戰(zhàn)。盡管已經(jīng)公開了能區(qū)別CK19mRNA和DNA的引物，其它研究組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些引物會與DNA交叉反應。為了避免與DNA的交叉反應性的問題，許多研究組采用RNA純化方法，它(l)包括DNA降解步驟(用DNA酶)，或(2)基于能去除>99%污染DNA的方法，例如Trizol。典型地，不希望要求DNA降解步驟或要求采用基于Trizol的RNA純化。兩種方法都會增加RNA制備所需要的時間和復雜性。因而，這些方法不適用于要求非常容易使用和快速的組合的用途，例如手術中的用途的情況.在例如這樣的情況下，必須采用可以區(qū)別mRNA和DNA的CK19擴增方法。發(fā)明簡述本發(fā)明是診斷乳腺癌的存在或預測乳腺癌的進程的測定。在一個實施方案中，該測定診斷微轉移。在另一個實施方案中，微轉移的檢測是在SLN中，尤其是在手術過程中。根據(jù)已知的方法，外科醫(yī)生會在手術過程中鑒別SLN。如下所述，取出和制備SLN。然后，從SLN迅速提取核酸(例如，DNA和RNA)。然后，如果存在，擴增并檢測指示微轉移的標志物。然后，基于這樣的標志物的檢測結果，外科醫(yī)生采取行動。在本發(fā)明的另一個方面，標志物是對特定組織特異性的核酸片段和至少一種非組織特異性的標志物。在本發(fā)明的另一個方面，標志物是指示惡性肺瘤的核酸片段。在本發(fā)明的另一個方面，在乳腺癌診斷的情況下，標志物是乳腺珠蛋白(mammaglobin)(SEQIDNO:1和CK19(SEQIDNO:2)或PIP(SEQIDNO:3)、B305D(特別地，同種型C，SEQIDNO:4)、B726(SEQIDNO:5)、GABA(SEQIDNO:6)或PDEF(SEQIDNO:7)的那些。分別見，Watsonetal.(1996)CancerRes.56:860-865，Hoffman-Fazeletal.(2003)AnticancerRes.23:917-920，Strausbergetal,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci,USA99:16899-16903，Zehentneretal.(2002)Clin.Chem.48:1225-1231(B305D和B726),Mehtaetal.(1999)BrainRes.BrainRes.Rev.29:196-217，F(xiàn)eldmanetal.(2003)CancerRes.63:4626-4631，和Grandchampetal.(1987)Eur.J.Biochem.162:105-110。本發(fā)明定義了特異性的引物/探針組，其可以最佳地擴增乳腺珠蛋白RNA，并檢測擴增產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個方面，公開了用于CK19mRNA的特異性檢測的最佳的引物和探針.在本發(fā)明的另一個方面，通過包括下述步驟的方法檢測微轉移從SLN得到RNA;進行對2種或多種目標基因特異性的定量RT-PCR方法，和檢測是否存在超過預定截止值的標志物.截止值可以是絕對值或相對于對照基因的表達的值。在本發(fā)明的另一個方面，所述測定包括DNA，其編碼組成型表達的內(nèi)部對照基因和用于提供反應質量控制和所有RNA-相關的測定部分的充足性的標志物。在一個方面，內(nèi)部對照基因是膽色素原脫氨酶(PBGD，SEQIDNO:8)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，試劑盒含有用于進行該測定的試劑。附圖簡述圖1是描述在95%特異性的各標志物的靈敏度的柱形圖。詳細描述提出了癌癥診斷和預測的方法。這些方法采用，從細胞或組織(例如淋巴結)提取核酸，和擴增和檢測指示乳腺癌的核酸片段(這樣的片段在本文中稱作"標志物")的方法。如果要在手術中進行測定，必須快速地擴增和檢測指示某些基因的表達的標志物。假如可以在手術中的測定可接受的時間內(nèi)(即不超過約35分鐘)進行這樣的方法，可以使用任何可靠的、靈敏的和特異性的方法。這包括PCR方法，滾環(huán)擴增方法(RCA)，連接酶鏈反應方法(LCR)，鏈置換擴增方法(SDA)，基于核酸序列的擴增方法(NASBA)，和其它方法。包含的快速分子診斷最優(yōu)選地是定量PCR方法，包括QRT-PCR。不論采用的擴增方法是什么，重要的是，對用于進行測定的組織足夠地取樣。在SLN的情況下，這包括合適的切除，和SLN的加工，以及從它提取RNA。一旦得到，重要的是合適地加工淋巴結，以便檢測到存在的任何癌細胞?？梢缘玫皆S多從組織樣品提取核酸的技術。在每種情況下，標準的實踐都是耗時的，且是困難的，甚至當使用為該目的設計的可商業(yè)上得到的試劑盒時也是如此。典型的可商業(yè)上得到的核酸提取試劑盒需要至少15分鐘來提取核酸。在本發(fā)明的方法中，核酸的提取需要小于8分鐘，優(yōu)選地小于6分鐘。這些快速提取方法是美國專利申請系列號10/427,217的主題。完整的RNA的成功分離通常包括4個步驟細胞或組織的有效破碎，核蛋白復合物的變性，內(nèi)源核糖核酸酶(RNA酶)的滅活，和污染DNA和蛋白的去除。硫氛酸胍(GTC)和B-巰基乙醇滅活存在于細胞提取物中的核糖核酸酶的破碎和保護性質，使它們成為第一步的優(yōu)選的試劑。當與表面活性劑例如十二烷基硫酸鈉(SDS)組合使用時，會實現(xiàn)核蛋白復合物的破碎，允許RNA釋放進溶液中，并分離至不含蛋白。在有高濃度的GTC存在下，細胞提取物的稀釋，會造成細胞蛋白的選擇性沉淀，而RNA保留在溶液中。離心可以清除沉淀的蛋白的裂解物和細胞DNA，且優(yōu)選地通過柱進行。這樣的柱也會剪切DNA，并降低樣品的粘度。優(yōu)選地，在含有二氧化硅或其它材料的旋轉柱上，進行RNA純化。手工的細胞和組織破碎，可以借助于美國專利4，715，545所述的一次性組織磨碎器。勻漿時間是l-2分鐘內(nèi)，更優(yōu)選地是30-45秒。然后，可以用擊碎柱(例如，QIAshredder，QIAGENInc.，Valencia,CA，或合適的底物)，或用RNA加工裝置，例如可從OmniInternational(Warrenton，VA)商購的PCR組織勻漿試劑盒加工樣品，以降低它的粘度。通過如上所述的旋轉柱，沉淀出RNA，離心時間不超過30秒。當使用商業(yè)的RNA提取試劑盒例如可從Qiagen，Inc.得到的那些時，使用過濾替代所有步驟的離心(除了柱干燥和RNA洗脫步驟以外)。典型地，在應用于柱上之前，用等體積的70%乙醇稀釋樣品。通過過濾洗滌后，通過離心干燥柱，在不含RNA酶的水中洗脫RNA。將RNA選擇性地從乙醇溶液中沉淀出來，并結合到底物(優(yōu)選地，含有二氧化硅的膜或過濾器)上。由于離液鹽對水分子的破壞而快速發(fā)生RNA向底物的結合，從而有利于核酸向二氧化硅的吸附。通過簡單的洗滌步驟，從污染的鹽、蛋白和細胞雜質中進一步純化結合的總RNA。最后，通過加入無核酸酶的水，從膜洗脫總RNA。該快速方法的總時間少于8分鐘，且優(yōu)選地少于6分鐘。總之，該快速RNA提取方法包含下面的步驟(a)從生物系統(tǒng)得到含有細胞的樣品，(b)任選地，從樣品去除沒有目標RNA的細胞，得到工作樣品，(c)裂解含有目標RNA的細胞，并得到它們的勻漿，(d)任選地，稀釋勻漿，(e)使浸濕的、勻漿的工作樣品接觸底物，所述底物含有或固定有與RNA結合的物質；(f)使樣品結合底物，(g)去除污染物和干擾物，(h)干燥底物，和(i)從底物洗脫RNA;在使用離心的情況下，它可以在步驟g，h，或I之后進行，且優(yōu)選地在提取步跺中應用真空/過濾。在該快速提取過程中包含的試劑是裂解/結合緩沖液(優(yōu)選地，4.5M胍-HCI，100mMNaP04)，洗滌緩沖液I(優(yōu)選地，5M胍-HCl，20mMTris-HCl中的37%乙醇)，洗滌緩沖液II(優(yōu)選地，20mMNaCl，2mMTris-HCl中的80%乙醇)，洗脫緩沖液，和無核酸酶的無菌雙蒸水。由于癌細胞在淋巴結中的分布是不均勻的，優(yōu)選地對淋巴結的多個切片取樣。任選地，也可以基于病理學，檢查一個或多個淋巴結。完成基于分子的實驗和通過病理學檢查相同的淋巴結樣品的一種方法是，將淋巴結切成至少4個切片，一個外面的和里面的切片用于病理學，一個外面的和里面的切片用于分子試驗。由于組織中的轉移和微轉移的分布在淋巴結或其它組織中是不均勻的，應當?shù)玫阶銐虼蟮臉悠?，以便不會錯過轉移。在本方法中，該取樣問題的一種方法是，勻漿大組織樣品，隨后稀釋要在隨后的分子試驗中使用的充分混合的勻漿的樣品。典型的PCR反應包括多個能選擇性地擴增靶核酸種類的擴增步驟或循環(huán)。典型的PCR反應包括3個步驟變性步驟，其中變性靶核酸；退火步驟，其中一組PCR引物(正向和反向引物)退火于互補的DNA鏈;和延伸步驟，其中熱穩(wěn)定的DNA聚合酶延伸引物。通過重復該步驟多次，擴增DNA片段，生成擴增子，其與靶DNA序列相對應。典型的PCR反應包括20或多個變性、退火和延伸的循環(huán)。在許多情況下，可以同時進行退火和延伸步驟，在該情況下，循環(huán)進包含2個步驟。在本發(fā)明的采用RT-PCR的方法中，在適于手術中的診斷的時間，進行RT-PCR擴增反應，每個這樣的步驟的長度可以是在秒范圍內(nèi)，而不是分鐘。更具體地，利用能產(chǎn)生至少約5"C/秒的熱變化速度的某些新熱循環(huán)儀，使用在30分鐘或更少時間內(nèi)的RT-PCR擴增。更優(yōu)選地，擴增進行小于25分鐘。據(jù)此，為PCR循環(huán)的每個步驟提供的下述時間不包括變化時間。變性步驟可以進行10秒或更少的時間。事實上，有些熱循環(huán)儀具有"O秒"的設置，它可以是變性步驟的最佳持續(xù)時間。也就是說，它足以使熱循環(huán)儀達到變性溫度。退火和延伸步驟各自最優(yōu)選地小于10秒，當在相同的溫度進行時，退火/延伸步驟的組合可以小于10秒。但是，有些均勻的探針檢測方法可能需要分開的延伸步驟，以最大化快速測定性能。為了使總擴增時間和非特異性的副反應的形成最小化，退火溫度典型地大于50TC,更優(yōu)選地，退火溫度大于55TC。由于下面的幾個原因，沒有實驗人員干預的單組合的RT-PCR反應是合乎希望的(1)降低的實驗誤差風險，(2)降低的靶或產(chǎn)物污染的危險，和(3)升高的測定速度。反應可以由一種或2種聚合酶組成。在兩種聚合酶的情況下，這些酶之一典型地是基于RNA的DNA聚合酶(逆轉錄酶)，且一種是熱穩(wěn)定的、基于DNA的DNA聚合酶。為了最大化測定性能，優(yōu)選地為這兩種酶功能采用"熱啟動"技術的形式。美國專利5,411,876和5，985，619提供了不同的"熱啟動"方案的實例。優(yōu)選的方法包括，使用一種或多種熱激活方法，其會掩蔽有效的DNA聚合所需的一種或多種組分。美國專利5，550，044和5，413，924描述了制備用于這樣的方法中的試劑的方法。美國專利6，403，341描述了一種掩蔽方法，其包含PCR試劑組分之一的化學改變。在最優(yōu)選的實施方案中，RNA-依賴性和DNA-依賴性的聚合酶活性存在于單一酶中。有效的擴增所需的其它組分包括三磷酸核苷，二價鹽和緩沖組分。在有些情況下，非特異性的核酸和酶穩(wěn)定劑可能是有益的。任何給定的基于擴增的分子診斷的特異性很大程度上(但是非排它地)依賴于引物組的身份。引物組是正向和反向寡核苷酸引物對，其會退火于靶DNA序列，以允許靶序列的擴增，從而生成耙序列特異性的擴增子。引物必須能擴增目標疾病狀態(tài)的標志物。在本發(fā)明的情況下，這些標志物針對乳腺癌。在乳腺癌的情況下，本發(fā)明的方法包含對乳腺組織或乳腺癌組織特異性的組織標志物的擴增，和非組織特異性的標志物的擴增。非組織特異性標志物優(yōu)選地是上皮細胞特異性的。合適的上皮細胞特異性的標志物包括但不限于，腔蛋白聚糖，含硒蛋白質P，結締組織生長因子，角蛋白19(CK19)，EPCAM，E-鈣粘著蛋白，和膠原，IV型，ct-2。使用至少2種標志物的組合，以便當存在時，會在臨床上明顯地且可靠地檢測到淋巴結中的乳腺和/或癌細胞。優(yōu)選地，在單個反應容器中，同時擴增和檢測標志物(即，它們是多路的)。最優(yōu)選地，引物/探針組與對那些標志物特異性的核酸片段互補。標志物包括乳腺珠蛋白(SEQIDNO:l)和細胞角蛋白19(CKl9，SEQIDNO:2)或下述物質(優(yōu)選其中之一)，其替代乳腺珠蛋白或補充乳腺珠蛋白B305D(SEQIDNO:4)，催乳素誘導的蛋白(PIP，SEQIDNO:3)，B726(SEQIDNO:5)，GABA-丌(SEQIDNO:6)或前列腺來源的Ets-轉錄因子(PDEF，SEQIDNO:7)。組織特異性標志物和癌癥特異性標志物的組合，提供分別超過90%和95%的靈敏度和特異性。令人驚奇地，非組織特異性標志物(CK19，SEQIDNO:2)和癌癥特異性標志物(乳腺珠蛋白，SEQIDNO:l)的組合，提供甚至更高的靈敏度和特異性，分別是91%和97%。有些標志物存在于不同的同種型中，某些同種型對一種組織或癌癥比對其它的更有特異性。在B305D的情況下，最優(yōu)選的同種型是B305D同種型C(SEQIDNO:4)。乳腺珠蛋白和CK19標志物的組合也是最優(yōu)選的標志物。反應也必須包含一些檢測特定信號的工具。這優(yōu)選地通過使用能檢測源自目標靶序列的聚合的DNA序列區(qū)域的試劑來完成。在結合到特定的目的核酸序列上時，優(yōu)選的檢測試劑會產(chǎn)生可測量的信號差別。通常，這些方法包含當結合到目標序列上時會產(chǎn)生增強的焚光的核酸探針。典型地，通過分析每個PCR引物組的擴增子生成的相對速度，監(jiān)測本發(fā)明的方法的PCR反應的進展。通過許多檢測試劑和方法，包括但不限于，熒光引物，發(fā)熒光的探針和結合雙鏈DNA的熒光染料，分子信標，Scorpions，等，可以監(jiān)測擴增子生成。監(jiān)測PCR反應的普通方法采用熒光水解探針測定，其利用某些熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(例如Taq或TflDNA聚合酶)的5'核酸酶活性，在PCR過程中切割寡聚探針。選擇的寡聚物在延伸條件會退火于擴增的靶序列。探針典型地在它的5，端具有突光報道物，在它的3'端具有報道物的熒光猝滅劑。只要寡聚物是完整的，就會猙滅來自報道物的熒光信號。但是，當在延伸過程中消化寡聚物時，熒光報道物不再在猝滅劑附近?？梢詫⒔o定的擴增子的游離熒光報道物的相對積累與對照樣品的相同擴增子的積累和/或對照基因(例如，但不限于，P-肌動蛋白和PBDG(膽色素原脫氨酶))的積累相對比，以確定RNA群體中的給定RNA的給定cDNA產(chǎn)物的相對豐度。用于熒光水解探針測定的產(chǎn)物和試劑是商業(yè)上可容易地得到的，例如從AppliedBiosystems得到。其它檢測試劑通常被稱作"Scorpions"，且記載在美國專利6，326，145和5，525，494。這些試劑包括一種或多種分子，其包含有尾的引物和集成的信號系統(tǒng)。引物具有模板結合區(qū)和尾，后者包含接頭和靶結合區(qū)。尾中的靶物結合區(qū)會與引物的延伸產(chǎn)物中的互補序列雜交。該靶特異性的雜交事件與信號系統(tǒng)相偶聯(lián)，其中雜交會導致可檢測的變化。在PCR反應中，有利地排列靶物結合區(qū)和尾區(qū)，使得尾區(qū)保留單鏈，即未復制。因而，尾區(qū)在PCR擴增產(chǎn)物中是未擴增的。接頭包含阻斷部分，其可以阻止聚合酶介導的引物模板上的鏈延伸。也可以容易地得到用于控制和監(jiān)測PCR和QRT-PCR中的擴增子積累的裝置和軟件，包括可從C印heidofSunnyvale,California商業(yè)上得到的SmartCycler熱循環(huán)儀，和可從AppliedBiosystems商業(yè)上得到的ABIPrism7700序列檢測系統(tǒng)。在優(yōu)選的RT-PCR反應中，為了利用有些熱循環(huán)儀的更快的變化時間，某些逆轉錄酶和PCR反應組分的量是不典型的。更具體地，引物濃度非常高。逆轉錄酶反應的典型的基因特異性的引物濃度小于約20nM。為了實現(xiàn)1-2分鐘數(shù)量級上的快速的逆轉錄酶反應，將逆轉錄酶引物濃度升高至大于20nM,優(yōu)選地至少約50nM，典型地約100nM。標準的PCR引物濃度范圍為100nM至300nM。在標準的PCR反應中，可以使用更高的濃度，以補償Tm變化。但是，為了本文的目的，提及的引物濃度用于其中不需要Tm補償?shù)那樾?。如杲需要或希望Tm補償，可以憑經(jīng)驗確定和使用成比例地更高濃度的引物。為了實現(xiàn)快速的PCR反應，PCR引物濃度典型地大于250nM，優(yōu)選地大于約300nM,典型地約500nM。提供了乳腺珠蛋白和CK19的優(yōu)選的引物/探針組。對這樣的引物/探針組合的要求是，它能鑒別臨床上顯著量的CK19mRNA，而不檢測大量的基因組DNA。這些引物和探針可以用于CK19mRNA的特定檢測的任何用途。意外地，證實了該引物/探針組合的亞組顯著優(yōu)于測試的其它組合。細胞角蛋白19具有4種假基因，它們具有約86-91%同一性。這些假基因位于染色體4，6，和12上。通過必須整合外顯子-內(nèi)含子接點，限制測定設計，使得CK19DNA不能被有效地擴增和檢測。在乳腺珠蛋白的情況下，發(fā)現(xiàn)下述物質能提供最佳的結果MG正向引物(SEQIDNO:9)AGTTGCTGATGGTCCTCATGCMG反向引物(SEQIDNO:10)ATCACATTCTCCAATAAGGGGCAMG探針(SEQIDNO:ll)Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-B柳-TT在CK19的情況下，發(fā)現(xiàn)下述物質能提供最佳的結果CK19正向引物(SEQIDNO:12)CACCCTTCAGGGTCTTGAGATTCK19反向引物(SEQIDNO:13)TCCGTTTCTGCCAGTGTGTCCK19探針(SEQIDNO:14)Q570-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TT當使用這些引物/探針組時，下面的引物/探針組作為擴增和檢測PBGD的對照是最佳的。PBGD正向引物(SEQIDNO:15)GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCAPBGD反向引物(SEQIDNO:16)TTGCGGGTACCCACGCGAAPBGD探州SEQIDNO:17)Q670^AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2在本文的實施例中，提供了其它引物、探針和其組合。商業(yè)上使用的診斷也優(yōu)選地采用一種或多種內(nèi)部陽性對照，其能證實陰性結果的特定擴增反應的操作。在RT-PCR反應中必須控制的假陰性結果的潛在原因包括不充分的RNA量，RNA的降解，RT的抑制和/或PCR和實驗人員誤差。在基因表達測定的情況下，優(yōu)選地利用在目標組織中組成型表達的基因。由于下述的幾個因素，PBGD(SEQIDNO:7)是經(jīng)常用作內(nèi)部對照的基因它不含有人類的已知假基因，它在人組織中組成型表達，和它以相對低水平表達，因此不太可能造成目標乾序列的擴增的抑制。使用PBGD作為對照，可以最小化或消除由假陰性結果的所有潛在來源產(chǎn)生的報告錯誤結果。在描述的QRT-PCR方法的商業(yè)化中，用于檢測特定核酸的某些試劑盒是特有有用的。在一個實施方案中，試劑盒包含用于擴增和檢測標志物的試劑。任選地，試劑盒包含樣品制備試劑和/或從淋巴結組織提取核酸的物品(例如，試管)。試劑盒也可以包含使樣品污染的風險最小化的物品(例如，用于淋巴結解剖和制備的一次性解剖刀和表面)。在優(yōu)選的試劑盒中，包含上述的單管QRT-PCR過程必需的試劑，例如逆轉錄酶，逆轉錄酶引物，對應的PCR引物組(優(yōu)選地，針對標志物和對照)，熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶，和合適的檢測試劑，例如但不限于，scorpion探針，用于熒光水解探針測定的探針，分子信標探針，對雙鏈DNA特異的單染料引物或熒光染料，例如溴化乙錠。引物的量優(yōu)選地會產(chǎn)生上述的高濃度。熱穩(wěn)定的DNA聚合酶是常見的，且可從許多生產(chǎn)商商業(yè)上得到。試劑盒中的其它物質可以包括合適的反應試管或管形瓶，屏障結構，典型地是蠟珠，任選地包括鎂;用于逆轉錄酶和PCR階段的反應混合物(典型地IOX)，包括必需的緩沖劑和試劑例如dNTP;不含核酸酶或RNA酶的水；RNA酶抑制劑；對照核酸和/或任何其它的緩沖劑，化合物，輔因子，離子組分，蛋白和酶，聚合物，等，其可以用于QRT-PCR反應的逆轉錄酶和/或PCR階段。任選地，試劑盒包含核酸提取試劑和材料。下面的非限制性實施例有助于進一步描述本發(fā)明。本文中引用的所有文獻都在本文中引作參考。實施例實時PCR本發(fā)明中的實施例是基于實時PCR的使用。在實時PCR中，在PCR指數(shù)期實時監(jiān)測聚合酶鏈式反應的產(chǎn)物，而不是終點測量。因此，DNA和RNA的定量更精確和可再現(xiàn)。在每個循環(huán)的過程中，記錄熒光值，并代表著在擴增反應中擴增至該點的產(chǎn)物的量。在反應開始時存在更多的模板，達到熒光信號首次記錄為統(tǒng)計上顯著超過背景(它是(Ct)值的定義)的點需要更少的循環(huán)數(shù)。閾值循環(huán)(Ct)的概念允許使用基于熒光的RT-PCR的精確的且可再現(xiàn)的定量。PCR產(chǎn)物的均勻檢測優(yōu)選地基于(a)雙鏈DNA結合染料(例如，SYBRGreen)，(b)發(fā)熒光的探針(例如，TaqMan⑧探針，分子信標)，和(c)直接標記的引物(例如，Amplifluor引物)。合適的方法也記栽在美國專利申請系列號顯27，243。實施例1-SLN中的乳腺癌細胞的雙基因鑒別腋窩淋巴結(ALN)轉移的存在，是乳腺癌患者的最重要的預后因子。SLN狀態(tài)是總體ALN累及的重要預示。SLN-陽性的患者在歷史上已經(jīng)在二次手術中經(jīng)歷了ALN解剖。已經(jīng)實現(xiàn)了手術中的SLN分析方法，以減少成本和二次手術的并發(fā)癥，但是這些方法具有較差的且變動的靈敏度，且缺少標準化。下面的實施例證實了作為改善臨床上有關的SLN轉移的手術中診斷的基礎的RT-PCR的可行性。方法從乳腺和其它組織的基因組范圍的基因表達分析，鑒別了8種分子標志物，包括乳腺珠蛋白。通過用于RNA提取的永久切片H&E或快速冷凍，分析了來自254個乳腺癌患者的SLN的替代連續(xù)切片。通過定量RT-PCR，分析盲法的SLNcDNA。將PCR信號與患者基礎上的H&E結果相對比。使用多變量接收器操作特征(ROC)分析，選擇與H&E結果最佳相關的PCR截止值?；颊邩悠?在東卡羅萊納州大學，從乳腺癌患者淋巴結的乳腺珠蛋白的臨床終點PCR研究，得到SLNRNA樣品。淋巴結RNA源自最初淋巴結的一半。通過Agilent，光譜學和管家基因PCR分析，評估樣品質量。從研究中去除其中存在被視作較差質量且認為是乳腺PCR陰性的樣品的患者。在該研究中包含來自254個患者的所有SLN。標志物驗證:從文獻和內(nèi)部的生物信息學方法，鑒別了7種標志物，包括乳腺珠蛋白，并隨后在原始乳腺組織樣品上驗證。采用PBGD和P-肌動蛋白作為管家基因。通過定量PCR，利用ABIPrism7卯0HT序列檢測系統(tǒng)上的TaqMan化學，分析淋巴結cDNA。以Ct記錄數(shù)據(jù)。將Ct定義為觀察到標準化的報道物發(fā)射的統(tǒng)計學顯著增加的循環(huán)。乳腺珠蛋白引物(SEQIDNO:18和SEQIDNO:19)由InvitrogenCorp.(Carlsbad，CA)合成，乳腺珠蛋白TaqMan探針(SEQIDNO:20)購自EpochBiosciences(SanDiego,CA)。CK19引物(SEQIDNO:21和SEQIDNO:22)和TaqMan⑧探針(SEQIDNO:23)。B726引物(SEQIDNO:24和SEQIDNO:25)和TaqMan⑧探針(SEQIDNO:26)。B305D引物(SEQIDNO:27和SEQIDNO:28)由InvitrogenCorp合成，探針(SEQIDNO:29)由AppliedBiosystems，Inc.合成。PIP引物(SEQIDNO:30和SEQIDNO:3l)和TaqMan⑧探針(SEQIDNO:32)。PDEF引物(SEQIDNO:33和SEQIDNO:34)和TaqMan探針(SEQIDNO:35),GABA引物(SEQIDNO:36和SEQIDNO:37)和TaqMan⑧探針(SEQIDNO:38)。PBGD引物(SEQIDNO:39和SEQIDNO:40)由QIAGENOperon(Alameda，CA)合成，探針(SEQIDNO:41)由Synthegen，LLC(Houston,TX)合成。對于所有TaqMan⑧探針，使用羧基熒光素(FAM)和羧基四曱基若丹明(TAMRA)作為染料和猝滅劑對。SEQIDNO:18CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGASEQIDNO:19TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGASEQIDNO:206-FAM-tgtttatgcaattaatatatgacagcagtctttgtg-TAMRASEQIDNO:21AGATGAGCAGGTCCGAGGTTASEQIDNO:22CCTGATTCTGCCGCTCACTATCASEQIDNO:23FAM-ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCA-TAMRASEQIDNO:24GCAAGTGCCAATGATCAGAGGSB(JIDNO:25ATATAGACTCAGGTATACACACTSEQIDNO:26FAMTCCCATCAGAATCCAAACAAGAGGAAGSEGIDNO:27TCTGATAAAGGCCGTACAATGSE(3IDNO:28TCACGACTTGCTGTTT丁TGCTCSEQTDNO:296-FAM-ATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACACC-TAMRASEQIDNO:30GCTTGGTGGTTAAAACTTACCSEQIDNO:31TGAACAGTTCTGTTGGTGTASE(2IDNO:32FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAA丁CCGG-TAMRASEQIDNO:33GCCGCTTCATTAGGTGGCTCAASEQIDNO:34AGCGGCTCAGCTTGTCGTAGTTSEQIDNO:35AAGGAGAAGGGCATCTTCAAAATTGAGGACTCAGCSEQIDNO:36CAATTTTGGTGGAGAACCCGSEQ>IDNO:37GCTGTCGGAGGTATATGGTGSEQIDNO:38FAMCATTTCAGAGAGTAACATGGACTACACATAMRASEQIDNO:39CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAASEQIDNO:40CAGACTCCTCCAGTCAGGTACASEQIDNO:41FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-TAMRA數(shù)據(jù)分析:在PCR試驗結束時，使樣品解盲。在這樣的時間，使H&E，IHC，復發(fā)和其它病理學數(shù)據(jù)可得到。使用多邊量接收器操作特征(ROC)分析和目視觀察，建立Ct截止值，用于測定陽性淋巴結狀態(tài)。對于所有假陰性的和假陽性的結果，進行有差異的分辯(基于病理學報告)?；谙率龅臉藴?，鑒別假定陽性的樣品(可能代表著由于不充分的淋巴結取樣導致的標準病理學錯過的真陽性的樣品)至少4種分子標志物是陽性的，至少1種標志物是強陽性的(Ct至少5個循環(huán)低于單標志物測定截止值)。結果見圖1和表1-2,在圖l中，VBM1是CK19。表l不同數(shù)目的標志物的最佳性能<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在表2中，靈敏度是90%，特異性是93%，PPV是84%，且NPV是96%。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>+PCR陽性(Ct《截止值)++強PCR陽性(>5個循環(huán)低于Ct截止值)》4個標志物是假定PCR陽性，和具有至少1種標志物強PCR陽性表4雙基因標記與假定陽性的關聯(lián)FFPEH&E(+)或假定(+)測定標志物<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在表4中，靈敏度是91%，特異性是97%，PPV是93y。，且NPV是96%。結杲雙基因測定(乳腺珠蛋白和CK19)檢測了臨床上可起作用的轉移(在沒有IHC的情況下，H&E-陽性的)，其具有90%靈敏度和93%特異性。第三個基因的添加，對總性能具有最小的影響。作為表征基因實現(xiàn)更好的靈敏度和特異性而進行的努力的一部分，在這些淋巴結樣品上進行PDEF和CK19測定。標志物的CK19十MG組合增加了測定的靈敏度，如下面的表5所示。表5MG+B305D標志物組合靈敏度=75%特異性=94%PPV=83%<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>特異性=94%PPV二85%NPV=96%這些數(shù)據(jù)不僅證實，CK19會增加測定的靈敏度；具有乳腺珠蛋白的原始標志物是補充標志物。該標志物組合可提高測定性能。結論該研究證實了RT-PCR作為手術中測定的基礎的用途，該測定用于檢測臨床上起作用的乳腺轉移，其乳腺珠蛋白/CK19表達與SLN轉移的標準的H&E檢測密切相關，證實了雙基因(一個乳腺癌特異性的和一個非-組織特異性)分子標記分析會檢測出乳腺SLN中的臨床上有關的轉移。因而，該實驗具有顯著減少經(jīng)歷SLN活組織檢查的患者的二次手術的潛力。實施例2-乳腺珠蛋白、CK19和PBGDmRNA的特異性檢測的最佳引物和探針乳腺珠蛋白引物和探針測定了Tth聚合酶為快速測定提供足夠的鏈置換和核酸酶活性的能力，為適當?shù)臏y定條件，優(yōu)化引物和探針。第一組引物/探針是對外顯子2和3特異性的。用或不用SybrGreen進行實驗，以區(qū)分成功的擴增和檢測。進行二價陽離子濃度的優(yōu)化和鎂(MgCh)向錳(MnS04)的添加，以改進RT和擴增。這些實驗中的一個也證實，MgCl2和MnS04之間沒有顯著差異。這些實驗導致使用2種二價陽離子的最佳測定錳(MnS04)用于RT，鎂(MgCl2)用于PCR，分別在2.5mM和3.5mM。第一次設計產(chǎn)生了105bp擴增子，并在相同區(qū)域重新設計，產(chǎn)生更小的96bp擴增子。第一次和第二次設計工作得非常好，但是表現(xiàn)出非常高的信號，和從Fam通道向Cy3通道中的溢出。為跨外顯子1和2的乳腺珠蛋白重新設計測定，因為跨外顯子2和3的設計是在AT富集區(qū)，且在通過限制循環(huán)溫度的柔性而進行多路努力的過程中可能存在問題。在相同的區(qū)域設計兩種探針。在Fam，Cy3，和Cy5通道，測試兩種探針。用或不用SybrGreen驗證新設計，以確保在RT過程中不因為探針的存在而產(chǎn)生抑制。乳腺珠蛋白設計歷史SEQIDNO:18CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA外顯于2-3SEQIDNO:9TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA105bpSEQIDNO:42CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA外顯子2-3SE(JIDNO:43GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT96bpSEQIDNO:44TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG產(chǎn)物SEQIDNO:9AGTTGCTGATGGTCCTCATGC外顯子1-2SEQIDNO:10ATCACATTCTCCAATAAGGGGC82bpSEQIDNO:45GCACTGCTACGCAGGCTCTGGC產(chǎn)物SEQIDNO:11CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA產(chǎn)物基于使用兩種探針設計收集的數(shù)據(jù)，挑選SEQIDNO:48作為外顯子1-2區(qū)域的最終設計。來自單路測試的乳腺珠蛋白最終設計在驗證新設計的實驗后，將乳腺珠蛋白置于Fam通道，使用下面的序列作為引物和探針。SEQIDNO:9AGTTGCTGATGGTCCTCATGCSECJIDNO:10ATCACATTCTCCAATAAGGGGCASEQIDNO:11Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1一旦證實水解探針測定適用于Tth聚合酶，也為B305D和CK19測試該測定。CK19第一個寡核苷酸組測試的最初設計在設計中包含接點特異性的PCR引物，因為這似乎是CK19和它的假基因之間的最好區(qū)別。下面顯示了為該設計測試的引物和雙標記的水解探針序列正向引物SEQIDNO:21AGATGAGCAGGTCCGAGGTTA反向引物SEQIDNO:46GCAGCTTTCATGCTCAGCTGT探州5'FAMy3，BHQ)SEQIDNO:23ACCCTTCAGGGTCITGAGATTGAGCTGCA如下面的表7所示，證實了該設計會與基因組DNA強烈地交叉反應表7調(diào)節(jié)的把探針ctct15,500個拷貝DNA26.623,9100,000個拷貝RNA25,325.3探針SYBR調(diào)節(jié)的SYBR^光GreenCtGreenCt225.122.820.1252.023.023.0當為解釋靶濃度的差異而調(diào)節(jié)時，用DNA和RNA觀察到的探針Ct基本上相同。另外，來自水解探針的終點熒光也是基本上相同。總之，這些結果證實，對RNA的引物和探針特異性比對DNA更差。來自分開的反應的SYBRGreen信號暗示著，對DNA耙物的擴增實際上優(yōu)于RNA靶物，這可能是由于多個假基因序列的擴增或在一步RT-PCR過程中RNA向DNA的轉化的無效。第二個寡核苷酸組測試的下一個設計在分開的外顯子中包含接點特異性的探針和引物。下面顯示了為該設計測試的引物和雙標記的水解探針序列正向引物(SEQIDNO:47)CACCCTTCAGGGTCTTGAGA反向引物(SEQIDNO:48)TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC在該情況下，DNA的調(diào)節(jié)的Ct比RNA高2.5個循環(huán)，證實了與DNA相比，對RNA的一定水平的特異性。探針的RNA和DNA之間的Ct差異比SYBRGreen更大(2.5個循環(huán)和0.2個循環(huán))，暗示著特異性提高是由于引物和探針。與以前的設計相比，引物特異性的提高(SYBRGreenCt)是3.1個循環(huán)(0.2個循環(huán)和-2.9個循環(huán))。探針特異性的提高得到了與DNA相比，RNA的熒光2倍增加的支持(表8)。盡管該特異性的增加是合乎需要的，它可能不足以可靠地區(qū)別RNA信號和DNA信號。表8探針調(diào)節(jié)的靶aCt15,500個拷貝DNA29.526.8100,000個拷貝RNA24.324,3探針SYBRGreen調(diào)節(jié)的SYBR熒光CtGreenCt223.923.220.5453,720,320.3第三個寡核苷酸組設計了其它的引物和探針，以進一步提高對RNA的特異性。在相同的區(qū)域進行其它設計，對引物和探針的位置和長度進行最少的修改。在下面的表9中顯示了測試的引物和雙標記的水解探針序列。正向引物(SEQIDNO:47)CACCCTTCAGGGTCTTGAGA(SEQIDNO:5。5CACCCTTCAGGGTCTTGAGAT(SEQIDNO:12)CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT(SEQIDNO:51)ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTG(SEQIDNO:52)ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGA反向引物(SEQIDNO:13)TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC(SEQIDNO:53)CTCCGTTTCTGCCAGTGTGT探針(5'FAM/3'BHQ)(SEQID.NO:49)GCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGA(SEQIDNO:14)ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT表9<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>與上述的條件(條件A)相比，幾個條件證實了調(diào)節(jié)的RNA/DNA探針Ct差異或RNA/DNA探針熒光比的改進。最佳的條件是L，N和0。所有這些條件證實了至少3.6個循環(huán)的Ct差異和至少8的萸光比。所有三種條件證實了通過用于定義陽性的熒光截止值的最少操作，對DNA檢測的所有消除足夠的信號區(qū)別。條件B，D，G，I和K都具有》2.2個循環(huán)的Ct差異和>3.4的熒光比，暗示著使用這些組合來分辨RNA和DNA的合理的潛力。盡管未測試，也預測條件P，Q和R(分別與L，N，和0類似，例外是使用反向引物SEQIDNO:13)會導致最佳操作。測試了條件L和P，以證實通過改變測定熒光截止值，進一步增加對RNA的特異性的能力。下面顯示了為該實施例測試的引物和雙標記的水解探針序列正向引物(SEQIDNO:12)CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT反向引物(SEQIDNO:13)TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC(SEQIDNO:53)CTCCGTTTCTGCCAGTGTGT探針(5'Q570/3'BHQ2)(SEQIDNO:14)ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT如表10所示，通過將截止值從最大熒光的大約1.5%的當前設定點增加到最大焚光的6-7%的水平，在40個循環(huán)以外沒有觀察到DNA的Ct，而RNA的Ct增加了僅僅約2個循環(huán)。最少對于條件L，N，0，P,Q，和R，預測對截止值的這種類型的微小改變會導致最佳操作。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>同樣好地完成了兩個設計，但是選擇更長的產(chǎn)物作為最終設計。將PBGD置于Cy5通道。這是為了確認，不會由于從其它通道的溢出造成內(nèi)部對照的任何陽性的結果。來自單路測試的PBGD最終設計SEQIDNO:55CAAGCGGAGCCATGTCTGGSEQIDNO:54ACCCACGCGAATCACTCTCASEQIDNO:17Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-B的2多路測試在單路測試后，在有和沒有SybrGreen的情況下，以多路測試上面選擇的設計，乳腺珠蛋白在Fam通道中，CK19在Cy3通道中，PBGD在Cy5通道中。觀察到，無模板反應在多路中產(chǎn)生低得多的Ct。依賴于用不同的引物-探針組合進行的進一步實驗，觀察到在PBGD下和CK19上引物之間存在3'二聚作用。由于在多路混合中缺少這兩種引物之一，無模板反應出現(xiàn)高得多的Ct。為了使引物相互作用最小化，為最終的多路測定選擇下面的引物。MG正向引物(SEQIDNO:9)AGTTGCTGATGGTCCTCATGCMG反向引物(SEQIDNO:，O)ATCACATTCTCCAATAAGGGGCAMG探針(SEQIDNO:l1)Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TTCK19正向引物(SEQIDNO:12)CACCCTTCAGGGTCTTGAGATTCK19反向引物(SEQ1DN0:13)TCCGTTTCTGCCAGTGTGTCCK!9探針(SEQIDNO:14)Q570-ACAGCTGAGCATGAA八GCTGCCTT-BHQ2-TTPBGD正向引物(SEQIDNO:，5)GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCAPBGD反向引物(SEQIDNO:16)TTGCGGGTACCCACGCGAAPBGD探針(SEQIDNO:17)Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2在CK19的最終引物選擇過程中，進行引物、探針和循環(huán)條件的對比。這些實驗證實，由于CK19和它的假基因之間的熒光水平的10倍區(qū)別，在Cy3通道中不會檢測出假基因。在可行性研究后，設計分開的實驗，使用基因組DNA來觀察假基因的擴增。在所有情況下，顯然會擴增假基因，而不是基因組DNA，因為在所有情況下，擴增的產(chǎn)物都有正確的長度，且不會表現(xiàn)出內(nèi)含子的擴增。在有和沒有SybrGreen的情況下進行該實驗，以區(qū)別擴增和檢測。使用不同濃度的基因說明書第23/28頁組DNA作為模板，連同無模板對照一起。用僅僅PCR，以及RT-PCR,進行反應。Cy3通道中的水解探針化學沒有挑選出假基因。但是，從SYBR數(shù)據(jù)可以看出，使用在Cy3通道中的水解探針化學，甚至在106個拷貝的濃度，擴增了假基因，但是未檢出。在凝膠上對所有產(chǎn)物進行電泳，來證實結果。在使用模板的所有情況下，觀察到正確大小(81bp)的帶，包括沒有檢測到Ct的無SYBR的反應。為了證實Cy3通道中的信號缺失不是因為擴增的缺失，而是因為由于水解探針化學造成的區(qū)別，該確認是必需的。表ll.有和無SYBRGreen的CK19反應的對比<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實施例3-通過標準方法純化的樣品的快速測定測試樣品通過標準的Trizol方法，從乳腺淋巴結分離RNA。通過在260nm的吸光度，定量RNA。將所有RNA稀釋至200ng/ul。使用管家基因PBGD和P-肌動蛋白，通過兩步RT-PCR，測定RNA質量。如果兩種管家基因都在測試的所有樣品的平均信號的3個循環(huán)內(nèi)產(chǎn)生信號，認為樣品具有足夠的質量。測試的最后一組樣品代表者來自251個患者的487個淋巴結樣品。一步RT-PCR測試使用快速的實時一步RT-PCR，其含有乳腺珠蛋白(MG)、角蛋白19(CK19)和PBGD的引物和探針，擴增了上述的RNA樣品。使用的引物和探針序列如下MG正向引物(SEQIDNO:9)AGTTGCTGATGGTCCTCATGCMG反向引物(SEQDNO:0)ATCACATTCTCCAATAAGGGGCAMG探針(SEQIDNO:ll)Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQl-TTCK19正向引物(SEQIDNO:12)CACCCTTCAGGGTCTTGAGATTCK19反向引物(SEQIDNO:〗3)TCCGTTTCTGCCAGTGTGTCCK19探針(SEQIDNO:14)Q570-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TTPBGD正向引物(SEQIDNO:15)GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCAPBGD反向引物(SEQIDNO:16)TTGCGGGTACCCACGCGAAPBGD探針(SEQIDNO:17)Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2RT-PCR擴增條件在含有下述組分的25Ml反應中，擴增來自每個樣品的1Ml(200ng)RNA:50mMN，N-二(輕乙基)甘氨酸/KOH，pH8.2,3.5mMMgCl2，2.5mM硫酸錳，115mM醋酸鉀，12mM氯化鉀，6mM氯化鈉，0.8mM鱗酸鈉，10%v/v甘油，0.2mg/mlBSA，150mM海藻糖，0.2%v/v吐溫20，0.016%v/vTritonX-100,50mMTris-ClpH8，0,2mMdATP，0.2mMdCTP，0.2mMdGTP，0.2mMTTP，0.08%v/vProClin300，5單位Tth聚合酶(從Thermosthermophilis克隆的重組DNA聚合酶/逆轉錄酶)，400ng抗體TP6-25.3，MG和CK19的每種引物各450nM，PBGD的每種引物各300nM，和200nM每種探針。使用下面的方法，在CepheidSmartCyclerII上進行RT-PCR條件在95TC溫育3秒，在631C溫育150秒，在下述溫度溫育4秒63.2TC，63,4"C，64.0TC,64.51C，65.0TC，65.51:，66.0TC，66.5"C，67.0TC，67.5TC,68.01C,68.5"C,69.01C，69.5TC，在70TC溫育90秒，然后是下述的40個循環(huán)在951C溫育1秒，在60,0t:溫育6秒。在60.01C過程中，在SmartCyclerII的通道1(Fam)，2(Q570)和4(Q670)中，對于陽性的Ct，使用下面的閾熒光值，監(jiān)測熒光信號通道1的是30，通道2的是20，通道3的是20。對于所有3個通道，測定每個樣品的Ct值，然后測定最佳截止值，以便將測定信號和無IHC情況下的H&E-陽性進行關聯(lián)。測得5個樣品具有不可接受的RNA質量，如通過PBGD信號所測得的，并視作無測試結果。下面的表12總結了得到了驗證結果的246個患者的結果:<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例4-通過快速樣品制備方法純化的樣品的快速測定測試樣品使用Omni勻漿器和用于勻漿的一次性探頭，從乳腺淋巴結分離RNA，隨后使用下述方法，用RNeasy(Qiagen)試劑盒試劑純化RNA:勻漿如果以前沒有記錄，測定以毫克計的樣品重量。將一張新蠟紙置于天平上，歸零，稱量樣品。注小于30mg的淋巴結不能提供足夠的組織進行使用BLN測定的測試。使用新解剖刀，將來自相同淋巴結的所有組織切碎成直徑大約1mm的碎塊。在處理過程中，小心地避免污染組織。將勻漿緩沖液加入勻漿試管(8或15mL聚丙烯培養(yǎng)管，對于小于4mL的勻漿緩沖液體積，使用8mL試管，否則使用15mL試管)，使用表13確定需要的體積。表13.需要的勻漿緩沖液的體積<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>注使用推薦的系統(tǒng)，不能充分地勻漿重量大于550mg的組織。在勻漿之前，將組織分成等量部分，將每部分作為單獨的樣本，進行勻漿、純化和測定。1.使用清潔的鑷子，將組織轉移進勻漿緩沖液。2.將新勻漿探頭置于手動勻漿器上.3.徹底勻漿每個淋巴結。4.如RNA純化部分所述，加工勻漿。5.去除勻漿探頭。6.在-65iC或以下保存任何殘余的勻漿。RNA純化注使用該方法，平行地加工多份勻漿。1.通過攪拌10秒，在4.5mL試管中混合400pL勻漿和400pL700/0乙醇。2.對于每種樣品，將VacValve連接到真空集合管上，將一次性VacConnector連接到每個閥門上。3.將旋轉柱連接到VacConnector上，將蓋子打開。4.將來自步驟l的勻漿/乙醇混合物等分到柱上。勻漿/乙醇混合物的體積是基于原始組織量，且提供在表14中。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>5.將VacValve轉至打開位置，應用真空(800-1000mbar)，直到濾出樣品(大約30秒)，6.停止真空；將700uL洗滌緩沖液1加到柱上。啟動真空，并允許溶液通過柱過濾。停止真空.7.將700uL洗滌緩沖液2加到柱上。啟動真空，并允許溶液通過柱過濾。停止真空.8.從真空集合管移開每個柱，并置于2邁L收集試管中.9.在微量離心機中，在13,200RPM,離心含有旋轉柱的試管30秒。10.棄去收集試管，取出柱，并置于新收集試管中。11.將50pL無RNA酶的水直接加到柱的過濾膜上.12.在微量離心機中，在13，200RPM，離心30秒，13.棄去柱.在收集試管中含有大約50uL洗脫的RNA溶液。每25ul反應，使用5uL該溶液.測試的最后組樣品代表著來自崗哨淋巴結-陽性的乳腺癌患者的30H&E-陽性的和25H&E-陰性的腋窩淋巴結。一步RT-PCR測試如實施例3所述，使用源自在該實施例中測試的患者樣品的截止值，例外是，標準化截止值，以解釋采用的2種樣品制備方法之間的差異，在25jil快速的一步RT-PCR反應中，運行5nL洗脫的RNA.測得3個樣品具有不可接受的RNA質量，如通過PBGD信號所測得的，并視作無測試結果，下面的表15總結了得到了驗證結果的52個淋巴結的結果<image>imageseeoriginaldocumentpage33</image>當前反應條件包括乳腺淋巴結測定組分主混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>權利要求1.診斷乳腺癌的存在或預測乳腺癌的進程的方法，包括測量包含至少一種組織特異性基因和至少一種非組織特異性基因的標志基因的組合在源自患者的細胞或組織樣品中的表達。2.根據(jù)權利要求l的方法，其中組織特異性基因選自乳腺珠蛋白(SEQIDNO:l)，PIP(SEQIDNO:3)，B305D(SEQIDNO:4)，B726(SEQIDNO:5)，GABA(SEQIDNO:6)和PDEF(SEQIDNO:7)。3.根據(jù)權利要求1的方法，其中組織特異性基因是乳腺珠蛋白(SEQIDNO:l)。4.根據(jù)權利要求1的方法，其中非組織特異性基因編碼與上皮細胞特異性地相關的蛋白。5.根據(jù)權利要求4的方法，其中基因選自CK19(SEQIDNO:2)，腔蛋白聚糖，含硒蛋白質P，結締組織生長因子，EPCAM，E-鈣粘著蛋白，和膠原，IV型，a-2。6.根據(jù)權利要求5的方法，其中基因是CK19(SEQIDNO:2)。7.根據(jù)權利要求l的方法，其中基因是乳腺珠蛋白(SEQIDNO:l)和CK19(SEQIDNO:2)。8.根據(jù)權利要求7的方法，還包括對照反應，其測量在樣品中組成型表達的基因的表達。9.10.根據(jù)權利要求l的方法，其用于鑒別具有轉移風險的患者。11.權利要求l的方法，其用于檢測轉移。12.權利要求8的方法，其用于檢測乳腺癌轉移。13.權利要求l的方法，其中在手術操作的過程中進行所有步驟。14.根據(jù)權利要求13的方法，其中通過進行包含下述步驟的手術中的分子診斷測定而測量表達從患者得到淋巴結組織樣品；通過核酸擴增和檢測而分析樣品；和確定是否存在一種以上超過截止值的標志物。15.權利要求14的方法，其中通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行核酸擴增和檢測。16.根據(jù)權利要求3的方法，其中使用選自下組的寡核苷酸引物和探針檢測乳腺珠蛋白表達AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(SEQIDNO;9),ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(SEQIDNO:10),Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT(SEQIDNO:l1);CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(SEQIDNO:18),TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA(SEQIDNO:19)，TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT(SEQIDNO:20);和CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(SEQIDNO:42〉，GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT(SEQIDNO:43),TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG(SEQIDNO:44)。17.根據(jù)權利要求16的方法，其中引物/探針組是:AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(SEQIDNO:9)，ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(SEQIDNO:10),Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT(SEQIDNO:l1)。18.根據(jù)權利要求6的方法，其中使用選自下組的引物和探針檢測CK19表達(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:49);(SEQIDNO:51)，(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:49);(SEQIDNO:12),(SEQU)NO:53)，(SEQIDNO:49);(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:49);(SEQIDNO:47),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:53)，(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:5)，(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:53)，(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14);和(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14)。19.根據(jù)權利要求18的方法，其中引物和探針選自(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SBQIDNO:51),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14);和(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14)。20.根據(jù)權利要求19的方法，其中引物和探針選自(SEQIDNO:12)，(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:51),(SBQIDNO:53),(SEQIDNO:M);(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);和(SEQIDNO:12)，(SEQIDNO:13)，(SEQIDNO:14)。21.根據(jù)權利要求20的方法，其中引物和探針是(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13)，(SEQIDNO:14)。22.根據(jù)權利要求9的方法，其中引物和探針是(SEQIDNO:15):(SEQIDNO:16)和(SEQIDNO:17)。23.組合物，其包含選自下組的核酸引物/探針組AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(SEQIDNO:9),ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(SEQIDNO:10),Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT(SEQIDNO:11);CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(SEQIDNO:18),TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA(SEQIDNO:19),TGTTTATGCA八TTAATATATGACAGCAGTCTTTGT(SEQIDNO:20);和CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(SEQIDNO:42),GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT(SEQIDNO:43),和TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG(SEQIDNO:44)。24.權利要求23的組合物，其中引物/探針組是AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(SEQIDNO:9),ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(SEQIDNO:10),和Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ卜TT(SEQIDNO:l1)。25.組合物，其包含選自下組的核酸引物/探針組:(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:49(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:!3),(SEQIDNO:49(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:49(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:49(SEQIDNO:47),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:.14(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14:(SEQIDNO:51)，(SEQIDNO:53)，(SEQIDNO:14(SEQIDNO:52)，(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14:(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13、(SEQIDNO:14(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14(S￡QIDNO:52)，(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14:和26.根據(jù)權利要求25的組合物，其中引物和探針選自(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:12)，(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:52^(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:53)，(SEQIDNO53),(SEQIDNO53),(SEQIDNO13),(SEQIDNO13),(SEQIDNO"'(SEQIDNO14);l化14);14);14);和14)。27.根據(jù)權利要求26的組合物，其中引物和探針選自(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:51、(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:52)，(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);和(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14)。28.根據(jù)權利要求27的組合物，其中引物和探針是(SEQIDNO:12)，(SEQIDNO:13)，(SEQIDNO:14)。29.組合物，其包含核酸引物/探針組(SEQIDNO:15)，(SEQIDNO:16)和(SEQIDNO:17)。30.用于進行權利要求l的手術中淋巴結測定的試劑盒，其包含核酸擴增和檢測試劑。31.權利要求30的試劑盒，其中所述的試劑包含引物，所述引物具有用于檢測選自SEQIDNO:1-8的一組標志物的存在的序列。32.權利要求31的試劑盒，其中引物/探針組選自AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(SEQIDNO:9),ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(SEQIDNO:10),Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT(SEQIDNO:l1);CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(SEQIDNO:18),TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA(SEQIDNO:19),TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT(SEQIDNO:20);和CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(SEQIDNO:42)，GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT(SEQIDNO:43),和TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG(SEQIDNO:44)。33.根據(jù)權利要求32的方法，其中引物/探針組是AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(SEQIDNO:9),ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(SEQIDNO:10),Fam-CCCTCTCCCAGCAC丁GCTACGCA-BHQ1-TT(SEQIDNO:l1)。34.權利要求30的試劑盒，其中引物/探針組選自(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:49);(SEQIDNO:5)，(SEQIDNO:13)，(SEQIDNO:49);(SEQIDNO:12)，(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:49);(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:49);(SEQIDNO:47),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:53)，(SEQIDNO:1化(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14);(SEQDNO:51),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14);和(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14)。35,根據(jù)權利要求34的試劑盒，其中引物和探針選自(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:53),(SEQDNO:14);(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14);和(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14)。36.根據(jù)權利要求35的試劑盒，其中引物和探針選自(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:51)，(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:14);(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:53)，(SEQIDNO:14^;和(SEQIDNO:12),(SEQIDNO:13),(SEQIDNO:14)。37.根據(jù)權利要求30的試劑盒，其中引物和探針是(SEQIDNO:12)，(SEQIDNO:13)，(SEQIDNO:14)。38.根據(jù)權利要求30的試劑盒，其中引物和探針是(SEQIDNO:15)，(SEQIDNO:16)和(SEQIDNO:17)。39.權利要求30的試劑盒，包含RT-PCR試劑。全文摘要診斷乳腺癌的存在或預測乳腺癌的進程的方法，包括測量包含組織特異性基因和非組織特異性基因的標志基因的組合在源自患者的細胞或組織樣品中的表達。在本發(fā)明的一個方面，基因是乳腺珠蛋白和CK19。提供了試劑盒、核酸引物和探針以及對照。文檔編號G01N33/574GK101432437SQ200580026512公開日2009年5月13日申請日期2005年6月6日優(yōu)先權日2004年6月4日發(fā)明者D·阿特金斯,J·巴庫斯,R·懷特,R·貝利,S·洛森申請人:維里德克斯有限責任公司