專利名稱：新的hev抗原肽及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及克隆自戊型肝炎病毒(HEV)中國(guó)株基因組的、具高度免疫反應(yīng)性的病毒肽pE2，以及它在為HEV的檢測(cè)和診斷而研制的可靠診斷方法方面的應(yīng)用，以及在預(yù)防人類HEV的疫苗組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
戊型肝炎病毒(HEV)首次發(fā)現(xiàn)于1983年，它引起腸道傳播的肝炎(Balayan等人，1983)。1991年，病毒的全長(zhǎng)基因組首次獲得克隆及測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它是一條單股正鏈有義無(wú)包膜的RNA(Tam等人，1991)。雖然HEV在形態(tài)上與杯狀病毒科的成員相似(Bradley等人，1988；Huang等人，1992；Panda等人，1989)，但其具有獨(dú)特的基因組組成(Berke等人，1997)。基于序列分析，推測(cè)7.2kb的病毒基因組包含三個(gè)開放讀碼框架(ORF)(

圖1)(Tam等人，1991；Aye等人，1992；Aye等人，1993；Huang等人，1992；Reyes等人，1993)。非結(jié)構(gòu)病毒蛋白由位于病毒基因組5’端的ORF1編碼成多聚蛋白質(zhì)。ORF2位于基因組的3’端，編碼一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。ORF3的5’端有一個(gè)堿基與ORF1的3’端重疊，3’端有339個(gè)堿基與ORF2的5’端重疊。ORF3被認(rèn)為編碼另一功能尚未知的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。通過表位作圖和重組肽研究，表明線性抗原表位位于ORF2和ORF3(Coursaget等人，1993；Khudyakov等人，1993；Khudyakov等人，1994)。
最近的研究表明，來(lái)自O(shè)RF2區(qū)域的主要HEV結(jié)構(gòu)蛋白的氨基端和羧基端的截短的重組多肽能自組裝成病毒樣顆粒(Li等人，1997)。雖然體積較小，這些病毒樣顆粒在形態(tài)和抗原性方面與感染病毒的衣殼蛋白相似(Li等人，1997；Xing等人，1999)。基于這些發(fā)現(xiàn)，表明重組肽裝配成病毒樣顆粒與全長(zhǎng)HEV結(jié)構(gòu)蛋白裝配成感染病毒顆粒的大衣殼具有相似的必要條件。很顯然，這些發(fā)現(xiàn)提示僅僅是ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白可能已經(jīng)足夠自組裝成病毒衣殼。而且顯示涉及衣殼蛋白自身形成的相互作用可能發(fā)生在全長(zhǎng)ORF2蛋白的112至608氨基酸殘基區(qū)域內(nèi)(Xing等人，1999)。位于主要結(jié)構(gòu)蛋白氨基端的111個(gè)氨基酸序列，等電點(diǎn)高達(dá)12.35，被認(rèn)為涉及病毒基因組的包裝(Briton和Heinz，1990)，但是這一區(qū)域顯然不直接參與病毒衣殼自身的組裝。主要結(jié)構(gòu)蛋白的羧基端同樣不直接參與病毒衣殼的組裝，但是Li等人(1997)已顯示這一區(qū)域的蛋白切割是病毒樣顆粒組裝的關(guān)鍵。
戊型肝炎主要發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家，有流行和散布發(fā)生兩種形式。幾次大的戊型肝炎暴發(fā)發(fā)生于1950年代到1980年代，由糞便污染的飲用水而引起(Visvanathan，1957；Wong等人，1980；Myint等人，1985；Belabbes等人，1985；Hau等人，1999)。感染通常是自我限制的，但是也有在懷孕期間發(fā)生感染而產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥的報(bào)道(Tsega等人，1992；Dilawari等人，1994；Hussaini等人，1997)。用于防止病毒感染的一個(gè)重要的預(yù)防策略就是環(huán)境樣品的監(jiān)控和檢測(cè)，以保證公共衛(wèi)生安全和環(huán)境保護(hù)。但是目前用于采集和濃縮病毒顆粒的傳統(tǒng)方法具有幾個(gè)眾所周知的缺點(diǎn)，限制了潛在來(lái)源的HEV的調(diào)查和發(fā)現(xiàn)。目前最通用的兩種方法是吸附法和離心法。
在吸附法中，首先將測(cè)試樣品吸附于微孔濾膜而濃縮病毒，然后用大體積的洗脫液進(jìn)行洗脫。但是這種技術(shù)同時(shí)也有效地濃縮了一些別的溶解物，如腐殖酸和蛋白質(zhì)，它們可能干擾病毒的檢測(cè)。特別是，很多天然產(chǎn)生的無(wú)機(jī)和有機(jī)溶質(zhì)抑制用于擴(kuò)增靶基因組的核酸聚合酶(如反轉(zhuǎn)錄酶和Taq聚合酶)(Tsai等人，1992；1993)。存在于測(cè)試樣品中的核酸酶和蛋白酶可能在擴(kuò)增病毒基因組之前而使之降解，因此而產(chǎn)生模棱兩可的結(jié)果。此外，多種蛋白質(zhì)、糖類和其它有機(jī)化合物可能結(jié)合鎂離子和核苷酸，而這些是核酸聚合酸發(fā)揮適當(dāng)功能所必須的，而且其它溶質(zhì)可能存在毒性影響，可能徹底破壞這些聚合酶的活性(Demeke和Adams，1992；Lmai等人，1992；Kolk等人，1992)。
在離心法中，將測(cè)試樣品勻漿，然后重復(fù)離心。在處理過程中，將聚乙二醇(PEG)加入到上清液中然后再離心。最后的沉淀重懸于緩沖液中，但是最終的濃縮物仍然含有有毒物質(zhì)，這些有毒物質(zhì)可能干擾診斷方法的后續(xù)步驟，如細(xì)胞培養(yǎng)、反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Beril等人，1996)。因此，必須通過葡聚糖凝膠過濾對(duì)來(lái)源于測(cè)試樣品的濃縮物進(jìn)行脫毒。
用于防止病毒感染的另外一種重要策略就是應(yīng)用疫苗產(chǎn)生抗HEV的免疫，以保證公共衛(wèi)生安全和保護(hù)。但是迄今不可能用活的減毒的或殺死了的病毒顆粒來(lái)制備疫苗，防止HEV感染，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)細(xì)胞中繁殖病毒有很大的困難。作為另一種解決的方法，已證明一些重組HEV多肽，特別是那些來(lái)源于病毒基因組結(jié)構(gòu)基因的重組HEV多肽，更有希望提供保護(hù)而防止感染HEV(Tsarev等人，1994a；Tsarev等人，1997)。與減毒病毒相比，用重組多肽制備疫苗的優(yōu)點(diǎn)在于，多肽可以更為有效地生產(chǎn)而且易于純化。而且，產(chǎn)生的疫苗不可能帶有任何活的完整病毒顆粒，因此避免了潛在的感染危險(xiǎn)。
綜上所述，始終需要一種檢測(cè)和診斷HEV的可靠方法，其不僅避免前面所述的缺點(diǎn)，又能為生物和環(huán)境樣品的HEV檢測(cè)提供一種更為靈敏的分析測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種診斷方法，該方法使用一種具有高度抗原反應(yīng)性的重組病毒肽pE2，該肽來(lái)源于戊型肝炎病毒(HEV)基因組的ORF2的羧基末端區(qū)域，已證明該多肽與正在感染或感染過HEV的病人的血清有很高的反應(yīng)性。另外，pE2肽的部分氨基酸序列在其它HEV分離株中高度保守，從而與戊型肝炎病毒具有抗原相關(guān)性。正如本發(fā)明所描述及進(jìn)一步說明的，pE2肽的抗原特性使它成為HEV感染的免疫和預(yù)防疫苗的極佳候選者。相應(yīng)地，本發(fā)明提供應(yīng)用新的pE2肽檢測(cè)HEV感染的診斷方法，以及包含pE2肽的有效預(yù)防HEV感染的疫苗組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種戊型肝炎病毒(HEV)肽pE2，由于其存在的構(gòu)象型抗原決定簇只有當(dāng)pE2單體二聚化形成同型二聚體的時(shí)候才暴露出來(lái)，因此與感染了戊型肝炎病毒的個(gè)體的血清有高度的免疫反應(yīng)性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種改進(jìn)的、更為可靠的診斷方法，通過檢測(cè)臨床或生物測(cè)試樣品中的IgM和IgG抗體來(lái)測(cè)定現(xiàn)在的以及過去的HEV感染。因?yàn)閜E2二聚體結(jié)合HEV抗體的高度特異性和敏感性，其中摻入了pE2二聚體為一種免疫試劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種監(jiān)測(cè)和檢測(cè)公共衛(wèi)生和環(huán)境研究的、改進(jìn)的以及更可靠的診斷方法，該方法用針對(duì)pE2二聚體的高度特異性的抗體，能有效地捕獲、分離和濃縮測(cè)試樣品中的HEV顆粒，避免了其它傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種疫苗組合物，其中包含pE2二聚體，其用途在于HEV感染的免疫和預(yù)防。
如表1所示，雖然不同HEV分離株之間的核苷酸同源性在77％至100％之間，這些突變?cè)谧匀唤缰型ǔＪ潜Ｊ氐模浒被嵝蛄芯哂懈叨韧葱?。HEV不同分離株之間顯示的HEV基因組保守性提示(1)pE2肽可能是HEV結(jié)構(gòu)蛋白的一個(gè)重要的功能域；(2)摻入pE2肽的診斷測(cè)試在檢測(cè)HEV不同分離株時(shí)可能具有優(yōu)越性；(3)由pE2肽制備的疫苗可能對(duì)不同的HEV分離株都具有保護(hù)性。
表1 HEV主要結(jié)構(gòu)蛋白的一個(gè)保守區(qū)域序列同源性(％)毒株 區(qū)域核苷酸氨基酸 參考文獻(xiàn)D11092中國(guó)100 100 Aye等人，1992D10330中國(guó)92.6 98.6Aye等人，1993L25547中國(guó)94.1 99.5Yin等人，1994M73218緬甸92.9 100 Tam等人，1991M74506墨西哥 78.2 94.3Purdy等人，1999M80581巴基斯坦98.3 100 Tsarev等人，1992M94177中國(guó)98.6 99.5Bi等人，1994X98292印度89.7 99 Donati等人，1997M74506墨西哥 78.2 94.3Huang等人，1992AF035437 美國(guó)76.7 92.9Schlauder等人，1998根據(jù)本發(fā)明，提供了一種具高度免疫反應(yīng)性的病毒肽pE2，其來(lái)源于戊型肝炎病毒(HEV)基因組的ORF2的羧基末端區(qū)域，包括如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。pE2肽的一個(gè)特殊特征是它擁有的構(gòu)象型抗原決定簇，只有在肽的單體間非共價(jià)相互作用而自然形成同源二聚體后才暴露出來(lái)。而且，本發(fā)明提供這個(gè)高度免疫反應(yīng)性的結(jié)構(gòu)性pE2肽的克隆和表達(dá)，以及其純化和特性的描述。
本發(fā)明涉及的HEV肽，pE2，來(lái)源于上述HEV主要結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)域，該主要結(jié)構(gòu)蛋白直接參與病毒衣殼的組裝。從ORF2核苷酸序列的羧基區(qū)域翻譯出來(lái)，pE2肽最初有267個(gè)氨基酸殘基，在長(zhǎng)度上與全長(zhǎng)蛋白的羧基端區(qū)域一致。基于相似的多肽圖譜研究(Khudyakov等人，1993；Khudyakov等人，1994)，認(rèn)為在多肽的氨基和羧基端都有線性表位。但是，在克隆序列中的移碼突變導(dǎo)致在原來(lái)cDNA序列的上游出現(xiàn)一個(gè)新的終止密碼，而使翻譯提前終止，產(chǎn)生一個(gè)只有213個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的小肽(圖2)。
pE2肽的性質(zhì)研究表明，在其羧基端的截短有效地去除了抑制病毒樣顆粒自組裝的羧基區(qū)域。其結(jié)果是pE2肽單體之間通過二聚體化而相互作用，因而天然產(chǎn)生了同型二聚體。pE2肽的二聚體形式被HEV反應(yīng)性人血清強(qiáng)烈識(shí)別，提示同型二聚體可能模擬了HEV衣殼蛋白的某種結(jié)構(gòu)特征。因此，pE2肽的二聚體化而帶來(lái)的構(gòu)象型抗原決定簇使其與其他研究者報(bào)導(dǎo)的細(xì)菌表達(dá)的HEV多肽區(qū)別開來(lái)(Yarbough等人，1991；Purdy等人，1992；Li等人，1994；Li等人，1997)。以前報(bào)道的HEV多肽的抗原活性主要在于它們各自的一級(jí)結(jié)構(gòu)的線性表位，而本發(fā)明的pE2肽的抗原活性主要與同型二聚體的四級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。相應(yīng)地，pE2肽的抗原區(qū)域明顯不同于上述存在于ORF2區(qū)域的氨基端的線性表位，因?yàn)橐郧皬奈从羞^類似的構(gòu)象型抗原決定簇的描述或多肽圖譜推測(cè)。
如本文證明及描述，在新的pE2肽中存在兩種不同類型的抗原活性。第一種類型的抗原活性與pE2肽的單體形式相關(guān)，它與迄今為止描述的其它細(xì)菌表達(dá)的HEV抗原多肽具有相似的活性類型(Yarbough等人，1991；Purdy等人，1992；Li等人1994)。這種類型的抗原活性主要來(lái)自于位于各種多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的線性表位，其活性可能受到各種多肽在水溶液中不同構(gòu)象如二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響(Li等人，1997)。但是pE2肽的第二種也是更突出的抗原活性是與多肽的二聚體形式相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)它比其單體形式具有更高的免疫反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)研究表明，pE2二聚體與HEV人的血清的抗體反應(yīng)水平通常比pE2單體的反應(yīng)水平高很多。這種新型的抗原活性，到目前為止未見報(bào)道，其抗原活性主要在于pE2同型二聚體的新的構(gòu)象型抗原決定簇。而且，當(dāng)二聚體解聚時(shí)其抗原活性下降，一旦單體重新形成二聚體，其活性亦得到恢復(fù)。這種行為表明與構(gòu)象型抗原決定簇相關(guān)的抗原活性，與pE2二聚體的形式或四級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)，而pE2二聚體或四級(jí)結(jié)構(gòu)是來(lái)自pE2單體之間的非共價(jià)相互作用形成的同型二聚體。
E2的DNA序列根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種純化的核酸分子E2，編碼構(gòu)象型肽pE2，包括其cDNA序列(見SEQ ID NO1)，以及其它任何同源的序列或片段。
E2核苷酸序列最初分離自戊型肝炎病毒(HEV)中國(guó)株D11092的HEV基因組的ORF2區(qū)域的羧基末端(圖2)。最初克隆的序列包含811個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度，分布于6326至7136位核苷酸之間，在7127-7129位帶有一個(gè)終止密碼，在6957位包含一個(gè)單堿基對(duì)的無(wú)意刪除，推測(cè)是由PCR擴(kuò)增錯(cuò)配引起(圖2)。結(jié)果導(dǎo)致移碼突變使得核苷酸序列的翻譯在一個(gè)新的終止密碼(位于6966-6968)處提前終止。核苷酸序列的翻譯導(dǎo)致產(chǎn)生和發(fā)現(xiàn)了新的pE2肽和新的E2核苷酸序列(即SEQ ID NO1)，編碼區(qū)包括642個(gè)堿基對(duì)。相應(yīng)地，參照?qǐng)D2，新的E2核苷酸序列位于6326-6968位堿基，其中位于新的終止密碼下游即6968位之后的序列片段被去除，在6957位發(fā)生了一個(gè)單堿基對(duì)刪除。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不只一個(gè)密碼可編碼序列SEQ ID NO2(即E2)的任何一個(gè)氨基酸殘基，因此除了序列SEQ ID NO1(即E2)之外，還可以產(chǎn)生很多種不同的核酸序列，它們同樣編碼pE2肽。相應(yīng)地，本發(fā)明包括任何一種核苷酸序列的突變型，這些突變型可以基于可能的密碼子選擇而合成，還包括SEQID NO1的互補(bǔ)核苷酸序列。這些化合物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的三聯(lián)體遺傳密碼制備，如同pE2肽核苷酸序列所用的標(biāo)準(zhǔn)的三聯(lián)體遺傳密碼，所有這些突變型都認(rèn)為被特別公開。
而且，可被制備的多種pE2肽衍生物或抗原性等同物，包括例如各種替換、插入、刪除或延長(zhǎng)，其最終結(jié)果不改變pE2肽的免疫反應(yīng)性。因此，編碼具pE2肽免疫學(xué)活性衍生物的核苷酸序列也是本發(fā)明的一部分。制備這些衍生物的方法可能很容易地通過任何本領(lǐng)域的普通技術(shù)而實(shí)現(xiàn)(Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室印刷，Plainview，NY，1989)。根據(jù)本發(fā)明，編碼pE2肽或抗原性等同物質(zhì)的氨基酸序列的任何核苷酸序列，能夠用于產(chǎn)生表達(dá)pE2的重組分子。
pE2氨基酸序列根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種構(gòu)象型的HEV多肽抗原pE2，包括一種SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者其同源序列、片段、或其類似物。
已知確定一種多肽三維結(jié)構(gòu)的信息完全存在于其氨基酸序列。而且，包含決定特異構(gòu)象性表位氨基酸的序列各部分可能廣泛地分散在整個(gè)分子中，之間為間隔序列。基于推測(cè)的多肽的三級(jí)(和四級(jí))結(jié)構(gòu)，構(gòu)象型表位的三維坐標(biāo)因?yàn)槎嚯囊患?jí)結(jié)構(gòu)的三維折疊而最終形成其正確結(jié)構(gòu)。相應(yīng)地，預(yù)計(jì)氨基酸序列可以進(jìn)行一定程度的、基于多肽結(jié)構(gòu)組織高水平的改造，這種改造基本上不會(huì)改變多肽的構(gòu)象型結(jié)構(gòu)和免疫化學(xué)反應(yīng)性。因此，位于決定不同表位的殘基基團(tuán)之間的多肽片段即這些間隔序列，其內(nèi)部的延伸、刪除、插入、殘基替換，可能不會(huì)顯著改變表位的形成。
此外，根據(jù)一種序列包含的氨基酸殘基的化學(xué)特性決定一個(gè)特殊的表位，用具有相似功能基團(tuán)的殘基替換可能不會(huì)改變多肽的免疫化學(xué)反應(yīng)性。考慮到這點(diǎn)，預(yù)計(jì)只要pE2肽的免疫化學(xué)反應(yīng)性保留，仍然能被抗pE2抗體識(shí)別，氨基酸序列中的多種氨基酸可以被刪除、插入或用其它氨基酸殘基替換，而得到衍生物。當(dāng)然這是假設(shè)組合的特殊改變?cè)谄鋺?yīng)用上提供了優(yōu)越性，如涉及不同的HEV分離株(表1)之間的株與株之間差異。此外，本發(fā)明范圍預(yù)期的氨基酸替換指那些替換殘基的化學(xué)性質(zhì)與原來(lái)的氨基酸相似。基于其功能基團(tuán)，一般認(rèn)為氨基酸有相似的化學(xué)特征，因此包括組合如Gly/Ala；Asp/Glu；Asn/Gln；Val/Ile/Leu；Ser/Thr；Lys/Ary；和Phe/Tyr。這些pE2肽衍生物可能還包括SEQ ID NO2決定的氨基酸序列的延伸、替換、插入和/或刪除，只要它們對(duì)HEV抗體的免疫化學(xué)反應(yīng)性保留。當(dāng)多肽能被抗pE2肽的相同抗體所識(shí)別，亦可認(rèn)為二者有相同的免疫化學(xué)反應(yīng)性且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
pE2肽的制備本發(fā)明的pE2肽通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，并提供目的蛋白的構(gòu)象型表位，這些方法包括化學(xué)合成法和重組DNA技術(shù)。制備pE2肽的優(yōu)選方法是在一種宿主細(xì)胞中表達(dá)重組DNA，然后分離純化多肽。根據(jù)本發(fā)明，編碼pE2肽、多肽片段、融合蛋白或其它功能等同物的核苷酸序列，可能用于重組DNA分子，并在合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)pE2肽的表達(dá)。為了表達(dá)一種具免疫學(xué)活性的pE2肽，編碼pE2的核苷酸序列(即SEQ ID NO1)，或編碼其功能等同物的核苷酸序列，被插入到一種合適的表達(dá)載體，此載體帶有插入編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件。根據(jù)所選擇的宿主細(xì)胞，表達(dá)載體一般含有影響DNA序列表達(dá)的DNA調(diào)控元件，通常包括一種啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始和終止位點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
因此根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種本發(fā)明制備pE2肽的方法，包括從HEV基因組中分離cDNA序列，將此cDNA序列插入到一種能在合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體，然后用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞，以及分離和純化pE2肽。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知的方法，可用于構(gòu)建含有pE2編碼序列的表達(dá)載體，以及合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件。上述獲得的目的cDNA序列可以用已知及標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)插入到一種表達(dá)載體(Sambrook等人，1989 and Ausubel等人，1989)。表達(dá)載體通常用限制性內(nèi)切酶切割，cDNA序列用平端或粘端連接插入。通常是在表達(dá)載體的方便位置的限制性位點(diǎn)進(jìn)行切割，一旦插入，該cDNA序列即位于影響其表達(dá)的cDNA功能元件的控制之下。宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)以及多肽的分離也可以用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)行。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)要表達(dá)的目的多肽或蛋白來(lái)選擇多種表達(dá)載體。例如，當(dāng)需要表達(dá)大量的多肽或蛋白用以產(chǎn)生抗體時(shí)，需選擇能達(dá)到高的融合蛋白表達(dá)水平且易于純化的載體。根據(jù)本發(fā)明的相關(guān)方面，提供一種帶有E2核酸序列(如SEQ ID NO1所示)表達(dá)載體，該核酸序列編碼pE2肽，該載體能表達(dá)E2核酸序列。該表達(dá)載體適于在一種細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)，以大腸桿菌為佳，包括但不限于多功能的大腸桿菌克隆和表達(dá)載體pGEX(Promega，Madison，威斯康星州)。在這個(gè)特殊的載體中，pE2編碼序列在其5’端被符合讀框地連接到載體中谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)異源序列的3’端，得到的雜合多聚核苷酸序列表達(dá)為融合蛋白。通常，這種融合蛋白是可溶性的，而且通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠，然后用自由谷胱甘肽洗脫而從裂解細(xì)胞中純化出來(lái)。這種系統(tǒng)制備的蛋白被設(shè)計(jì)成包含了剪切位點(diǎn)，因此克隆的目的多肽可能通過加入合適的蛋白酶如凝血酶而從GST部分釋放出來(lái)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，提供一種表達(dá)融合蛋白GE2的質(zhì)粒，GE2包括HEV肽pE2(序列為SEQ ID NO2)，其融合于谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)多肽。將E2核酸序列(SEQ ID NO1所示)插入一種pGEX20表達(dá)載體，使E2核苷酸序列的開放讀碼框架與GST的開放讀碼框架相符合。本發(fā)明的質(zhì)粒包括位于6326-7136位的811個(gè)堿基對(duì)的序列(圖2)，終止密碼位于7127-7129位。但是，推測(cè)由于PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤引起的在6957位的單一堿基對(duì)的刪除，導(dǎo)致移碼突變，引起核苷酸序列的翻譯在一新的終止密碼子(6966-6968位)處提前終止，結(jié)果產(chǎn)生新的pE2肽。相應(yīng)地，這一新的E2序列分布于6326-6968位，在6957位有一單堿基對(duì)刪除，在6968位之后、新終止密碼下游的片段被去除(圖2)。克隆的E2序列編碼新的pE2肽，有642個(gè)堿基對(duì)，其序列確定為SEQ ID NO1。
GE2蛋白分離的GE2融合蛋白質(zhì)，含有完整的、融合于全長(zhǎng)GST多肽的pE2肽，共約92kD。但是，本發(fā)明的GE2融合蛋白質(zhì)可以含有pE2肽的較小部分，該部分仍具有免疫原性，因此GE2融合蛋白質(zhì)預(yù)計(jì)可以小于92kD。本文描述的融合蛋白質(zhì)GE2，在pE2氨基酸序列和GST或異源物、蛋白序列之間含有一個(gè)剪切位點(diǎn)，將融合蛋白結(jié)合于谷胱甘肽葡聚糖4B柱，再用凝血酶剪切，使得pE2肽從異源物中純化出來(lái)。而且，除了純化和表征目的，GE2多肽也用于在合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)和確證pE2肽的表達(dá)，以及制備針對(duì)pE2肽表位的特異多克隆抗血清或單克隆抗體。反過來(lái)，用分離的GE2多肽免疫哺乳動(dòng)物制備的多克隆抗血清或單克隆抗體，有利于測(cè)定生物學(xué)測(cè)試樣品中HEV顆粒的存在。
pE2作為一種診斷試劑此處提供的構(gòu)象型pE2肽可以在診斷測(cè)定中用作免疫試劑，用于篩選生物學(xué)測(cè)試樣品中的HEV抗體的存在，幫助從業(yè)者或臨床醫(yī)生檢測(cè)或診斷HEV感染。相應(yīng)地，本發(fā)明提供用pE2肽檢測(cè)生物學(xué)測(cè)試樣品中抗HEV抗體的免疫化學(xué)方法。本質(zhì)上，可以應(yīng)用任何一種免疫檢測(cè)形式，其設(shè)計(jì)都是用pE2作為一種捕獲抗原來(lái)檢測(cè)抗HEV抗體。進(jìn)行免疫檢測(cè)的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，本發(fā)明不限于任何一種特定的免疫測(cè)定?？梢杂糜诰嗪头蔷嗝庖邷y(cè)定。
通常而言，懷疑帶有HEV抗體的生物學(xué)測(cè)試樣品與pE2肽接觸，并在允許反應(yīng)發(fā)生的條件下孵育一段時(shí)間。pE2肽最好連在一種合適的固相支持物上。如果HEV抗體存在于測(cè)試樣品中，它們將與pE2肽形成一種免疫學(xué)復(fù)合物(抗原-抗體復(fù)合物)，并連在固相支持物上?？梢赃x擇用緩沖洗滌液洗滌固相支持物，去除任何未結(jié)合的成分，這樣在一定程度上可以幫助提高檢測(cè)的敏感度。洗滌之后，免疫學(xué)復(fù)合物與一種指示試劑反應(yīng)，并在第二種復(fù)合物形成的條件下孵育一定時(shí)間。免疫學(xué)復(fù)合物可以用任何一種已知的技術(shù)檢測(cè)，依測(cè)定形式的不同而異。例如，一種抗哺乳動(dòng)物免疫球蛋白與一種標(biāo)記或產(chǎn)生信號(hào)的成分(如一種酶)的偶聯(lián)物通常用作指示劑。免疫學(xué)復(fù)合物的存在證明了測(cè)試樣品中抗HEV抗體的存在，并通過檢測(cè)產(chǎn)生的信號(hào)而確定。對(duì)很多種指示劑而言，抗體存在的量通常與產(chǎn)生的信號(hào)成比例。測(cè)試樣品中免疫復(fù)合物的存在可以直觀地或機(jī)械地檢測(cè)，如用自動(dòng)化掃描和解釋裝置。
合適的固相支持物將依賴于所采用的免疫檢測(cè)形式的類型，但是期望選擇的支持物類型有合理的強(qiáng)度而且不會(huì)干擾免疫學(xué)復(fù)合物的免疫反應(yīng)性，也不會(huì)從產(chǎn)生信號(hào)的成分中產(chǎn)生出可檢測(cè)的信號(hào)。固相支持的例子包括微孔反應(yīng)板的壁、試管、薄片(sheets)、平板、載玻片、珠子(如聚苯乙烯或玻璃)、硝酸纖維條或膜、小顆粒如乳膠顆粒、玻璃或塑料芯片，以及其它。
用于檢測(cè)一種免疫復(fù)合物形成的標(biāo)記或產(chǎn)生信號(hào)的成分，將允許通過沉淀的產(chǎn)生或顏色變化而進(jìn)行直觀檢測(cè)，也可以通過顯微鏡直觀檢測(cè)，或者通過光譜測(cè)定、放射測(cè)定而自動(dòng)檢測(cè)，或者類似的檢測(cè)方法。產(chǎn)生信號(hào)的成分的例子包括膠體金、熒光化合物、發(fā)光化合物、一種染料、放射性元素、酶(如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶和β半乳糖苷酶)以及增強(qiáng)化合物(如生物素、抗生物素和親和素)。
相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面提供一種生物測(cè)試樣品中HEV抗體的診斷或檢測(cè)方法，包括以下步驟●提供一種pE2肽，其包括由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或同源序列、片段或其類似物，其特征在于pE2肽被優(yōu)選地固定于一種固相支持物上；●在允許pE2肽和抗HEV抗體之間形成免疫復(fù)合物(抗原-抗體)的條件下，使pE2肽與生物學(xué)測(cè)試樣品接觸并孵育；●可能地從得到的混合物中去除未結(jié)合的成分；●將得到的混合物與一種指示劑孵育；●檢測(cè)混合物以確定免疫學(xué)復(fù)合物的存在，由免疫學(xué)復(fù)合物的形成表明測(cè)試樣品中抗戊型肝炎病毒(HEV)抗體的存在。
抗pE2肽抗體的產(chǎn)生本文所描述的方法和實(shí)例進(jìn)一步證明，因?yàn)閜E2肽呈現(xiàn)出的高度免疫化學(xué)反應(yīng)性，與pE2肽特異反應(yīng)的抗體可以通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)產(chǎn)生。因?yàn)楸景l(fā)明的pE2肽的構(gòu)象型抗原決定簇模擬了HEV衣殼蛋白的相似結(jié)構(gòu)特征，pE2肽可用于產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體。而且，這些針對(duì)pE2肽的抗體或其它片段，作為有價(jià)值的免疫試劑，可通過分離和篩選病毒顆粒和/或抗原而證明HEV感染，在診斷測(cè)試的研究中有重要用途。因此，抗pE2抗體可用于很多臨床診斷程序，包括傳統(tǒng)的在生物學(xué)樣品中檢測(cè)HEV抗原存在的免疫檢測(cè)方法，以及小樣品中HEV病毒顆?？杀环蛛x和濃縮的免疫捕獲法。(Harlowand Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，1988，Cold SpringsHarbor Laboratory Press)。
如果期望得到針對(duì)本發(fā)明pE2肽的多克隆抗體，則將肽注射到一種選擇的非人的哺乳動(dòng)物宿主(如小鼠、大鼠、綿羊、兔、山羊，等)中，肽最好與一種載體偶聯(lián)以提高免疫反應(yīng)，將產(chǎn)生的抗體進(jìn)行回收和純化。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物用上述帶有HEV構(gòu)象表位的GE2多肽免疫。GE2多肽是以一種可注射的制劑形式施用，因此GE2是與一種生理學(xué)上可接受的稀釋液混合。佐劑，如福氏完全或不完全佐劑，可以包括在制劑中。制劑注射到宿主后，經(jīng)過一段合適的時(shí)間，在合適的間隔期采集血漿樣品以檢測(cè)HEV病毒的抗體。當(dāng)獲得合適水平的活性時(shí)，采集宿主的全血。然后用標(biāo)準(zhǔn)程序如免疫親和層析，從血漿中回收及純化抗體。
雖然優(yōu)選本發(fā)明的多克隆抗體，帶有多種單克隆抗體的系統(tǒng)，其功能與多克隆抗體系統(tǒng)相同，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。針對(duì)HEV構(gòu)象型表位的單克隆抗體也能夠由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地用本發(fā)明的GE2多肽產(chǎn)生。用永生的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系—通常叫作雜交瘤，產(chǎn)生單克隆抗體的一般方法是從所周知的。雜交瘤可以通過融合產(chǎn)生抗pE2抗體的細(xì)胞與一種永生的細(xì)胞而產(chǎn)生，永生的細(xì)胞賦予雜交細(xì)胞以長(zhǎng)期組織培養(yǎng)的能力。在雜交細(xì)胞的形成中，第一融合伴侶--產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，可以是一種接種了GE2多肽的非人的哺乳動(dòng)物宿主(如大鼠或小鼠)的脾細(xì)胞。經(jīng)過足夠的時(shí)間，當(dāng)宿主達(dá)到高水平的抗體反應(yīng)時(shí)，摘除產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。一種永生化的細(xì)胞系(如大鼠或小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系)的細(xì)胞，與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞融合，接下來(lái)進(jìn)行融合篩選以識(shí)別一種細(xì)胞系如雜交瘤，能分泌期望的單克隆抗體。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與永生細(xì)胞的融合可以用標(biāo)準(zhǔn)的程序完成(Kohler and Milstein，(1975)Nature(London)256，495-497；Kennet，R.，(1980)in Monoclonal Antibodies(Kennet等人，Eds.pp.365-367，Plenum Press，NY)。融合細(xì)胞系可以進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中篩選和純化抗pE2的單克隆抗體與回收多克隆抗體具有相似的方法。
此外，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種產(chǎn)生抗HEV抗原的純化抗體的方法，其中具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的構(gòu)象型HEV肽pE2，或者同源序列、片段或其類似物以有效劑量被注射到一種非人的哺乳動(dòng)物宿主中，收集產(chǎn)生的抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的重組融合蛋白GE2，被注射到非人的哺乳動(dòng)物宿主中以產(chǎn)生期望的抗體?？筽E2抗體用作捕獲試劑用本發(fā)明的pE2肽產(chǎn)生的單克隆或多克隆抗體，可以作為捕獲試劑用于免疫測(cè)定中，以檢測(cè)生物學(xué)測(cè)試樣品中HEV衣殼蛋白或病毒顆粒的存在。本質(zhì)上，可以使用任何一種免疫測(cè)定方式，其設(shè)計(jì)中都運(yùn)用了抗pE2抗體作為捕獲試劑。進(jìn)行免疫測(cè)定的方法在本領(lǐng)域從所周知，本發(fā)明不限于任何一種特殊的免疫測(cè)定。
通常，因?yàn)楸景l(fā)明的pE2肽的構(gòu)象型抗原決定簇模擬了HEV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，抗pE2抗體可以用于免疫捕獲方法來(lái)分離和濃縮HEV病毒顆粒，然后可以通過提取病毒的RNA及運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)而檢測(cè)到病毒的存在。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，免疫捕獲方法是用于分離和濃縮HEV病毒顆粒，因此抗pE2肽的抗血清被包被在聚苯乙烯片或者其它合適的固相吸附材料上。在檢測(cè)測(cè)試樣品中的小量病毒時(shí)這一方法效果很好，通過提取病毒RNA，之后立即進(jìn)行RT-PCR，最好是巢式聚合酶鏈反應(yīng)以確定病毒的有無(wú)。
合適的固相支持物或吸附材料將依賴于所采用的免疫測(cè)定形式的類型，但是期望選擇的支持物類型有合理的強(qiáng)度而且不會(huì)干擾免疫學(xué)復(fù)合物的免疫反應(yīng)性。固相支持的例子包括微孔反應(yīng)板的孔壁、試管、薄片、平板、載玻片、珠子(如聚苯乙烯或玻璃)、硝酸纖維條或膜、小顆粒如乳膠顆粒、玻璃或塑料芯片，以及其它。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面提供一種在生物學(xué)測(cè)試樣品中檢測(cè)HEV病毒顆粒(即分析物)的方法，包括以下步驟●提供一種抗pE2肽(氨基酸序列如SEQ ID NO2所示)或同源序列、片段或其類似物的純化抗體，其特征在于抗pE2抗體被優(yōu)選地固定于一種固相支持物上；●在允許抗pE2抗體和任一HEV分析物(可能存在于測(cè)試樣品中)之間形成免疫復(fù)合物的條件下，使抗pE2抗體與生物學(xué)測(cè)試樣品接觸并孵育；●可能地從得到的混合物中去除未結(jié)合的成分；●測(cè)定混合物以確定HEV分析物的存在與否。診斷檢測(cè)試劑盒本文描述的新的HEV肽pE2或抗pE2抗體一般以診斷試劑盒的形式包裝，用于HEV感染的檢測(cè)和診斷。試劑盒通常包括作為免疫試劑的pE2肽或抗pE2抗體，分裝在分開的容器中。而且，根據(jù)使用的免疫試劑和被檢測(cè)的HEV分析的類型，試劑盒可能附帶陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品、一種指示劑如標(biāo)記的抗人抗體，如果標(biāo)記不直接產(chǎn)生一種信號(hào)則附帶產(chǎn)生信號(hào)的試劑(如以酶標(biāo)記則為酶的底物)。如本文所述，術(shù)語(yǔ)”分開的容器”是指任何材料，能夠在其中裝固定量的本發(fā)明的pE2肽或抗pE2抗體，以及其它診斷試劑盒中提供的成分。試劑盒中通常還包括進(jìn)行測(cè)定的說明書。這些說明書一般描述免疫試劑的濃度，或者至少一種測(cè)定方法參數(shù)，如需混合的免疫試劑和樣品的相關(guān)量、免疫試劑和樣品混合的時(shí)間長(zhǎng)度、溫度、緩沖液條件及類似內(nèi)容。
如果需要，本發(fā)明的pE2肽或抗pE2抗體一般可以通過被動(dòng)吸附或共價(jià)偶聯(lián)而固定到一種固相支持材料上，其中可采用的很多技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是公知的。一種合適的支持物依賴于所進(jìn)行的免疫測(cè)定形式的類型，但是期望選擇的支持物類型有合理的強(qiáng)度而且不會(huì)干擾免疫學(xué)復(fù)合物的免疫反應(yīng)性，也不會(huì)從產(chǎn)生信號(hào)的成分中產(chǎn)生出可檢測(cè)的信號(hào)。固相支持的例子包括微孔反應(yīng)板的孔壁、試管、薄片、平板、載玻片、珠子(如聚苯乙烯或玻璃)、硝酸纖維條或膜、小顆粒如乳膠顆粒、玻璃或塑料芯片，以及其它。
指示劑應(yīng)該包括一種標(biāo)記或產(chǎn)生信號(hào)的成分，能夠通過本發(fā)明的免疫試劑和捕獲的HEV分析物指示免疫復(fù)合物的形成。診斷試劑盒中的指示劑可以以液體分散的溶液形式提供，或者是干粉，例如以一種凍干的形式。當(dāng)指示劑是用一種酶作為產(chǎn)生信號(hào)的成分，在診斷試劑盒的分開的容器中可以提供酶的底物。而且，用于檢測(cè)一種通過抗原抗體結(jié)合引起的免疫復(fù)合物形成的標(biāo)記或產(chǎn)生信號(hào)的成分，將允許通過沉定的產(chǎn)生或顏色變化而進(jìn)行直觀檢測(cè)，也可以通過顯微鏡直觀檢測(cè)，或者通過光譜測(cè)定、放射測(cè)定而自動(dòng)檢測(cè)，或者類似的檢測(cè)方法。產(chǎn)生信號(hào)的成分的例子包括膠體金、熒光化合物(如熒光素和羅丹明)、發(fā)光化合物、一種染料、放射性元素、酶(如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶和β半乳糖苷酶)以及增強(qiáng)化合物(如生物素、抗生物素和親和素)。
作為一檢測(cè)HEV抗體的試劑盒的例子，本發(fā)明的預(yù)先測(cè)定的一定量的pE2可以固定到反應(yīng)條的微孔中，從而能夠通過免疫反應(yīng)結(jié)合將要加入的HEV抗體。指示劑可以是標(biāo)記的哺乳動(dòng)物抗人抗體，它將識(shí)別并結(jié)合到任何一種可能存在于測(cè)試樣品中的HEV抗體。標(biāo)記的哺乳動(dòng)物抗人抗體可以用一種酶作為產(chǎn)生信號(hào)的成分，如酶不直接產(chǎn)生信號(hào)則附帶提供酶的底物。疫苗目前因?yàn)镠EV病毒不能成功地在培養(yǎng)中增殖，也就不可能產(chǎn)生減毒的HEV疫苗?，F(xiàn)在發(fā)展的候選疫苗是由真核表達(dá)產(chǎn)生的主要結(jié)構(gòu)蛋白的重組多肽(Tsarev等人，1993a；Tsarev等人，1994a)。與減毒病毒相比，在疫苗組合物中使用重組多肽的優(yōu)點(diǎn)在于，多肽的生產(chǎn)更為有效而純化更為方便。此外，得到的疫苗不可能帶有任何完整的病毒顆粒，因此避免了感染的危險(xiǎn)。
已發(fā)現(xiàn)pE2肽的二聚體形式比它的單體形式具有更強(qiáng)的免疫原性。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)研究中，抗血清由pE2肽免疫后得到，針對(duì)二聚體的抗體反應(yīng)水平基本上高于針對(duì)單體的抗體反應(yīng)水平。而且不象HEV反應(yīng)的人血清存在HEV抗體特異性的廣譜性，pE2抗血清具有HEV抗體特異性的限定譜。但是值得注意的是，pE2抗血清能夠識(shí)別和結(jié)合HEV顆粒，已證明它們能夠影響病毒免疫捕獲的有效性。建立在pE2肽的二聚體形式和病毒之間的抗原相互關(guān)系在于，pE2二聚體模擬了病毒衣殼的某種結(jié)構(gòu)特征，使它在形態(tài)上和抗原性上與HEV衣殼蛋白相關(guān)。相應(yīng)地，很有可能戊型肝炎病毒衣殼和pE2肽共享某種共同的抗原決定簇，特別是與pE2肽二聚體形式相關(guān)的新的構(gòu)象型抗原決定簇。這一論點(diǎn)與多肽的二聚體形式通常被HEV反應(yīng)的人血清強(qiáng)烈識(shí)別的發(fā)現(xiàn)相吻合。
根據(jù)pE2同型二聚體在結(jié)構(gòu)上和抗原性上與HEV衣殼蛋白相關(guān)，使得細(xì)菌表達(dá)的多肽可作為抗HEV感染的潛在疫苗。而且，不同HEV分離株(表1)的HEV基因組之間保守性進(jìn)一步提示雖然pE2肽是來(lái)自于一中國(guó)分離株，也同樣可能針對(duì)其它HEV分離株提供保護(hù)，包括最近從墨西哥和美國(guó)分離的遺傳變化最大的分離株。
此外，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種疫苗組合物，其包括pE2肽，序列如SEQ ID NO2所示，或者同源序列、片段，或其類似物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其在免疫接種后保護(hù)哺乳動(dòng)物抵抗HEV的攻擊。
而且，也提供疫苗的應(yīng)用，其用來(lái)免疫個(gè)體以抵抗戊肝病毒的感染，其中疫苗包括pE2肽的免疫學(xué)有效劑量，以及藥理學(xué)上可接受的載體。藥理學(xué)上可接受的載體對(duì)本領(lǐng)域的一般技術(shù)而言是眾所周知的(Amon，R.(Ed.)合成疫苗183-92，CPC Press，Inc.，BocaRaton，F(xiàn)l.，1987)，包括適于作為載體的液體媒介來(lái)介導(dǎo)肽進(jìn)入病人體內(nèi)，但其本身不應(yīng)引起對(duì)接受此成分的個(gè)體有害的抗體的產(chǎn)生。鹽溶液是這類液體媒介的一個(gè)例子。此外，疫苗組合物可能還含有一種佐劑，用于刺激免疫反應(yīng)而增強(qiáng)疫苗的效果。
“免疫學(xué)有效劑量”是指以單劑量或者是一系列中的一部分的形式，向受試者施用，如上定義，這一施用對(duì)治療而言是有效的。這個(gè)量依不同情況而異，如需治療的個(gè)體的健康和身體條件，個(gè)體的不同種類(如非人哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等)，個(gè)體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，需達(dá)到的保護(hù)程度，疫苗的組成，感染的HEV的株系，以及其它相關(guān)因素?？梢灶A(yù)計(jì)這一劑量將位于一個(gè)相當(dāng)廣泛的范圍，可以通過日常試驗(yàn)而確定。
通過任何一種方便的疫苗給藥方法，包括口服和非腸道(如靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))注射，本發(fā)明的疫苗都可以施用。治療由單劑量的疫苗或在一段時(shí)間內(nèi)的多劑量組成。
這些以及其它賦予本發(fā)明新穎特征的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)，在后面的權(quán)利要求中特別指出，并形成了關(guān)于此點(diǎn)的一部分。為了更好地理解本發(fā)明、其優(yōu)點(diǎn)以及應(yīng)用達(dá)到的目的，可以參考隨后的圖和描述性的材料，其中有闡明和描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
雖然任何與本文描述相似或等同的方法和材料可以用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，下面描述優(yōu)選的方法、設(shè)計(jì)以及材料。
附圖簡(jiǎn)述關(guān)于下面的描述，發(fā)明將借助伴隨闡明本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)解釋。
圖1說明HEV基因組內(nèi)部的開放讀碼框架ORF1、ORF2、ORF3的基因組結(jié)構(gòu)，以及pE2和pE3肽的編碼區(qū)的大約位置。
圖2A-2D提供中國(guó)HEV株(DDBJ Accession No.D11092)的核苷酸序列以及來(lái)源于此的E2片段；方框處示單堿基對(duì)刪除。
圖3提供中國(guó)HEV株(DDBJ Accession No.D11092)ORF3的核苷酸序列和來(lái)源于此的E3片段。
圖4提供由E2編碼的pE2肽的氨基酸序列。
圖5提供由E3編碼的pE3蛋白的氨基酸序列。
圖6顯示帶有HEV基因組序列的重組質(zhì)粒的特征。用BamHI和EcoRI消化重組質(zhì)粒pGEX20分別得到一個(gè)821bp的插入片段，其包含HEV基因組ORF2序列的810bp(泳道2)，和一個(gè)124bp的插入片段，其包含HEV基因組ORF3的114bp的序列(泳道3)。分子標(biāo)記用以比較這些產(chǎn)物的分子量(泳道3)。
圖7顯示表達(dá)自O(shè)RF2的純化HEV重組多肽的特征。(A)SDS-PAGE和(B)用GST特異的抗血清進(jìn)行Western印跡和(C)混合人HEV反應(yīng)的人血清，用于分析純化的pE2融合蛋白GE2(泳道1和2)、pE2肽(泳道3和4)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(泳道5)。另外，GE2和pE2肽樣品先加熱到100℃ 3分鐘，再用SDS PAGE(A)和Western blotting(B和C)進(jìn)行分析(泳道2和4)。分子標(biāo)記用以比較這些產(chǎn)物的分子量(泳道6)。
圖8顯示表達(dá)自HEV基因組ORF3的GST融合多肽GE3的特征。(A)PAGE和(B)用GST特異抗血清的Western印跡和(C)混合人血清，用于分析GE3多肽(泳道1)和經(jīng)100℃加熱3分鐘的GE3多肽(泳道2)以及GST(泳道3)。分子標(biāo)記用以比較這些產(chǎn)物的分子量(泳道4)。
圖9顯示pE2二聚體的抗原活性強(qiáng)度大約是pE2單體抗原活性的80倍。如下面圖10所描述的，加熱和未加熱的純化pE2的等體積樣品中，蛋白梯度含量從1.3ng到1360ng，用混合HEV反應(yīng)性人血清以1∶200稀釋進(jìn)行Western印跡分析。通過混合血清檢測(cè)pE2單體的最小量是1360ng，比相同條件下檢測(cè)到的pE2二聚體的最小量(86ng)高了16倍。在限定濃度對(duì)二聚體的反應(yīng)性估計(jì)至少比單體限定濃度的反應(yīng)強(qiáng)5倍。因此，綜合而言，pE2二聚體的抗原反應(yīng)性估計(jì)比pE2單體強(qiáng)80倍。
圖10顯示在其二聚體和單體形式中重組pE2肽的不同抗原性。含有1300ng純化的pE2樣品被加熱到100℃3分鐘以分解多肽的二聚體形式為單體形式。加熱的樣品以等比例與純化的未加熱的pE2混勻。多肽的23kDa單體和42kDa二聚體形式用SDS PAGE分離并轉(zhuǎn)移至膜上。將膜剪成條狀進(jìn)行Western印跡分析。以1∶50稀釋的血清進(jìn)行測(cè)試，有8份血清同時(shí)與pE2單體和二聚體反應(yīng)，而其余10份血清只與pE2二聚體反應(yīng)。
圖11顯示在4℃(泳道1)、20℃(泳道2)、37℃(泳道3)、45℃(泳道4)用8M尿素處理純化的pE2 1小時(shí)。同樣的純化pE2樣品用8M尿素在45℃處理1小時(shí)后，對(duì)1×PBS透析過夜(泳道5)。5個(gè)樣品進(jìn)行(A)PAGE和(B)用混合HEV反應(yīng)人血清進(jìn)行Western印跡分析。
圖12顯示在純化的pE2或GE3反應(yīng)的3種人血清類型中，用ELISA法測(cè)定比較其中IgG抗體的水平。在微孔板中以預(yù)先測(cè)定的理想濃度包被純化的pE2或GE3，然定檢測(cè)這些血清中含有的IgG抗體的滴度水平。多肽的制備物用SDS PAGE(左泳道)分析，用1∶100的稀釋血清進(jìn)行Western印跡測(cè)定。對(duì)相應(yīng)的重組多肽，人血清出現(xiàn)強(qiáng)反應(yīng)(實(shí)心圓)、弱反應(yīng)(陰影圓)或不反應(yīng)(空心圓)?？贵w水平確定為血清稀釋度的倒數(shù)，血清稀釋度的OD值需高于閾值OD0.37。
圖13顯示由ELISA測(cè)定的96份非甲、非乙、非丙型肝炎病人血清中IgG抗體的分布水平，對(duì)純化的pE2或GE3分別表現(xiàn)為強(qiáng)反應(yīng)(實(shí)心條)、弱反應(yīng)(陰影條)和不反應(yīng)(空心條)。每一份血清樣品用1∶100稀釋血清進(jìn)行Western印跡測(cè)定，以及用包被了純化的pE2的微孔板進(jìn)行ELISA分析?？贵w的水平由OD證明，而血清對(duì)多肽的反應(yīng)性根據(jù)反應(yīng)的強(qiáng)度評(píng)估。
圖14顯示從疾病開始HEV抗體的時(shí)間分布。用各自的HEV多肽進(jìn)行ELISA，測(cè)定96份96份非甲、非乙、非丙型肝炎病人血清中，pE2特異的IgG(A)和IgM(B)以及pE3特異的IgG(C)和IgM(D)抗體。得到的結(jié)果與疾病開始以后取得這些血清的時(shí)間長(zhǎng)度進(jìn)行比較。pE2 IgG、IgM的閾OD值(虛線)分別為0.52、0.57，GE3 IgG、GE3 IgM的閾OD值(虛線)分別為1.05、0.74。
圖15顯示通過不同HEV特異性的三種ELISA確定抗體的反應(yīng)。使用商用試劑(GeneLabs Diagnostics Pte Ltd.，Singapore)，對(duì)96份非甲、非乙、非丙型肝炎病人血清中的74份進(jìn)一步進(jìn)行HEV特異抗體的測(cè)定。將得到結(jié)果與GE3特異(A、B和C)或pE2特異(A和D)測(cè)定得到的結(jié)果相比較。前面進(jìn)行的Western印跡顯示，這些血清中的32份對(duì)pE2和GE3有反應(yīng)(A和D)，14份只與pE2有反應(yīng)(B和E)，還有40份不與二者反應(yīng)(C和F)。商用試劑測(cè)定的閾OD值是0.6，pE2特異的IgG閾OD值是0.52，GE3特異的閾OD值IgG是1.05(虛線)。
圖16顯示用包被了針對(duì)純化pE2的抗血清的聚苯乙烯片來(lái)特異性地免疫捕獲HEV?？寡迨莵?lái)自圖19描述的動(dòng)物M1，以1∶100稀釋，包被聚苯乙烯片。片分別在帶有HEV(泳道2)、HAV(泳道3)、杯狀病毒(泳道4和5)或腸道病毒(泳道6)的溶液中浸泡過液。然后去掉溶液，用緩沖液徹底洗滌4次。提取結(jié)合于片的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將cDNA用相應(yīng)病毒的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分子標(biāo)記用以比較這些產(chǎn)物的分子量(泳道1)。
圖17顯示從圖18描述的動(dòng)物M1取得一種pE2特異的抗血清(A)或免疫前的血清(B)，分別用二者包被聚苯乙烯片，用于免疫捕獲HEV，然后與4.5ml帶有HEV、經(jīng)系列稀釋的膽汁樣品反應(yīng)。經(jīng)過洗滌后，結(jié)合于片上的HEV顆粒用RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。分子標(biāo)記用以比較這些產(chǎn)物的分子量(左泳道)。
圖18顯示短尾猴(Macaque monkeys)對(duì)純化pE2免疫的反應(yīng)而產(chǎn)生的pE2抗體。3只猴子(M1、M2和M3)每星期分別用100ug純化的pE2進(jìn)行免疫，共4次。3只對(duì)照的猴子(M5、M7和M8)用安慰劑進(jìn)行同樣操作。免疫完成后的兩個(gè)星期，兩組猴子都用等劑量的105基因組當(dāng)量的HEV進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，繼續(xù)觀察動(dòng)物7個(gè)星期。每星期采集血清樣品，用ELISA測(cè)定分析抗pE2抗體的存在。
圖19顯示在短尾猴未感染HEV之前，用制備的pE2肽進(jìn)行免疫，然后收集血清分析HEV的抗體譜。每星期分別用帶100ug純化pE2的制備物注射3只成年猴(M1、M2和M3)，共4次。在最后一次注射后的2星期收集血清，進(jìn)行4倍遞增的系列稀釋，用純化的pE2的單體(100℃加熱3分鐘)和二聚體(未加熱)的等量混和物進(jìn)行Western印跡測(cè)定。來(lái)自M1的免疫血清在1∶4,000至1∶256,000之間的4倍系列稀釋后進(jìn)行測(cè)定(泳道1-4)；來(lái)自M2的免疫血清在1∶100至1∶6,400之間的稀釋后進(jìn)行測(cè)定；來(lái)自M3的免疫血清在1∶250至1∶16,000之間進(jìn)行測(cè)定。免疫前的血清用為陰性對(duì)照以1∶100測(cè)定(泳道5)(A)。來(lái)自這些動(dòng)物的免疫前和免疫后的血清以及陽(yáng)性對(duì)照血清P，進(jìn)一步以1∶100稀釋，進(jìn)行Western印跡測(cè)定，抗原為GE3即30kDa的帶pE3多肽的GST融合蛋白，同時(shí)用商用試劑盒(北京醫(yī)科大學(xué)，北京)進(jìn)行ELISA測(cè)定。生產(chǎn)者建議ELISA的閾OD值由虛線所示。
圖20顯示戊肝病毒的攻擊基因組劑量。用1ml 1∶100稀釋的貯存HEV接種動(dòng)物。接種病毒的基因組劑量由病毒制備物的系列稀釋的等份樣品，經(jīng)RT-PCR確定。這里所說的病毒制備物在”材料和方法”部分描述。
圖21顯示HEV攻擊的抗體反應(yīng)。在HEV攻擊之前及之后的指定時(shí)間，立即從免疫了的(M1、M2、M3)和未免疫的對(duì)照動(dòng)物(M5、M7、M8)獲得血漿樣品。血清樣品以及陽(yáng)性P、陰性N對(duì)照人血清樣品，用純化的pE2和pE3進(jìn)行Western印跡測(cè)定，同時(shí)用商用試劑盒(Genelabs Diagnostics Pte Ltd.，新加坡)進(jìn)行ELISA測(cè)定。
發(fā)明詳述除非另外說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所共同理解的相同意義。通常，在下面描述的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳和核酸化學(xué)中所用的術(shù)語(yǔ)和實(shí)驗(yàn)方法，在本領(lǐng)域中是眾所周知且普遍應(yīng)用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組核酸方法、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化。通常，酶反應(yīng)和純化步驟根據(jù)生產(chǎn)者的說明進(jìn)行。一般進(jìn)行的技術(shù)和方法是根據(jù)本領(lǐng)域傳統(tǒng)的方法和各種一般文獻(xiàn)(Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室印刷，Plainview，NY，1989)進(jìn)行。如本文通篇所用，下列術(shù)語(yǔ)除非另外說明，應(yīng)該理解為以下含義生物學(xué)測(cè)試樣品指?jìng)€(gè)體身體的一個(gè)部分，這個(gè)部分是目的分析物的來(lái)源。測(cè)試樣品的例子包括但不限定于，人和動(dòng)物身體的流體如全血、血清、血漿、腦脊髓液、白血細(xì)胞、腸道分泌物、尿液和淋巴液。
E2是克隆的cDNA片段，如圖2描述，它位于中國(guó)HEV株(DDBJAccession No.D11092)基因組的6326-6968位，在6957位含有一個(gè)單堿基對(duì)的刪除。
pE2是由E2編碼的肽(即SEQ ID NO2)E3是克隆的cDNA片段，如圖3描述，它位于中國(guó)HEV株(DDBJAccession No.D11092)基因組的5364-5477位。
pE3是如圖4描述的由E3編碼的多肽。GE2是一種融合蛋白，其中pE2的氨基端與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的羧基端相連。
GE3是一種融合蛋白，其中pE3的氨基端與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的羧基端相連。
戊型肝炎病毒(HEV)是一單股正鏈RNA病毒，形態(tài)上與杯狀病毒的成員相似。能引起肝炎的散發(fā)發(fā)病或地方暴發(fā)，在血清學(xué)上不同于甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和丁肝病毒(HDV)。
同型二聚體是由兩個(gè)相同的單體形成的分子。
同型序列是一種核酸或氨基酸序列，分別與E2核苷酸序列或pE2氨基酸序列(確定為SEQ ID NL1或2)有至少80％，甚至90％的序列等同。I HEV基因組序列圖2A-2D和圖3中闡明的HEV基因組序列分別對(duì)應(yīng)于ORF2和ORF3區(qū)域。類似地，圖4和5中所示的多肽序列分別對(duì)應(yīng)于來(lái)自O(shè)RF2和ORF3區(qū)域的基因產(chǎn)物。相應(yīng)地，所列出來(lái)的基因組序列如下SEQ ID NO.1是來(lái)自于ORF2的、克隆的DNA片段E2的核苷酸序列。SEQ ID NO.2是多肽pE2的氨基酸序列。SEQ ID NO.3是下游引物ORF2Rb(參見表9)的核苷酸序列。II HEV多肽pE2和pE3從HEV基因組中表達(dá)pE2和pE3多肽用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，從HEV中國(guó)株D11092基因組內(nèi)ORF3序列的3’端克隆及擴(kuò)增出114bp片段，從ORF2序列的3’端克隆及擴(kuò)增出811bp片段。將這些序列連到pGEX載體的BamHI和EcoRI克隆位點(diǎn)。用EcoRI和BamHI分別消化質(zhì)粒并回收克隆的病毒基因(圖6，泳道2和3)，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)114bp序列位于病毒基因組內(nèi)部的5364-5477位，編碼37個(gè)氨基酸的多肽pE3，分子量為3.9kD。811bp序列位于6326-7136位，但是發(fā)現(xiàn)在6957位有一個(gè)單堿基對(duì)刪除(圖2D)，推測(cè)是由于PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤引起。結(jié)果由移碼突變導(dǎo)致核苷酸序列的翻譯在6968位的新終止密碼子處提前終止，因而產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)度上比預(yù)計(jì)小的213個(gè)氨基酸殘基多肽pE2，分子量為23kD，而不是開始預(yù)計(jì)的267個(gè)氨基酸殘基。pE2羧基端的3個(gè)氨基酸殘基是由移碼突變產(chǎn)生，不是HEV序列(SEQ ID NO2)。
圖2A-2D和圖3所示的核苷酸序列分別對(duì)應(yīng)于HEV中國(guó)株(DDBJAccession No.D11092)的ORF2和ORF3。
圖4和5所示的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于多肽pE2和pE3，分別來(lái)自于HEV中國(guó)株(DDBJ Accession No.D11092)的ORF2和ORF3。HEV ORF2和ORF3特異蛋白的表征克隆自HEV基因組的ORF2和ORF3區(qū)域的序列被分別表達(dá)成谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白GE2和GE3。這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)可產(chǎn)生高水平的病毒多肽，而且用谷胱甘肽葡聚糖4B系統(tǒng)可以進(jìn)行有效的純化。這一方法從1升的細(xì)菌培養(yǎng)物中可產(chǎn)生約2mg純化的GE2和7mg純化的GE3。而且，可以用凝血酶將結(jié)合于葡聚糖4B的GE2洗脫下來(lái)，凝血酶在GST的羧基端剪切融合蛋白從而釋放出病毒多肽pE2。這個(gè)方法從1升細(xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生約1mg純化的pE2肽。
純化的GE2和pE2制備物用SDS PAGE和Wewtern印跡技術(shù)進(jìn)行性質(zhì)研究(圖7)。純化的pE2融合蛋白GE2(泳道1和2)、pE2肽(泳道3和4)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(泳道5)，用SDS PAGE(A)進(jìn)行分析，以及用GST特異的抗血清(B)和合并的人HEV反應(yīng)的人血清(C)進(jìn)行Western印跡分析。另外，GE2和pE2肽樣品先加熱到100℃3分鐘，再用SDS PAGE(A)和Western印跡(B和C)進(jìn)行分析(泳道2和4)。純化的pE2呈現(xiàn)出一條分子量為92kD的二聚體形式的主帶(圖7A，泳道1)，但是多肽樣品經(jīng)100℃加熱3分鐘后分解成一條49kD的條帶(圖7A，泳道2)。在對(duì)應(yīng)的Western印跡檢測(cè)中，GE2的二聚體和單體形式都可以被抗GST血清所識(shí)別(圖7B，泳道1和2)。值得注意的是這一制備物中的少量成分-49kD的GE2單體，只與抗GST血清反應(yīng)，不與人HEV反應(yīng)性血清反應(yīng)(圖7C，泳道2)。相應(yīng)地，當(dāng)GE2經(jīng)100℃加熱3分鐘后，49kD的單體變成主帶，但是它對(duì)人HEV血清的抗原性顯著下降(圖7C，泳道2)。用凝血酶消化結(jié)合的融合多肽而純化出的pE2肽，天然形成42kD的二聚體，也在100℃加熱3分鐘后解聚成23kD的單體(圖7A，泳道3和4)。pE2的單體或二聚體都不被抗GST血清識(shí)別(圖7B，泳道3和4)。而且只有pE2的二聚體形式與人HEV血清反應(yīng)(圖7C，泳道1和3)。
表達(dá)自O(shè)RF3的純化GST融合蛋白(GE3)同樣用SDS PAGE和Western印跡進(jìn)行性質(zhì)分析(圖8)。GE3蛋白作為單體產(chǎn)生一條預(yù)計(jì)的30kD的條帶。Western印跡顯示GE3與抗GST抗血清和混合人血清都發(fā)生反應(yīng)。但是與pE2和GE2相比較，GE3的反應(yīng)性只與其單體形式有關(guān)系，因此它的抗原活性不受加熱的影響。因此，通過以前的多肽圖譜研究，認(rèn)為很可能這種活性至少部分是由于其表位位于ORF3特異的全長(zhǎng)蛋白的羧基端引起。III Pe2和其抗原反應(yīng)性pE2肽天然以同型二聚體出現(xiàn)以前的研究已描述過HEV基因組ORF2編碼的HEV結(jié)構(gòu)蛋白的重組多肽，可以被HEV反應(yīng)性人血清所識(shí)別(Yarbough等人，1991；Li等人，1994)。利用分布于全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)蛋白的重疊短肽和多肽圖譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)這些具抗原性多肽的活性是來(lái)自于，位于全長(zhǎng)多肽不同區(qū)域的抗體結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量和性質(zhì)。作為線性表位，這些抗體結(jié)合位點(diǎn)與蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)，而一級(jí)結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列決定的。在溶液中重組蛋白的構(gòu)象由它們的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)決定，可能影響表位與抗體的接觸，因而減低它們的抗原活性。
本發(fā)明的重組pE2肽具有被HEV反應(yīng)性人血清識(shí)別的兩種類型的抗原活性。抗原活性的一種類型與pE2肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而第二種類型的活性與它的二聚體形式多肽的四級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。第一種抗原活性來(lái)自于pE2肽的氨基酸序列中的線性表位，而且由下面的Western印跡實(shí)驗(yàn)證明是與其單體形式有關(guān)。但是第二種類型的抗原活性具有嚴(yán)格的天然構(gòu)象，只有當(dāng)pE2肽的單體之間相互結(jié)合成二聚體時(shí)才會(huì)出現(xiàn)。因此，pE2肽的一個(gè)使其區(qū)分于其它HEV重組多肽的顯著特征是，在生理學(xué)條件下它會(huì)自然且主要形成二聚體(如更多的聚體)，其抗原活性就來(lái)自于僅由二聚體形式的四級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的構(gòu)象型抗原決定簇。此外，當(dāng)二聚體降解時(shí)，這種抗原活性即消失，但是當(dāng)單體重新變成二聚體時(shí)活性又可以恢復(fù)。對(duì)于HEV基因組ORF2區(qū)域來(lái)源的重組多肽而言，這種類型的抗原活性是首次報(bào)告。
圖7顯示合并的人HEV反應(yīng)性血清與pE2谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(即GE2)和純化的pE2的二聚體形式具有強(qiáng)烈的反應(yīng)。如本文描述的制備純化的GE2(泳道1和2)和純化的pE2(泳道3和4)，再用SDS PAGE(A)進(jìn)行分析，以及用GST特異的抗血清(B)和合并人HEV反應(yīng)的人血清(C)進(jìn)行Western印跡分析。泳道2和4的樣品先加熱到100℃ 3分鐘，然后立即用于分析。純化的GST樣品和分子量標(biāo)記混和物分別上到泳道5和6。在未加熱的樣品中(7A，泳道1和3)，融合蛋白GE2主要以分子量約為92kD的二聚體形式遷移(7A，泳道1)，pE2主要以分子量約為42kD的二聚體形式遷移(7A，泳道3)。但是，如圖7A泳道2和4所示，加熱引起兩種蛋白的二聚體形式解聚，GE2融合蛋白解聚為為49kD單體，pE2肽解聚為23kD單體。接下來(lái)的Western印跡發(fā)現(xiàn)，融合蛋白GE2，不管是以二聚體或單體形式，都被抗GST抗血清識(shí)別(7B，泳道1和2)，其結(jié)果與GST相同(7B，泳道5)。HEV反應(yīng)性人血清強(qiáng)烈識(shí)別GE2融合蛋白(7C，泳道1)和pE2肽(7C，泳道3)的二聚體形式。樣品經(jīng)100℃加熱3分鐘后引起GE2融合蛋白和pE2肽的二聚體解聚成相應(yīng)的單體形式。但是，這種解聚伴隨著抗原活性的消失，HEV反應(yīng)性人血清不能識(shí)別和結(jié)合于GE2蛋白和pE2肽的單體形式(7C，泳道2和4)。
用Western印跡來(lái)評(píng)估pE2單體的抗原性并與pE2二聚體相比較(圖9)。混合等量未加熱和加熱了的純化pE2肽樣品?；旌衔镞M(jìn)行4倍系列稀釋，上到泳道1-6。經(jīng)過電泳，用圖7中所用的混合HEV反應(yīng)性人血清以1∶200稀釋，來(lái)測(cè)定pE2兩種形式的抗原性。圖9顯示，pE2單體與混合人HEV反應(yīng)性血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)的最少量為1360ng，比在相同條件下pE2二聚體的最小陽(yáng)性反應(yīng)量(86ng)高16倍。此外，對(duì)pE2二聚體的反應(yīng)強(qiáng)度估計(jì)大約是對(duì)pE2單體反應(yīng)強(qiáng)度的5倍。因此，綜合證明，pE2二聚體的抗原活性顯著不同于單體，pE2二聚體的總體反應(yīng)性估計(jì)比pE2單體強(qiáng)約80倍。pE2單體的抗原活性是來(lái)自于pE2氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)中的幾個(gè)線性表位。
此外，18份用商用HEV ELISA試劑盒(Genelabs Diagnostics PteLtd.，新加坡)測(cè)定為陽(yáng)性的人血清，以1∶50稀釋進(jìn)行Western印跡測(cè)定(圖10)，抗原為純化pE2的經(jīng)加熱和未經(jīng)加熱的兩種形式的等量(每個(gè)反應(yīng)每種形式的量為1360ng)混勻物，未加熱則保留了pE2二聚體形式，100℃加熱3分鐘則分解pE2二聚體成單體形式。根據(jù)圖10所示結(jié)果，18份血清中只有8份同時(shí)與pE2二聚體和單體反應(yīng)，而其余10份血清只與pE2二聚體反應(yīng)。與pE2單體比較，pE2二聚體的抗體反應(yīng)性的高比例，進(jìn)一步說明二聚體比單體具有更好的抗原反應(yīng)性。
圖11顯示pE2二聚體的第二種類型的抗原反應(yīng)性是與pE2肽的二聚體或寡聚體形式的四級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。作為構(gòu)象型抗原決定簇，抗原反應(yīng)性的這種類型迄今未知，它與重組多肽而不只是pE2相關(guān)，這些重組多肽來(lái)自于HEY基因組的ORF2區(qū)域。在進(jìn)行SDS PAGE(A)和Western印跡(B)分析之前，純化的pE2樣品分成5份，分別用M尿素在不同溫度條件下處理1小時(shí)4℃(泳道1)、20℃(泳道2)、37℃(泳道3)、45℃(泳道4)。而且，一份樣品用8M尿素在45℃處理1小時(shí)后，對(duì)1×PBS透析過夜去除尿素(泳道5)，再進(jìn)行SDSPAGE和Western印跡分析。用混合HEV反應(yīng)性人血清以1∶250稀釋進(jìn)行Western印跡分析。SDS PAGE得到的結(jié)果(圖11A)表明，pE2二聚體解離成單體的程度隨加熱處理的溫度的升高而提高，溫度達(dá)到45℃時(shí)pE2二聚體完全解離(泳道4)。與這些結(jié)果相一致的是，相應(yīng)的Western印跡分析(圖11B)顯示，只有存在pE2二聚體的樣品(即泳道1-3和泳道5)，HEV反應(yīng)性血清都存在一定程度的反應(yīng)。另外，HEV反應(yīng)性人血清與只含有pE2肽單體的加熱樣品不發(fā)生反應(yīng)(即泳道4)。
這些結(jié)果提示，在生理學(xué)條件下，pE2單體自然地相互作用而形成同型二聚體，被HEV反應(yīng)性人血清識(shí)別的構(gòu)象型抗原決定簇很可能是產(chǎn)生于這種二聚體的相互作用，因?yàn)闄z測(cè)不到針對(duì)pE2單體形式的抗體。相應(yīng)地，由pE2二聚體的四級(jí)結(jié)構(gòu)決定的、抗原反應(yīng)性的第二種類型，顯示出嚴(yán)格的天然構(gòu)象，只有當(dāng)pE2肽呈二聚體時(shí)才有功能。因此，pE2肽二聚體形式的解離呈現(xiàn)出與構(gòu)象型抗原活的消失相關(guān)(即圖11B泳道4)。但是，將尿素處理的樣品對(duì)PBS進(jìn)行過夜透析后，pE2單體重新結(jié)合形成二聚體，構(gòu)象型抗原活性得以恢復(fù)(圖11B泳道5)。
pE2的構(gòu)象型抗原決定簇在HEV感染中的重要性如上所述及證明，被HEV反應(yīng)性人血清識(shí)別的pE2抗原活性的兩種類型中，二聚體形式的構(gòu)象型抗原決定簇顯然在天然HEV感染中的作用比單體的線性表位更為重要。Western印跡分析的結(jié)果(圖10)顯示，總共18份HEV反應(yīng)性人血清都能與pE2肽的二聚體形式反應(yīng)，而只有8份血清另外與pE2肽的單體形式反應(yīng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣得出上述結(jié)論。而且，基于圖9的結(jié)果，pE2構(gòu)象型抗原決定簇的總體反應(yīng)性估計(jì)大約是單體的線性表位反應(yīng)性的80倍。
能過測(cè)定21份健康獻(xiàn)血者的血清和96份非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人從肝炎發(fā)病時(shí)的不同時(shí)間采集的血清(表2)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)pE2構(gòu)象型抗原決定簇在天然HEV感染中的角色。研究中所用的血清是經(jīng)過香港皇后瑪珈麗醫(yī)院允許，取自正在發(fā)病的或得過病的非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人。結(jié)果顯示，pE2特異的IgG抗體在非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人中比健康獻(xiàn)血者中明顯普遍得多。這個(gè)差異與流行病學(xué)研究相一致，提示這些病人的一部分可能正在感染而其他人可能以前感染過這個(gè)病毒。大約10％的健康獻(xiàn)血者在過去感染過病毒，與這些血清樣品來(lái)源的社區(qū)中HEV的感染水平相一致。表2用Western印跡檢測(cè)人血清中的HEV抗體抗體(IgG)血清數(shù)量
IV 確定pE2和pE3的HEV特異性為了確定pE2二聚體和pE3的抗原活性是HEV特異的，96份來(lái)自急性或曾經(jīng)急性的非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人的血清樣品中的74份，通過商用的HEV特異的ELISA進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)定(表3)。商用測(cè)定與pE2或pE3測(cè)定的高符合率證明了pE2和pE3的HEV抗原特異性。表3用商用ELISA測(cè)定抗pE2、pE3的IgG抗體以及HEV IgG抗體Wewtern印跡 EIA 合計(jì) 總一致率*+-pE2+ 37 7 44 89.2％- 129 30pE3+ 30 0 32 89.2％- 836 54合計(jì) 38 36 74*整體一致性＝結(jié)果一致的樣品數(shù)/總樣品數(shù)×100％V檢測(cè)抗HEV IgG和IgM的ELISA的建立分別用pE2或谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合蛋白GE3的純化樣品包被微孔板，進(jìn)行兩個(gè)分開的ELISA實(shí)驗(yàn)。這些HEV多肽的產(chǎn)生和純化已在上文描述。這些樣品的純度由42kD的pE2二聚體和30.4kD的GE3融合多肽的相對(duì)強(qiáng)度決定，它們占各自樣品的總蛋白中的89％和95％(圖12左泳道)。Western印跡顯示，這些多肽是這些樣品中的主要抗原，因?yàn)樗鼈兣cHEV陽(yáng)性的人血清發(fā)生反應(yīng)(圖12實(shí)心和陰影)，而不與陰性對(duì)照的人血清發(fā)生反應(yīng)(圖12空心)。用這些純化的HEV多肽樣品滴定這些血清而得到的一般結(jié)果與用Western印跡測(cè)定的相應(yīng)多肽與這些血清的反應(yīng)相一致。
在進(jìn)一步的研究中，用pE2和pE3特異測(cè)定，檢測(cè)了90份健康獻(xiàn)血者和96份正在得病或曾經(jīng)得病的非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人血清中的HEV IgG抗體水平。個(gè)體病人血清的抗體水平通常與它們和相應(yīng)病毒多肽的反應(yīng)性相關(guān)，這一反應(yīng)性已用Western印跡測(cè)定(圖13)。由Western印跡確定有反應(yīng)的血清(圖13實(shí)心條)得到的OD值要高于弱反應(yīng)(圖13陰影條)或無(wú)反應(yīng)血清(圖13，空心條)。
設(shè)定超過由Western印跡證明無(wú)反應(yīng)血清的平均OD值的5SD為閾值。通過pE2特異性測(cè)定，85.7％的pE2反應(yīng)或弱反應(yīng)性血清給出陽(yáng)性結(jié)果。通過GE3特異性測(cè)定，66.6％的GE3反應(yīng)性血清給出陽(yáng)性結(jié)果。Western印跡和pE2、GE3特異性測(cè)定的總相符率分別為91.7％和88.5％。基于Western印跡結(jié)果，兩者的ELISA測(cè)定都有100％的特異性，由這些測(cè)定和Western印跡得到的不同結(jié)果只限于弱反應(yīng)性血清。這些結(jié)果證實(shí)了pE2測(cè)定是特異于42kD的pE2二聚體，而GE3測(cè)定是特異于30.4kD的pE3多肽。由ELISA測(cè)定pE2 IgG抗體的血清流行，在HEV病人中為50％，在獻(xiàn)血者中為5.5％，而GE3 IgG抗體的血清流行性況為，在HEV病人中為22.9％，在獻(xiàn)血者中為1.1％。測(cè)試樣品中兩個(gè)群體的pE2特異抗體的血清流行均高于GE3特異抗體。這個(gè)結(jié)果提示，pE2是兩個(gè)抗原的主要成分，這些抗體的高度流行與急性肝炎有關(guān)。用抗體反應(yīng)來(lái)區(qū)分HEV衣殼蛋白的抗原區(qū)域?yàn)榱诉M(jìn)一步比較，從96份血清中取出74份，進(jìn)一步用商用檢測(cè)試劑盒(Genelabs Diagnostics Pte Ltd.，新加坡)測(cè)定其IgG抗體。商用測(cè)定試劑盒是由42個(gè)氨基酸的多肽和33個(gè)氨基酸的多肽混合組成，這兩個(gè)多肽分別編碼自HEV的Burmese和Mexican株的ORF2和ORF3的3’端(Yarbough等人，1991)。如上所述，pE3是一38個(gè)氨基酸的多肽，也表達(dá)自O(shè)RF3的3’端，所以發(fā)現(xiàn)用于商用測(cè)定的ORF3的33個(gè)氨基酸多肽是pE3中的一部分(即GE3)。因此可以預(yù)計(jì)在商用測(cè)定中ORF3特異的多肽的抗原特異性應(yīng)該與GE3密切相關(guān)。另一方面，用于商用測(cè)定的ORF2特異的多肽位于213個(gè)氨基酸的pE2肽的羧基端的更下游。因此，商用測(cè)定試劑盒的抗原特異性部分由其含有的ORF2多肽決定，預(yù)計(jì)不同于體發(fā)明的pE2肽。不同于以前報(bào)道的來(lái)自于ORF2區(qū)的HEV多肽，pE2的抗原活性的唯一性在于，它主要來(lái)源于其構(gòu)象型抗原決定簇，這種構(gòu)象型抗原決定簇只有當(dāng)pE2單體之間相連成二聚體時(shí)才會(huì)暴露出來(lái)。
如Western印跡所證明的，30份血清同時(shí)與pE2 IgG和pE3 IgG反應(yīng)(pE2+/pE3+，圖15A和15E)，14份只與pE2 IgG反應(yīng)(pE2+/pE3-，圖15B和15E)，30份與兩者都不反應(yīng)(pE2-/pE3-，圖15C和15F)。因此，由商用測(cè)定的pE2和GE3反應(yīng)性血清的抗體水平隨GE3特異抗體的水平的變化(圖15A)，但是與pE2特異抗體的水平無(wú)關(guān)(圖15D)。這些血清中的11份與pE3呈弱反應(yīng)性，OD值在GE3特異的ELISA閾值以下(圖15A)。發(fā)現(xiàn)只與pE2反應(yīng)的14份血清中的10份帶有不同水平的相應(yīng)抗體。14份血清中的7份在商用測(cè)定中有反應(yīng)(圖15E)。但是，它們?cè)贕E3特異的ELISA中都呈陰性(圖15B)。其余血清不與任何一種多肽反應(yīng)，在pE2和pE3特異的ELISA中，它們都呈陰性，在商用測(cè)定中，除了一份外其余也都呈陰性。
用三種方法測(cè)定的HEV抗體譜總結(jié)于表4。盡管它們的抗原特異性不同，33份血清在pE2特異測(cè)定和商用測(cè)定中為陽(yáng)性，30份在兩種測(cè)定中為陰性，兩種測(cè)定的總一致率為87.8％。類似的，GE3特異性測(cè)定和商用測(cè)定的總一致率為74.3％。三種測(cè)定的總一致率為66.2％。用商用測(cè)定檢測(cè)的HEV抗體的頻率(47％)稍低于pE2特異性測(cè)定(50％)，高于GE3特異性測(cè)定(29％)?；趥€(gè)體血清中存在的抗體譜，在40份血清中由商用測(cè)定檢測(cè)出15份血清的抗體，可能是因?yàn)榕c這種試劑盒中的ORF2特異性多肽特異作用的抗體的存在，因?yàn)檫@些血清在GE3特異性測(cè)定中不發(fā)生反應(yīng)。其余的23份血清在商用測(cè)定和GE3特異測(cè)定中都是陽(yáng)性，但是如果這些血清仍含有針對(duì)商用試劑盒中的ORF2特異多肽的抗體，則結(jié)果仍不能確定。
表4病毒性肝炎病人血清與HEV多肽和商用ELISA試劑盒的反應(yīng)方式
1商用ELISA試劑盒的總一致率＝用pE2或GE3特異檢測(cè)和同時(shí)用商用測(cè)定得到陽(yáng)性或陰性結(jié)果一致的血清數(shù)/檢測(cè)的總血清數(shù)×100％。三種測(cè)定方法之間的總一致率為66.2％。VI 正在和曾經(jīng)的HEV感染中的抗體反應(yīng)同樣檢測(cè)了HEV病人和健康獻(xiàn)血者血清中的pE2和GE3特異的IgM抗體的水平。開始的研究顯示，測(cè)定不受存在的IgG抗體的影響，因此在有和無(wú)抗人IgG存在時(shí)都得到一樣的結(jié)果。因此做了一些無(wú)抗人IgG存在時(shí)的檢測(cè)，設(shè)定閾值為90份獻(xiàn)血者血清的平均OD值的3SD。圖14比較了戊型肝炎剛發(fā)病的病人血清中的pE2和GE3抗體的產(chǎn)生。pE2和GE3特異的IgM抗體和GE3特異的IgG抗體主要存在于戊型肝炎剛發(fā)病的早期血清樣品中，而pE2特異的IgG抗體的產(chǎn)生不與疾病的發(fā)病相關(guān)。
如圖14，基于pE3和GE3特異測(cè)定檢測(cè)的HEV抗體水平，測(cè)定的個(gè)體血清樣品存在9個(gè)不同的HEV血清型。發(fā)現(xiàn)總共有53份病人血清與1種或多種抗體發(fā)生的反應(yīng)(表5)。18份血清存在5種血清型，與正在感染的情況一致(表5曲線1-5)。其中包括3份只有pE2IgM反應(yīng)的血清(表5曲線1)，11份另外有pE2和GE3特異的IgG抗體反應(yīng)的血清(表5曲線2)，另外3份有以上抗體反應(yīng)以及GE3特異的IgM抗體反應(yīng)的血清(表5曲線4)。其余血清存在pE2特異IgM和不同的其它抗體的反應(yīng)。值得注意的是這些血清中的16份血清是在戊型肝炎發(fā)病之后的30天內(nèi)采集的。其余2份病人血清是在病程開始后的60天以后采集的。推測(cè)這些以及其它來(lái)自獻(xiàn)血者的血清是屬于無(wú)征兆的HEV感染，與以前的戊型肝炎病史無(wú)關(guān)。另外35個(gè)病人的血清存在血清譜，與那些IgG陽(yáng)性而IgM陰性的過往HEV感染一致(表5曲線6-8)。這些血清中的27份有pE2特異的IgG反應(yīng)(表5曲線6)，7份有GE3特異IgG反應(yīng)(表5曲線7)，但是沒有一份有IgG抗體反應(yīng)(表5曲線6-8)。1個(gè)血清譜顯示血清不存在任何一種抗體的反應(yīng)(表5曲線9)。但是，這些血清譜的產(chǎn)生不與戊型肝炎的開始發(fā)病時(shí)間相關(guān)。很多顯示正在感染的血清譜樣品是在戊型肝炎開始之后的27天內(nèi)(平均＝13天)采集的，其它樣品是在括號(hào)內(nèi)所示天采集的。過往感染的血清譜與疾病開始不相關(guān)，這些樣品是在疾病開始以后與非反應(yīng)的血清以相似的速率累積(平均＝50和40天)。
表5 HEV感染的血清譜確定的 IgM IgG 獻(xiàn)血者 病人血清譜 pE2 GE3pE2 GE3血清數(shù) 血清數(shù)發(fā)病后的天數(shù)(n＝90) (n＝96)1 +- -- 0 3 9-152 +- ++ 0 115-27(190，240)3 ++ -- 1 1 84 ++ ++ 0 3 7-145 -+ ++ 0 1 18合計(jì)(正在感染)1 18平均＝136 -- +- 5 275-4307 -- ++ 0 7 9-408 -- -+ 0 1 18合計(jì)(過往感染)5 35平均＝509 -- -- 84 42平均＝40ELISA測(cè)定低親和力IgG抗pE2抗體ELISA的進(jìn)一步應(yīng)用是用pE2二聚體檢測(cè)血清中的低親和力IgG抗體。在4M尿素或無(wú)4M尿素中滴定血清樣品而完成此檢測(cè)。當(dāng)尿素處理引起明顯的抗體水平顯著下降4倍以上，即表明低親和力IgG抗體的存在。表6顯示，在戊肝發(fā)病2周內(nèi)采集的病人血清中檢測(cè)到的主要是低親和力的抗體，后來(lái)這一抗體逐漸被親和力IgG抗體所代替。因此，低親和力抗體轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生使其在急性戊型肝炎的診斷中有潛在的用途。表6用ELISA檢測(cè)開始發(fā)病后的不同時(shí)間的非甲、乙、丙型肝炎病人血清樣品中的低親和力pE2 IgG抗體pE2 IgG親和力測(cè)定(例子)
VII 建立免疫捕獲RT-PCR來(lái)檢測(cè)HEV RNA如果pE2二聚體模擬了HEV衣殼的某種結(jié)構(gòu)特征，則以上描述的人血清的反應(yīng)性是可以解釋的。為了測(cè)定這種可能性，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以確定針對(duì)pE2的抗血清是否影響HEV顆粒的免疫捕獲。RT-PCR引物的特異性在本研究中，選擇了兩對(duì)引物A5R/A3F和B5R/B3F(表9)進(jìn)行RT-PCR。分別用含有HEV、HAV、腸道病毒和杯狀病毒的樣品直接進(jìn)行RT-PCR以評(píng)估這些引物的特異性。圖16顯示，只有含HEV的樣品經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出一條特異的203bp HEV序列的條帶。pE2二聚體模擬了HEV的結(jié)構(gòu)特征用包被了抗pE2肽的抗血清的聚苯乙烯板(paddle)進(jìn)行免疫捕獲實(shí)驗(yàn)，以研究pE2雙全和HEV病毒顆粒的抗原關(guān)系。使用的抗血清是采用一只用4次100ug劑量的純化pE2肽免疫的猴子，它與pE2二聚體有強(qiáng)烈的反應(yīng)?？寡迮cpE2單體存在弱反應(yīng)，不與其它的HEV抗原反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)包被了抗血清的板影響HEV顆粒的特異免疫捕獲，結(jié)合的病毒用于后面的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)(泳道2)，在“材料和方法”部分對(duì)本方法有所描述。板相似地允許與HAV(泳道3)、杯狀病毒(泳道4和5)和腸道病毒(泳道6)反應(yīng)，但不能捕獲病毒(圖16)。
這些結(jié)果進(jìn)一步支持pE2二聚體可能模擬了HEV病毒顆粒某種結(jié)構(gòu)特征的論點(diǎn)，使得抗血清能夠與二聚體強(qiáng)烈反應(yīng)，影響了HEV顆粒免疫捕獲的有效性和特異性。下面討論這一發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于發(fā)展一種檢測(cè)臨床、食品和環(huán)境樣品中的HEV的免疫捕獲測(cè)定法。免疫捕獲RT-PCR(IC-RT-PCR)測(cè)定兔子pE2抗血清的免疫捕獲HEV的能力。聚苯乙烯板分別用抗血清和血疫前的血清包被，用于捕獲病毒。進(jìn)行捕獲病毒的RT-PCR。發(fā)現(xiàn)抗血清能捕獲貯存病毒的55稀釋液中的HEV顆粒(圖17A)，而免疫前的血清不能捕獲即使是未稀釋的貯存液中的病毒(圖17B)。用商用病毒RNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行IC-RT-PCR的比較。
上面描述的免疫捕獲RT-PCR(IC-RT-PCR)方法可以用于日常公共健康和環(huán)境監(jiān)測(cè)的HEV檢測(cè)，因?yàn)榉€(wěn)定來(lái)源的抗血清是源自HEV特異的蛋白pE2的表達(dá)。
在上面描述的方法中，免疫捕獲的HEV顆粒用一種商用試劑盒(QIAamp Viral RNA Kit，QIAGEN)提取其RNA，這種試劑盒為分子生物學(xué)家常用。如果假設(shè)用商用試劑盒的RNA提取的有效性為100％，不受任何干擾，則理論上，IC-RT-PCR應(yīng)該比直接的RT-PCR敏感32倍，因?yàn)榍罢吣軌蛉菁{32倍體積的樣品。在本研究中，接種的病毒進(jìn)行了5倍系列稀釋，因此預(yù)計(jì)IC-RT-PCR的結(jié)果比RT-PCR敏感25倍。
在本研究中，準(zhǔn)備了三種類型的HEV接種樣品，包括水、人糞便樣品的上清和勻漿的貝類樣品的上清。水樣品、一份貝類樣品(如牡礪)和一份糞便樣品用相同量的HEV穿刺。穿刺樣品進(jìn)行5倍遞增的系列稀釋，各稀釋樣品用商用(傳統(tǒng)的)方法和免疫捕獲法進(jìn)行HEV的測(cè)定。對(duì)這些樣品的HEV捕獲有效性進(jìn)行了比較，結(jié)果如表7。根據(jù)這些結(jié)果，證明免疫捕獲法比傳統(tǒng)的RT-PCR法增加了HEV的檢測(cè)靈敏度，在水樣品中提高25倍，在糞便樣品中提高125倍，在貝類樣品中則大于125倍。因此，結(jié)果顯示IC-RT-PCR至少比商用病毒RNA試劑盒敏感25。在水樣品中觀察到敏感性增加的原因，是由于免疫捕獲法中的測(cè)定樣品體積是傳統(tǒng)RT-PCR測(cè)定中樣品體積的32倍。而且，結(jié)果也提示，在糞便和貝類上清中存在未知因子抑制RNA的提取。這是為什么水樣品的結(jié)果顯著高于貝類和糞便上清樣品的結(jié)果，因?yàn)樗畼悠奉A(yù)計(jì)不含有抑制檢測(cè)的物質(zhì)。但是，與傳統(tǒng)的RT-PCR法相比，用IC-RT-PCR法使糞便和貝類樣品中的干擾降低到最小。與傳統(tǒng)的RT-PCR相比，IC-RT-PCR法的敏感度提高了25倍，是因?yàn)橛妹庖卟东@法去除了抑制物質(zhì)。
表7比較免疫捕獲-RT-PCR和傳統(tǒng)的RT-PCR法的HEV檢測(cè)效率
檢測(cè)敏感度由病毒檢測(cè)要求的有限樣品稀釋度表示。
總之，與水樣品相比，商用RT-PCR法和IC-RT-PCR法對(duì)糞便和貝類樣品都具有低的敏感度。但是，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)榧S便和貝樣品中的一些未知因子引起，這些因子可能加速病毒的降解。另一方面，IC-RT-PCR結(jié)果比直接的RT-PCR敏感125倍，暗示免疫捕獲法成功地克服了糞便和貝類樣品中未知因素的干擾，進(jìn)一步表明IC-RT-PCR可用于臨床和環(huán)境監(jiān)測(cè)。VIII pE2在針對(duì)HEV的保護(hù)中的作用前面對(duì)非甲、乙、丙型肝炎病人的研究結(jié)果提示，重組肽pE2的二聚體形式通過暴露構(gòu)象型抗原決定簇可能在天然HEV感染中起著重要作用，其構(gòu)象型抗原決定簇是由肽單體形式的二聚體化而產(chǎn)生。
如在前面非甲、乙、丙型肝炎病人的研究中所示，發(fā)現(xiàn)pE2的二聚體形式在天然HEV感染中起著更突出的作用。在急性HEV感染中，通常產(chǎn)生pE2特異的IgM抗體。相應(yīng)的IgG抗體同樣產(chǎn)生并持續(xù)一段時(shí)間，并伴隨著親和力的上升。而且在恢復(fù)期血清和以前感染過該病毒的個(gè)體血清中，它們是最普遍的抗體。這些結(jié)果提示，pE2可能對(duì)HEV提供保護(hù)，在實(shí)驗(yàn)感染的短尾猴(Macaque monkeys)中的保護(hù)性研究進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)。而且，結(jié)果也提示，保護(hù)性作用主要是由于pE2肽的二聚體化呈現(xiàn)出來(lái)的構(gòu)象型抗原決定簇，而不是呈現(xiàn)的線性表位，這一論點(diǎn)為疫苗的發(fā)展提供了合理的理論基礎(chǔ)。
用短尾猴作為模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)感染的保護(hù)性研究中顯示，用純化的pE2肽制備物免疫能夠保護(hù)動(dòng)物免受HEV攻擊，因此使它成為一種很好的疫苗候選者。發(fā)現(xiàn)感染劑量接近基因組劑量，與實(shí)驗(yàn)感染相關(guān)的病理學(xué)用以與人體的天然感染相關(guān)的病理學(xué)相比較(Tsarev等人，1993b；Tsarev等人，1994b)。為了獲得一種清晰的指征即是否細(xì)菌表達(dá)的肽提供針對(duì)HEV的保護(hù)，本研究中的動(dòng)物用相當(dāng)大劑量的、含有至少105基因組當(dāng)量的HEV病毒進(jìn)行感染。對(duì)照動(dòng)物出現(xiàn)的糞便中的病毒分泌和病毒血癥在免疫動(dòng)物中基本消除。沒有動(dòng)物產(chǎn)生另外的除抗pE2抗體以外的HEV抗體，抗pE2抗體是在攻擊之前就已經(jīng)存在的。因?yàn)樵诠糁按嬖诘目筽E2抗體中，特異性識(shí)別pE2二聚體的抗體與識(shí)別其單體的抗體相比占了優(yōu)勢(shì)，得出的結(jié)論是，在很大程度上保護(hù)效果是由于這一病毒多肽的二聚化產(chǎn)生的構(gòu)象型抗原決定簇。與這一結(jié)論相一致，pE2肽的研究和特性提示，它可能包含了HEV主要結(jié)構(gòu)蛋白中的一個(gè)區(qū)域，這一區(qū)域之間相互作用而形成HEV衣殼。因此，與那些通過pE2二聚體化產(chǎn)生的構(gòu)象型抗原決定簇相比，病毒衣殼是產(chǎn)生于相同或相似的構(gòu)象型抗原決定簇。因此，pE2二聚體特異的抗體是與天然HEV感染反應(yīng)的主要抗體。
將編碼210個(gè)氨基酸HEV多肽pE2的核苷酸序列與已報(bào)道的HEV原型株相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列相比較。210個(gè)氨基酸多肽是由HEV基因組的ORF2的高度保守的區(qū)域編碼(表1)。用于免疫的病毒多肽的純度用SDS PAGE評(píng)估(圖7A泳道3)，其抗原性用人HEV反應(yīng)的血清的免疫印跡法評(píng)估(圖7C泳道3)。用于免疫的純化制備物中pE2占了超過90％的量。HEV反應(yīng)的人血清特異識(shí)別二聚體形式(圖7C泳道3)，而不是23kD的單體形式(圖7C泳道4)。這些結(jié)果提示人血清中存在的抗HEV抗體主要針對(duì)由病毒多肽的二聚體化產(chǎn)生的構(gòu)象型抗原決定簇。免疫接種3只猴子(M1、M2和M3)每星期分別用100ug純化的pE2二聚體進(jìn)行肌肉內(nèi)免疫，共4次。3只對(duì)照的猴子(M5、M7和M8)用安慰劑進(jìn)行同樣操作。第四次免疫完成后的兩個(gè)星期，給所有動(dòng)物采血，血清用純化的pE2、GE3作為抗原進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，以及商用ELISA測(cè)定。在最的一次免疫后的兩個(gè)星期，兩組猴子都用105基因組當(dāng)量的同種HEV株進(jìn)行攻擊。
用純化的pE2肽進(jìn)行ELISA監(jiān)測(cè)免疫接種后的抗體反應(yīng)(圖18)。結(jié)果顯示，在三只動(dòng)物中(M1-M3)，免疫接種都導(dǎo)致了活躍的抗病毒多肽的抗體反應(yīng)。首次后的一個(gè)星期進(jìn)行第一次抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗體即達(dá)到了接受第三次劑量一周后的最高水平。對(duì)照動(dòng)物沒有檢測(cè)到pE2特異的抗體。在所有動(dòng)物中觀察到的活躍反應(yīng)顯示pE2具有很強(qiáng)的免疫原性。
在病毒攻擊前立即采集HEV特異的血清，進(jìn)一步進(jìn)行Western印跡分析，抗原為天然(即pE2二聚體)和加熱變性的純化pE2(即pE2單體)(圖19A泳道1-4)、純化的GE3融合蛋白(圖19B)，同時(shí)用商用ELISA試劑檢測(cè)HEV(圖19C)。后者的ELISA試劑是由兩種合成的HEV多肽混和而成，多肽對(duì)應(yīng)于ORF2和ORF3特異蛋白的羧基端區(qū)域的氨基酸序列。根據(jù)生產(chǎn)者的操作說明，檢測(cè)使用了兩個(gè)HEV多肽，一個(gè)類似于pE3(即GE3)，另一個(gè)對(duì)應(yīng)于HEV主要結(jié)構(gòu)蛋白的羧基端區(qū)域，位置與pE2相鄰但不重疊。
圖19A顯示，將血清進(jìn)行4倍遞增的系列稀釋，等份稀釋血清用于Western印跡，檢測(cè)抗pE2二聚體和單體的抗體水平。來(lái)自M1的免疫血清在1∶4,000(泳道1)和1∶256,000(泳道4)稀釋度之間進(jìn)行測(cè)定；來(lái)自M2的免疫血清在1∶100(泳道1)和1∶6,400(泳道4)之間進(jìn)行測(cè)定；來(lái)自M3的免疫血清在1∶250(泳道1)和1∶16,000(泳道4)之間進(jìn)行測(cè)定。純化pE2肽的二聚體和單體形式的等量制備物用于Western印跡?？谷魏我环N形式的抗體水平由血清的最大稀釋度(有限稀釋)確定，在這一稀釋度時(shí)仍能與多肽的各自形式發(fā)生反應(yīng)。結(jié)果顯示，來(lái)自M1的血清中抗二聚體的抗體水平是1∶64,000，比抗單體的抗體水平(有限稀釋度為1∶4,000)高16倍。M2和M3的血清抗二聚體的抗體水平分別為1∶1,600和1∶4,000，比相同血清中相應(yīng)的抗單體的抗體水平高16倍和4倍。這些動(dòng)物免疫前的血清在1∶100稀釋度沒有檢測(cè)到活性(圖19A泳道5)。
圖19B顯示，在1∶100稀釋度時(shí)，沒有血清與純化的GE3發(fā)生反應(yīng)。相同血清在相同的稀釋度用商用ELISA測(cè)定，商用ELISA是產(chǎn)生于一種合成多肽，對(duì)應(yīng)于HEV主要結(jié)構(gòu)蛋白的羧基端，蛋白由HEV基因組的ORF3編碼。圖19C顯示，沒有血清含有抗這些HEV多肽的可檢測(cè)的抗體。來(lái)自對(duì)照動(dòng)物的血清同樣用上述方法檢測(cè)，任何一種方法都沒有檢測(cè)到任一種血清中的HEV抗體。
因此，這些結(jié)果顯示，pE2肽具有高度免疫原性，能夠在猴子中引起活躍的抗體反應(yīng)，同樣能在其它動(dòng)物如小鼠、大鼠、羊或兔中激發(fā)免疫反應(yīng)。針對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體主要是與pE2二聚體反應(yīng)。通過有限稀釋法測(cè)定，這些抗體的水平比相應(yīng)抗單體的抗體水平高4至6倍。pE2二聚體比單體引起更高抗體水平的產(chǎn)生，說明pE2二聚體是主要的免疫原。而且，用純化的pE2免疫不會(huì)引起用其它商用方法檢測(cè)得到的、其它HEV抗體的產(chǎn)生。因此，從這些結(jié)果可以得出結(jié)論，抗純化pE2的抗血清是pE2特異性的，對(duì)多肽的二聚體形式更為特異。
而且，對(duì)于單體，在有限稀釋度范圍內(nèi)稀釋的抗血清只能與二聚體發(fā)生反應(yīng)，而不與單體發(fā)生反應(yīng)。根據(jù)免疫學(xué)中的正常應(yīng)用，此處描述的合適稀釋度時(shí)產(chǎn)生對(duì)二聚體的“單特異性”的抗血清，可以用于區(qū)分單體和由單體形成二聚體而暴露的構(gòu)象型抗原決定簇和其中含有的線性表位。HEV 攻擊用HEV同源株進(jìn)行肌肉內(nèi)注射免疫后的2個(gè)星期，對(duì)3個(gè)測(cè)試動(dòng)物(M1，M2，M3)和3個(gè)對(duì)照動(dòng)物(M5，M6，M7)進(jìn)行攻擊。攻擊病毒最初分離于1986年中國(guó)的一場(chǎng)爆發(fā)(表1 D11092株)，注射的病毒量用PCR評(píng)估為每劑量為105HEV基因組當(dāng)量(圖20)。攻擊病毒的首次感染劑量未測(cè)定。其他研究者的最近報(bào)道顯示，HEV的首次感染滴度與基因組滴度相同。
實(shí)驗(yàn)感染之后，每天觀察動(dòng)物戊型肝炎病毒的發(fā)展。在感染前和后的每2天，監(jiān)測(cè)糞便樣品中病毒的分泌。每周采集2次外周血樣品，用于檢測(cè)血漿和外周血中單核細(xì)胞(PBMC)的病毒。收集血清樣品用于檢測(cè)ALT水平。兩組猴子的ALT水平正常，無(wú)戊型肝炎發(fā)展的征兆。推測(cè)是因?yàn)樵陟`長(zhǎng)類中，病毒在前面的傳代中被削弱了(Zhuang等人，1992)。不過，表8顯示，1只對(duì)照動(dòng)物M5在感染后的第5至17天的每個(gè)糞便樣品中分泌病毒。在其它兩只對(duì)照動(dòng)物M7和M8中，從第7至17天持續(xù)10天分泌病毒。感染后的第9和第13天的M7和M8的PBMC樣品也進(jìn)行了HEV基因組檢測(cè)。從這些動(dòng)物的任何血漿樣品中都沒有檢測(cè)到HEV基因組。在兩只測(cè)試動(dòng)物M1和M2中，用pE2肽進(jìn)行免疫完全消除了病毒分泌，在第3只測(cè)試動(dòng)物M3中，將病毒分泌減少到1天，從這些動(dòng)物的血漿或PBL樣品中沒有檢測(cè)到病毒基因組。
表8病毒攻擊后糞便中的HEV分泌和病毒血癥群 猴子 攻擊后的天數(shù)體357911 13 15 17 19 21測(cè) No.1 ----------試 No.2 ----------No.3 -+--------對(duì) No.5 -+++++1++--照 No.7 --++1++++--No.8 --++++++--1用RT-PCR檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中的HEV基因組。沒有血漿樣品帶有可檢測(cè)的HEV基因組。病毒攻擊后的HEV血清轉(zhuǎn)換根據(jù)圖19描述的實(shí)驗(yàn)方法和條件，分析了病毒攻擊前和攻擊后4個(gè)星期的血清樣品中的HEV抗體譜。圖21顯示，從病毒攻擊前的3只對(duì)照動(dòng)物(M5，M7，M8)獲得的血清，開始時(shí)在所有3種HEV抗體測(cè)定中都為陰性。1只對(duì)照動(dòng)物M5的HEV血清轉(zhuǎn)化發(fā)生于感染后的7天，在這天以及所有后來(lái)采集的血清中都檢測(cè)到了pE2同源二聚體特異的抗體(圖21)。所有這些血清樣品用商用ELISA測(cè)定也給出了HEV抗體的可能的測(cè)定結(jié)果，在第7天和14天連續(xù)采集的樣品同樣與純化的GE3發(fā)生反應(yīng)。針對(duì)感染產(chǎn)生的廣泛特異性抗體譜與以前描述的用pE2肽免疫而產(chǎn)生的嚴(yán)格的特異抗體譜形成對(duì)照(圖21)。感染后的第14和21天，從另一對(duì)照動(dòng)物M7獲得的血清樣品，與pE2二聚體有弱反應(yīng)性，用商用測(cè)定得到的是陽(yáng)性結(jié)果。但是無(wú)樣品與ORF3特異的多肽GE3發(fā)生反應(yīng)。剩余的對(duì)照M8對(duì)感染不產(chǎn)生足夠可檢測(cè)的抗體量。相反，除了pE2抗體，免疫動(dòng)物在感染后沒有獲得其它的HEV抗體(圖21)。
從免疫動(dòng)物(M1，M2，M3)采集的血清在病毒攻擊之前的0天已經(jīng)與pE2二聚體發(fā)生反應(yīng)。病毒攻擊后的7、14、28天從這些動(dòng)物中采集的樣品中，抗體持續(xù)存在。但是與對(duì)照動(dòng)物相比較，免疫過的動(dòng)物在病毒攻擊后都沒有獲得另外的HEV抗體(圖21A)。討論前面的研究已將恒河猴(Rhesus monkey)建立為HEV的合適動(dòng)物模型。發(fā)現(xiàn)感染劑量接近基因組劑量(Tsarev等人，1994b)，與實(shí)驗(yàn)感染相關(guān)的病理學(xué)用以與人體天然感染相關(guān)的病理學(xué)相比較(Tsarev等人，1993b)。為了獲得一種清楚的指征，即是否細(xì)菌表達(dá)的多肽對(duì)HEV提供保護(hù)，本研究中所用的動(dòng)物用相當(dāng)大劑量的、含有至少105基因組當(dāng)量的HEV病毒進(jìn)行感染。我們的結(jié)果顯示，感染導(dǎo)致3個(gè)對(duì)照動(dòng)物的糞便樣品中延長(zhǎng)了至少10天的病毒分泌，在PBMC樣品中用病毒基因組檢測(cè)證明兩只動(dòng)物有短暫的病毒血癥。而且，在兩只動(dòng)物中感染伴隨著HEV血清轉(zhuǎn)化。推測(cè)因?yàn)楣舻牟《驹谝郧暗撵`長(zhǎng)類動(dòng)物中的傳代中被消弱，但是所有對(duì)照動(dòng)物仍然保持健康，ALT水平正常。
發(fā)現(xiàn)用純化的pE2免疫引起了活躍的針對(duì)其單體和二聚體形式多肽的抗體反應(yīng)。二聚體反應(yīng)性抗體的水平基本上高于相應(yīng)單體特異性抗體的水平。除了這些抗體，血清中不存在其它的HEV反應(yīng)。pE2反應(yīng)性抗體顯然在免疫動(dòng)物中阻止了實(shí)驗(yàn)感染。在兩只免疫動(dòng)物中糞便的病毒分泌消失，在第3只動(dòng)物中，分泌時(shí)間已從對(duì)照動(dòng)物的10或更多天而減少到1天。進(jìn)一步顯示免疫過的動(dòng)物在其PBMC或血漿樣品中沒有發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)的病毒，在病毒攻擊后，這些動(dòng)物也沒有獲得另外的HEV抗體。
綜合以上結(jié)果顯示，用重組表達(dá)的pE2肽免疫已阻止了HEV同種株對(duì)靈長(zhǎng)類的實(shí)驗(yàn)感染，保護(hù)很大程度上是得益于抗pE2肽二聚體形式的抗體。因?yàn)樵诓煌腍EV分離株之間是高度保守的，包括分離自墨西哥(Huang等人，1992)和美國(guó)(Schlauder等人，1998)的遺傳變異最大的分離株，可能pE2肽能夠同樣阻止HEV其它株的感染。
下面提供的實(shí)施例用于闡明發(fā)明的概念，而不限制權(quán)利與要求確定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例病毒株—中國(guó)HEV株的DDBJ登錄號(hào)為D11092，由中國(guó)北京醫(yī)科大學(xué)Zhuang H教授提供(Aye等人，1992)。根據(jù)Zhuang描述的方法(Zhuang等人，1992)，用戊肝病人的糞便樣品實(shí)驗(yàn)感染恒河猴，再?gòu)钠淠懼蝎@得病毒。
血清—本發(fā)明所述的96份血清是經(jīng)過香港皇后瑪珈麗醫(yī)院允許，取自正在發(fā)病的或得過病的非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人。樣品采集自正在住院的病人或出院后的不同時(shí)期。實(shí)施例1 HEV衣殼基因的克隆HEV RNA的提取根據(jù)生產(chǎn)者的說明，用QIAamp Virus RNA試劑盒(QIAGEN GbmH，Hilden，Germany)，從實(shí)驗(yàn)感染了HEV的恒河猴(Zhuang等人，1992)的肝汁中提取RNA。純化的RNA與兩倍體積的異丙醇(BDH LaboratorySupplies，England)、1/10體積的3M醋酸鈉(pH6.4)(Sigma，美國(guó))混勻，置于-20℃1小時(shí)。之后，混合物以15,000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。沉淀用70％乙醇(BDH Laboratory Supplies，英國(guó))洗一次，然后重懸于反轉(zhuǎn)錄緩沖液中。目的序列的RT-PCR為了進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RNA沉淀加到20ul RT混合物中(4ul 5×RT緩沖液[Boeringer Mannheim]；1.6ul 2.5mM dNTP；0.2ul禽成髓細(xì)胞血癥病毒(AMV)[Boeringer Mannheim]；0.625ul RNAsin[Boeringer Mannheim]；1ul下游引物E5R或E3R(150ug/ul)；12.6ul無(wú)RNAse的水)，在42℃溫育1個(gè)小時(shí)。
所用的引物列于表9。E3R和E5R是用于合成病毒的cDNA片段。分別用引物對(duì)ORF2F/ORF2Rb和ORF3F/ORF3R擴(kuò)增ORF2和ORF3的3’端區(qū)域的相應(yīng)cDNA序列。這些引物已設(shè)計(jì)成帶有BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，易于克隆擴(kuò)增的cDNA片段。所有的引物由美國(guó)LifeTechnologies合成。
最初的cDNA序列位于6326-7136位，在6957位帶有一個(gè)單堿基刪除，這段序列由引物對(duì)ORF2F/ORF2Ra克隆自O(shè)RF2區(qū)域。但是，新的E2 cDNA序列(即SE ID NO1)可以用同樣的上游引物ORF2F和新的下游引物ORF2Rb從同一區(qū)域克隆出來(lái)，ORF2Rb位于6932-6956位核苷酸處。新克隆的序列編碼相同的pE2肽(即SEQ IDNO2)，但新的終止密碼下游的序列被去除。
表9 RT和PCR引物
*引物是參照中國(guó)HEV分離株(DDBJ登錄號(hào)D11092)的序列而設(shè)計(jì)。非HEV序列用下劃線表示。
目的cDNA序列的PCR擴(kuò)增是將5ul cDNA加入45ul PCR混合物中(5ul 10×Taq緩沖液)[Boeringer Mannheim]；4ul 2.5mM dNTP混合物；1.0ul的每種引物(150ng/ul)；1ul Taq DNA聚合酶(1U/ul)[Boeringer Mannheim])和33ul超純水。加入50ul礦物油于PCR混合物表面。熱循環(huán)條件為94℃變性40秒；57℃復(fù)性40秒；72℃延伸1分鐘。從ORF2和ORF3得到的PCR產(chǎn)物分別命名為E2和E3。克隆至pGEX載體PCR產(chǎn)物用酚-錄仿抽提，然后用乙醇沉淀。產(chǎn)物E2和E3以及用BamHI和EcoRI(Boeringer Mannheim)消化。pGEX20載體由香港大學(xué)微生物系Liang Cao博士饋贈(zèng)。它來(lái)源于pGEX表達(dá)載體(Smith等人，1988)，其多克隆位點(diǎn)為5’-CCGCGTGGATCCGAAATTCCTCGAGATCGATTAG-3’，含有BamHI、EcoRI、XhoI和ClaI限制性剪切識(shí)別序列。消化的片段用瓊脂糖凝膠電泳分離，切出目的條帶，電洗脫后用乙醇沉淀。之后，用T4連接酶(Boeinger Mannheim)將E2和E3連至pGEX20。用基因脈沖器[BIO-RAD]電轉(zhuǎn)，將重組質(zhì)粒pGEX20-E2和pGEX20-E3轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中，涂布在帶有青酶素(100ug/ml)的LB瓊脂板上(Sambrook等人，1989)。挑選20個(gè)轉(zhuǎn)化克隆提取質(zhì)粒，質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和EcoRI消化，選擇預(yù)計(jì)插入片段的重組子(圖6)。本研究中所用的所有質(zhì)粒都用QIAgenminiplasmid試劑盒制備(QIAgen，Hilden，德國(guó))。測(cè)序用ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit[PERKIN ELMER]進(jìn)行DNA測(cè)序。結(jié)果顯示，811bp的E2序列位于6326-7136位，在6957位帶有一個(gè)單堿基刪除，推測(cè)是由PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤引起。產(chǎn)生的移碼突變引起翻譯在6968位的一個(gè)新終止密碼處提前終止，產(chǎn)生一個(gè)比預(yù)計(jì)小的213氨基酸、分子量為23kD的多肽，而不是最初期望的267個(gè)氨基酸。E2的位置及相關(guān)片段如圖1所示。實(shí)施例2 HEV多肽的產(chǎn)生和純化GST融合蛋白的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌中。挑選單克隆于2×YTA培養(yǎng)基(蛋白胨16g/L；酵母膏10g/L；NaCl 5g/L；青霉素100ug/L)。4ml過夜培養(yǎng)物接種到400ml 2×YTA培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)至OD600大于等于0.5。加入IPTG[Pharmacia Biotech，美國(guó)](400ul 100mM溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時(shí)。在Beckman J2-MC轉(zhuǎn)子JA-14以7000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收獲細(xì)胞。純化沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS0.8％ NaCl；0.02％KCl；0.144％Na2HPO4；0.024％KH2PO4，pH7.0)洗滌一次，重懸于20ml PBS，用SONIPREP 150[MSE]超聲破碎(30秒超聲；30秒停；35個(gè)循環(huán)；power18-22)。超聲后，加入Triton-X100(Sigma，美國(guó))至終濃度為1％，溫和振蕩混合物30分鐘。細(xì)菌裂解物在4℃離心，收集上清。融合蛋白的批次純化根據(jù)”GST Fusion Protein System Manual”用谷胱甘肽凝膠-4B[Phamacia Biotech，美國(guó)]進(jìn)行。結(jié)合融合多肽用洗脫緩沖液(10mM還原谷胱甘肽溶于50mM Tris-HCl，pH8.0)洗脫兩次，相應(yīng)于ORF2和ORF3 cDNA序列分別命名為GE2和GE3。凝血酶剪切結(jié)合于Bulk基質(zhì)的融合蛋白凝血酶[Pharmacia Biotech，美國(guó)](5ul的1U/ul溶液)和95ulPBS加入到的100ul結(jié)合于谷胱甘肽凝膠-4B的GE2，于22℃溫育16小時(shí)。離心收集上清，將第2次基質(zhì)洗滌的上清匯集在一起。這種由凝血酶剪切出的蛋白命名為pE2。實(shí)施例3 HEV多肽的鑒定SDS PAGE(SDS聚丙烯酰銨凝膠電泳)分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，1989)制備10％SDS聚丙烯酰銨凝膠。4ug多肽樣品上到凝膠上，用Minigel TwinG42[Biometra，德國(guó)]電泳槽于100伏電泳3個(gè)小時(shí)。凝膠用考馬斯亮蘭R250混合物(45ml甲醇，45ml水和10ml冰乙酸)染色。Western印跡SDS-PAGE結(jié)束后，用Mini-PROTEIN II Cell電轉(zhuǎn)儀[BIO-RAD]在100伏條件下進(jìn)行一小時(shí)，將凝膠中的蛋白被轉(zhuǎn)移到0.45um的硝酸纖維膜上[BIO-RAD，美國(guó)]。在1×PBS配制的5％脫脂奶[Carnation，Nestle]中4℃封閉過夜后，將膜與來(lái)自戊肝病人的血清(1∶500)或來(lái)自幾內(nèi)亞豬的抗GST血清(1∶1000)在室溫反應(yīng)1.5小時(shí)。洗滌三次，每次用含0.05％Tween20的PBS洗5分鐘，將膜與偶連于辣根過氧化物酶(HRP)的Protein-A[BIO-RAD，美國(guó)]在室溫反應(yīng)1.5小時(shí)。再洗三次，將膜與3-氨基-9-乙烷基咔唑[AEC SinggleSolution，ZYMED，美國(guó)]在室溫反應(yīng)5-10分鐘，產(chǎn)生陽(yáng)性帶。將膜轉(zhuǎn)移到水里而終止顏色反應(yīng)。以上所說的血清和偶聯(lián)物都是在封閉緩沖液(用1×P BS配制的5％脫脂奶[Carnation，Nestle]中稀釋)。實(shí)施例4 檢測(cè)抗HEV IgG和IgM的ELISA法的建立血清來(lái)源研究了96份采集于香港皇后瑪珈麗醫(yī)院的非甲、非乙、非丙型肝炎病人血清。其中的74份進(jìn)一步用商用HEV試劑盒[Genelabs，新加坡]測(cè)定。90份健康獻(xiàn)血者的血清采集自王后瑪麗醫(yī)院。用HEV多肽抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)用0.063ug/ml的純化pE2肽(在0.05M pH9.5的碳酸鈉溶液中的濃度為6.3ng/100ul)或0.23ug/ml的純化GE3多肽(在0.05MpH9.5的碳酸鈉溶液中的濃度為23.0ng/100ul)包被聚苯乙烯微孔滴度板[Nunc，丹麥]，用于進(jìn)行pE2或GE3的特異性測(cè)定。使用的多肽濃度預(yù)先調(diào)整到最佳。在4℃孵育過夜后，用350ul洗滌緩沖液(含有0.05％Tween20的PBS)洗一次，然后用含2％小牛血清白蛋白(BSA)[Sigma，美國(guó)]的PBS在4℃封閉24小時(shí)。板用洗滌緩沖液洗兩次。加入以1∶100稀釋的0.1ml的血清樣品到雙孔(稀釋液含1％BSA和0.2％Bronodox的PBS)，檢測(cè)HEV抗體水平。在37℃溫育30分鐘后，微孔用洗滌緩沖液洗5次。與1∶25,000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的人IgM特異的抗血清[BIOSOURC]反應(yīng)以檢測(cè)IgM抗體，與1∶16,000稀釋的HRP偶聯(lián)的蛋白A[BIO-RAD]反應(yīng)以檢測(cè)IgG抗體(稀釋液含1％BSA、0.2％bronidox、10％蔗糖的PBS)。37℃溫育30分鐘后，再洗滌5次，加入100ul TMB底物(3，3’，5，5’-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯)[Diesse，意大利]。在37℃溫育15分鐘后，用0.3M硫酸終止反應(yīng)。用Anthos 2001微孔板讀數(shù)儀[ANTHOS LAB]在450nm波長(zhǎng)讀板。為了能夠比較不同測(cè)定批次獲得的結(jié)果，每次測(cè)定都包括一份參考血清，每一次測(cè)定獲得的測(cè)試血清的OD值都針對(duì)當(dāng)次獲得的參考血清的OD值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理?？筽E2 IgG的閾值設(shè)定為由Western印跡測(cè)定無(wú)反應(yīng)的血清的平均OD值的3SD?？筽E2IgM的閾值設(shè)定為健康獻(xiàn)血者的血清的平均OD值的3SD。pE2 IgG親和力測(cè)定血清進(jìn)行系列稀釋，以雙孔方式與包被了pE2的微孔板反應(yīng)。37℃溫育30分鐘后，洗板，再用PBS(對(duì)照)或含有4M尿素的PBS在室溫下處理10分鐘。再洗板，然后如上與HRP-蛋白A偶聯(lián)物反應(yīng)。實(shí)施例5 用Western印跡檢測(cè)抗pE2 IgG血清來(lái)源實(shí)施例4中所用的所有血清用于Western印跡技術(shù)重新測(cè)試Western印跡將34ug純化的pE2上樣到SDS聚丙烯酰銨凝膠的70mm寬的單一泳道上，以100伏電泳3小時(shí)。電泳后，在一個(gè)MINI-PROTEIN IICell[BIO-RAD]電轉(zhuǎn)儀中，以100伏電轉(zhuǎn)1個(gè)小時(shí)，將多肽轉(zhuǎn)移到一張0.45um的干凈硝酸纖維素膜[BIO-RAD]。在封閉緩沖液中于4℃振蕩過夜，將膜剪成2mm的條。將條與每份以1∶250稀釋的血清分別孵育1.5小時(shí)。然后用洗滌緩沖液將條洗3次，每次5分鐘，再與以1∶30,000稀釋的堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗人IgG[Sigma，美國(guó)]在室溫孵育1.5小時(shí)。洗滌3次，加入BCIP/NBT混合物[Gibico BRL，美國(guó)]以進(jìn)行顏色反應(yīng)，將條放入水中以終止反應(yīng)。結(jié)果證實(shí)，由ELISA檢測(cè)的大多數(shù)抗體是那些能結(jié)合于pE2的二聚體形式而不是其單體形式的抗體。實(shí)施例6 免疫捕獲RT-PCR(IC-RT-PCR)特異兔多克隆抗體的產(chǎn)生用于產(chǎn)生HEV抗體的抗原是谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合蛋白GE2形式的pE2肽。重2.5-3.0公斤重的雌白兔用100ug抗原免疫。第一劑量中含有等體積的完全福氏佐劑。以后的劑量以10-14天為間隔，其中加入了不完全福氏佐劑。當(dāng)用ELISA檢測(cè)到1∶10,000稀釋的兔血清中的特異抗體時(shí)，通過靜脈給予兔子100ug溶于PBS的抗原進(jìn)行刺激。刺激后的第4天，通過心臟穿刺采血。用Western印跡和ELISA評(píng)估特異抗體。糞便懸浮液的制備在廣州第一人民醫(yī)院收集了13份急性戊肝病人的糞便。在接種HEV后的0-30天收集3只實(shí)驗(yàn)感染HEV猴子的糞便。
5克糞便樣品與20ml 1×PBS混勻，在4℃孵育1小時(shí)。混合物以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清用于免疫捕獲。貝類勻漿上清液的制備64份貝類樣品收集于香港市場(chǎng)，17份收集于環(huán)境保護(hù)系。
將20克貝肉徹底混勻，勻漿與100ml 0.2M甘氨酸-0.15M NaCl緩沖液(pH9.5)和2ml Cat-Floc貯存液(1％ W/V)混勻。得到的混合物經(jīng)渦旋混勻，在4℃孵育10分鐘。然后以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。收集上清用于免疫捕獲。HEV顆粒接種含有HEV顆粒的膽汁由Zhuang Hui教授(北京醫(yī)科大學(xué))慷慨饋贈(zèng)，肝汁是采自確證實(shí)驗(yàn)感染了HEV的恒河猴。膽汁用含1％的PBS稀釋200倍，即為貯存液。貯存液從50至56進(jìn)行5倍系列稀釋后，即為工作液。10ul的每一種工作液與5ml水、糞便上清液或貝類上清混勻，產(chǎn)生接種了HEV的樣品，用于IC-RT-PCR和直接RT-PCR比較。免疫捕獲用50mM碳酸鈉/重碳酸鈉緩沖液(pH9.6)以1∶200倍稀釋抗血清，用作包被溶液。Nunc-Immuno片[Nunc，Denmark]用1ml包被溶液在37℃包被4小時(shí)。去掉抗血清，加入1ml含2％小牛血清白蛋白(BSA)的PBS，在37℃溫育1小時(shí)。然后用含0.05％Tween20的PBS洗滌，轉(zhuǎn)移至一個(gè)管子中用于免疫捕獲。在管中加入4.5ml貝類懸浮液或20％糞便懸浮液，管子在4℃溫和振蕩過夜。免疫片，用含0.05％ Tween20的PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)移到小離心管中用于提取RNA，進(jìn)行巢式RT-PCR以檢測(cè)HEV RNA。病毒RNA提取140ul無(wú)RNAse水和560ul AVL緩沖液加入到裝有免疫片的管中。然后根據(jù)”QIAgen Viral RNA Handbook”的說明提取病毒RNA。之后，1/10體積2M醋酸鈉(pH4.6)和1倍體積的異丙醇加入到純化的RNA中?；靹蚧旌衔?，在-20℃放置1個(gè)小時(shí)，然后在4℃以14,000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。沉淀用預(yù)冷的70％乙醇洗滌1次。離心后，小心去掉乙醇，沉淀在室溫空氣干燥15分鐘，然后反轉(zhuǎn)錄成特異的cDNA。反轉(zhuǎn)錄(RT)和巢式PCR用于RT和PCR的引物列于表9。外部的引物對(duì)為A5F和A3R，內(nèi)部的引物對(duì)為B5F和B3R。
RT-PCR每一份RNA沉淀與20ul RT混合物混勻，20ulRT混合物包括4ul 5×RT緩沖液[Boeringer Mannheim]；1.6ul 2.5mM dNTP；0.2ul 25/ul的禽成髓細(xì)胞血癥病毒(AMV)[Boeringer Mannheim]；0.625ul 40U/ul的RNAsin[Boeringer Mannheim]；1ul 150ng/ul的反向引物(A3)；12.6ul無(wú)RNAse的水。在42℃溫育1個(gè)小時(shí)后，將5ul cDNA加入45ul PCR混合物中，45ul PCR混合物包括5ul 10×Taq緩沖液[Boeringer Mannheim]；4ul 2.5mM dNTP混合物；1.0ul正向和反向引物A3和A5(150ng/ul)；1ul 1U/ul的Taq DNA聚合酶[Boeringer Mannheim])和33ul超純水。將50ul礦物油加在PCR混合物表面。擴(kuò)增在DNA Thermal cycler 480[Perkin-ElmerCetus]PCR儀上進(jìn)行，熱循環(huán)條件為94℃變性40秒；57℃復(fù)性40秒；72℃延伸1分鐘20秒?？偣策\(yùn)行35個(gè)循環(huán)，最后在70℃自動(dòng)延伸。
巢式PCR和amplicon檢測(cè)2ul第一次PCR產(chǎn)物加入到48ul PCR混合物中，其成份除了引物為B3和B5外與第一次PCR相同。5ul PCR產(chǎn)物和50bp的DNA ladder[GibcoGRL]上樣于2％瓊脂糖凝膠(TBE緩沖液配制)，以100伏電泳30分鐘。凝膠用0.5ug/ml的溴化乙錠染色15分鐘，然后在紫外燈下觀察。實(shí)施例7 pE2在針對(duì)HEV的保護(hù)中的作用動(dòng)物野生恒河猴經(jīng)一個(gè)月隔離后，采血檢測(cè)ALT和HEV抗體。排除ALT/AST超過60或抗HEV IgG陽(yáng)性的猴子。將猴子分成兩組，一個(gè)為試驗(yàn)組，一個(gè)對(duì)照組。每組由3只動(dòng)物組成。免疫接種實(shí)驗(yàn)組每星期進(jìn)行1次血管內(nèi)免疫，共4次，每一劑量含100ug純化的pE2。第一劑量含有等體積的完全福氏佐劑。后來(lái)的劑量中含有不完全福氏佐劑。對(duì)照動(dòng)物注射含相應(yīng)佐劑的安慰劑。每周采集血清樣品用于檢測(cè)HEV抗體。當(dāng)特異抗體達(dá)到一個(gè)滿意水平后，給予動(dòng)物一個(gè)I/V刺激。兩組動(dòng)物在最后一次免疫兩周后，用105基因組當(dāng)量的HEV同源株進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。感染后，每?jī)商焓占淮尾《緲悠罚恐苁占淮瓮庵苎獦悠?，持續(xù)5個(gè)星期。用ficoll-hypaque梯度離心分離血漿和外周單核血細(xì)胞(PMBC)(Kanof等人，1998)。在一臺(tái)自動(dòng)分析儀上(Model 7170，HITACHI，日本)檢測(cè)新鮮采集的血清樣品中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。貯存血漿樣品用于HEV抗體和HEV基因組的檢測(cè)。HEV顆粒攻擊兩組動(dòng)物在最后一次免疫兩周后用105基因組當(dāng)量的HEV同源株進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。靈長(zhǎng)類監(jiān)測(cè)感染后，每?jī)商焓占淮尾《緲悠?，每周收集一次外周血樣品，持續(xù)5個(gè)星期。用ficoll-hypaque梯度離心分離血漿和外周單核血細(xì)胞(PMBC)(Kanof等人，1998)。在一臺(tái)自動(dòng)分析儀上(Model7170，HITACHI，日本)檢測(cè)新鮮采集的血清樣品中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。貯存血漿樣品用于HEV抗體和HEV基因組的檢測(cè)。
用北京醫(yī)科大學(xué)生產(chǎn)的商用HEV ELISA試劑盒檢測(cè)HEV抗體水平，也用包被了純化的pE2肽的微孔滴定板進(jìn)行測(cè)定。用Western印跡檢測(cè)抗純化的病毒多肽的抗體，其中約有0.5ug的pE2或100ug的GE3被上樣到70mm寬的10％SDS聚丙烯酰銨凝膠上。電泳后，病毒多肽經(jīng)電轉(zhuǎn)印跡到硝酸纖維膜上。膜在5％脫脂奶中經(jīng)4℃振蕩過夜，再剪成2mm的條備用。1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的蛋白A(BIO-RAD，美國(guó))用作第二抗體。
根據(jù)生產(chǎn)者的說明，分別用QIAmp RNA blood mini-kit和QIAgenViral RNA kit(QIAGEN，德國(guó))提取PMBC和血漿中的病毒RNA。純化的病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用巢式PCR擴(kuò)增。用于反轉(zhuǎn)錄的引物為A3R。外側(cè)引物對(duì)為A5F和A3R，內(nèi)側(cè)引物對(duì)為B5F和B3R(表9)。
免疫捕獲法用于檢測(cè)糞便樣品中的HEV。聚乙烯片[Nunc，Denmark]用1ml 1∶100稀釋的超免疫兔抗pE2血清在37℃包被4小時(shí)。包被的片用1ml含2％小牛血清白蛋白(BSA)的PBS在37℃溫育1小時(shí)進(jìn)行封閉。然后用含0.05％Tween20的PBS洗滌，片轉(zhuǎn)移至一個(gè)含4.5ml 20％糞便上清的管子中。管子在4℃溫和振蕩過夜。然后將片用含0.05％Tween20的PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的管中，用QIAgen Viral RNA kit(QIAGEN，德國(guó))提取RNA。純化的病毒RNA進(jìn)行如上所述的反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。
工業(yè)應(yīng)用克隆自戊型肝炎病毒(HEV)中國(guó)株基因組的、具有高度免疫原性的病毒多肽pE2，在研制用于HEV檢測(cè)的可靠診斷方法和診斷測(cè)定中，以及在研制人類針對(duì)HEV的保護(hù)的疫苗組成和疫苗方法中都有很大用途。
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權(quán)利要求
1.一種純化和分離的肽pE2，包括由SEQ ID NO2確定的氨基酸序列，或具有與pE2肽相似的抗原性質(zhì)的同源序列、片段或其類似物。
2.一種重組融合蛋白，包括融合于權(quán)利要求1所述的氨基酸序列的異源氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組融合蛋白，其特征在于異源氨基酸序列編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。
4.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求1所述的pE2肽的方法，其可通過化學(xué)合成或重組DNA表達(dá)。
5.一種純化和分離的核酸分子E2，包括由SEQ ID NO1確定的DNA序列，或其同源序列或片段。
6.一種純化和分離的核酸分子，包括編碼權(quán)利要求1所述的pE2肽的DNA序列。
7.一種純化和分離的核酸分子，包括由SEQ ID NO3確定的序列。
8.一種含有權(quán)利要求5或6的核酸分子的載體，其特征在于一旦將載體導(dǎo)入一種合適的宿主細(xì)胞或微生物，其能夠表達(dá)核酸分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其特征在于載體是一種質(zhì)粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其特征在于宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的載體，其特征在于真核細(xì)胞是大腸桿菌。
12.一種用權(quán)利要求8-11所述的任何一種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或微生物。
13.一種用于產(chǎn)生如權(quán)利要求1-3所述的任何一種肽或蛋白的方法，包括將編碼這種肽或蛋白的核酸分子插入一種載體構(gòu)建體，使它能夠在一種合適的宿主細(xì)胞或微生物中表達(dá)，用此載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或微生物，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或微生物，并且分離和純化得到的肽或蛋白產(chǎn)物。
14.一種產(chǎn)生針對(duì)權(quán)利要求1-3所述的任何一種pE2肽之純化的抗體的方法，包括將pE2肽以免疫學(xué)有效劑量注射到一種非人的哺乳動(dòng)物宿主中，分離和純化產(chǎn)生的抗體。
15.一種純化的抗體或其片段，其由如權(quán)利要求1-3所述的任何一種pE2肽刺激產(chǎn)生。
16.一種用于針對(duì)戊型肝炎病毒感染的免疫個(gè)體的疫苗組合物，包括如權(quán)利要求1-3所述的任何一種pE2肽，以及一種藥理學(xué)上可接受的載體。
17.如權(quán)利要求13所述的疫苗組合物的應(yīng)用，用于免疫個(gè)體防止戊型肝炎病毒的感染。
18.一種在生物學(xué)測(cè)試樣品中檢測(cè)HEV抗體存在與否的方法，包括●提供一種純化和分離的肽pE2，其包括由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列，或具有與pE2肽相似抗原性質(zhì)的同源序列、片段或其類似物；●使懷疑帶HEV抗體的生物學(xué)測(cè)試樣品與pE2肽接觸?！裨谧銐蛟试S形成一種免疫復(fù)合物(抗原-抗體)的條件下，孵育得到的混合物；●檢測(cè)混合物以確定這種免疫復(fù)合物的存在，由復(fù)合物的形成表明測(cè)試樣品中HEV抗體的存在。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于生物學(xué)測(cè)試樣品是人的血液、血清或血漿。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其特征在于在允許反應(yīng)發(fā)生的條件下與一種指示劑孵育后確定免疫復(fù)合物的存在與否。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其特征在于指示劑是一種與酶偶聯(lián)的哺乳動(dòng)物抗人免疫球蛋白，其中酶與底物反應(yīng)形成一種有顏色的產(chǎn)物。
22.一種用于檢測(cè)抗戊型肝炎病毒(HEV)抗體的診斷檢測(cè)試劑盒，包括●一種純化和分離的肽pE2，其包括由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列，或具有與pE2肽相似抗原性質(zhì)的同源序列、片段或其類似物；●一種指示劑，其能夠檢測(cè)一種帶有pE2肽的免疫復(fù)合物(抗原-抗體)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的診斷檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步包括●對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)；●樣品稀釋液和/或洗滌緩沖液。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的診斷檢測(cè)試劑盒，其特征在于pE2肽固定于一種固相支持物上。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的診斷檢測(cè)試劑盒，其特征在于固相支持物是滴定微孔板的壁。
26.一種用于檢測(cè)生物學(xué)測(cè)試樣品中戊型肝炎病毒病毒顆粒的方法，包括●提供如權(quán)利要求1 5所述的純化的抗pE2抗體；●在允許含有抗E2抗體和HEV病毒顆粒的復(fù)合物形成的條件下，使抗pE2抗體與生物學(xué)測(cè)試樣品接觸并孵育；●檢測(cè)混合物以確定復(fù)合物的存在與否，復(fù)合物的形成表明測(cè)試樣品中HEV病毒顆粒的存在。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于由抗pE2抗體捕獲的HEV病毒顆粒的存在，是通過提取病毒RNA以及應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)。
28.一種檢測(cè)生物學(xué)測(cè)試樣品中戊型肝炎病毒分析物的診斷試劑，包括權(quán)利要求15所述的純化的抗pE2抗體。
29.如權(quán)利要求15所述的純化的抗pE2抗體的應(yīng)用，作為檢測(cè)生物學(xué)測(cè)試樣品中戊型肝炎病毒分析物的診斷試劑。
30.一種用于檢測(cè)生物學(xué)測(cè)試樣品中戊型肝炎病毒分析物的診斷檢測(cè)試劑盒，包括權(quán)利要求28中所述的診斷試劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的診斷檢測(cè)試劑盒，其特征在于純化的抗pE2抗體固定于一種固相支持物上。
32.一種抗原決定簇，其特征在于這種抗原決定簇能夠被感染了戊型肝炎病毒的病人血清中的HEV抗體免疫識(shí)別，也能夠被權(quán)利要求15所述的抗pE2抗體免疫識(shí)別。
33.一種用于檢測(cè)生物學(xué)測(cè)試樣品中戊型肝炎病毒抗體的存在與否的診斷試劑，其特征在于診斷試劑包括一種蛋白、多肽或肽，其具有與權(quán)利要求1所述的pE2肽相同的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇，其能夠被抗pE2肽的抗體所識(shí)別。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高度免疫反應(yīng)性的病毒肽pE2，其來(lái)自戊型肝炎病毒(HEV)基因組ORF2區(qū)羧基末端的區(qū)域。新pE2肽的獨(dú)特特征在于其具有構(gòu)象型抗原決定簇。所述抗原決定簇僅在該肽單體與另一單體通過非共價(jià)相互作用結(jié)合，天然形成同型二聚體時(shí)才暴露。已證明新pE2肽與來(lái)自患有或過往感染HEV的患者血清有高反應(yīng)性，提示該同型二聚體可模擬HEV衣殼蛋白的某些結(jié)構(gòu)特征。此外，pE2肽的抗原活性本質(zhì)上是嚴(yán)格構(gòu)象限制性的，因此僅當(dāng)肽以二聚形式存在時(shí)才顯示免疫化學(xué)活性。因此，一旦二聚體解離則抗原活性喪失，但當(dāng)單體重新結(jié)合成二聚體后活性恢復(fù)。此外，還公開了用于檢測(cè)和診斷HEV感染的診斷方法，以及有效防止戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，其中利用了該新型pE2肽。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1391579SQ00813582
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2000年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月30日
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