專利名稱：一種檢測食管癌血清蛋白指紋的新方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測食管癌血清蛋白指紋的方法，使用該方法可確定食管癌血清蛋白質指紋標準的靈敏度、特異性指標，對食管癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療提供有益的幫助。
背景技術：
隨著全球性基因組計劃尤其是人類基因組計劃規(guī)?？涨?、速度驚人的推進，科學家現(xiàn)在已經(jīng)把關注的焦點轉移到了人類蛋白質組(proteome)——人體組織和細胞制造的各種各樣的蛋白質。雖然人類基因組包含了我們身體的全部遺傳信息，但那也只是制造蛋白質的原材料，而構成細胞并發(fā)揮各種功能則是由蛋白質來完成的。蛋白質也是機體各種不同類型細胞之間差異的決定因素，盡管所有的細胞都擁有同樣的基因組，但在不同的細胞內(nèi)會有不同的基因處在活躍狀態(tài)，從而合成不同的蛋白質。同樣，病變細胞和正常細胞的差異在很大程度上也是由功能基因及其合成蛋白質的不同來決定的。
在各大公司和學術界的科學家正試圖列出所有的蛋白質種類，并揭示他們之間相互作用的關系。實現(xiàn)這個目的并非易事，研究蛋白質要比研究基因困難得多，生物技術公司都在全力開發(fā)最好的技術和實驗儀器，這方面的競爭已經(jīng)全面展開。同時，各國政府的科研計劃也在為學術界提供經(jīng)費，支持對癌細胞、血清和其它液體成份蛋白質組的研究。其最終目的是揭示包括癌癥在內(nèi)的人類各種疾病的特征性蛋白及其組成，即具有疾病特征的“蛋白質指紋”(biomarkerpatterns)，進而發(fā)明療效更高、副作用更小的新藥。
近年來，美國Ciphergen Biosystems公司創(chuàng)建了一種蛋白質芯片(ProteinChip)技術，它不僅克服了某些傳統(tǒng)蛋白質組分析技術的局限性，集分離與質譜儀于一身，從小量血液、尿液的體液樣本和組織、細胞裂解物等粗提樣品中，不經(jīng)純化高效、快速和準確地直接分析差異蛋白質。伴隨著這一技術的出現(xiàn)，形成了一種以分析疾病相關的特殊蛋白質指紋為基礎的蛋白組組成模式(pattern)的疾病輔助診斷和預后療效判斷的新思路。
食管癌是危害我國人民健康的常見腫瘤，世界上70％以上的食管癌發(fā)生在我國，1995年部分地區(qū)統(tǒng)計資料顯示食管癌致死占惡性腫瘤死因的第四位。大部分食管癌患者確診時已屬中晚期，以手術為主治療后的五年生存率一直徘徊在25-30％。但是，早期食管癌手術治療后，五年生存率可達80％以上。因此，早診早治是目前改善食管癌患者長期生存的最佳途徑。顯然，如果能夠找到一些在影像學方法檢查出食管占位性病變之前就能發(fā)現(xiàn)早期食管癌的血清蛋白標志物，對于食管癌的治療、延長患者術后生存期具有重要意義。
腫瘤的發(fā)生發(fā)展是正常細胞經(jīng)過多基因、多步驟的變化，逐漸演變成具有惡性增殖特性的癌細胞并不斷轉移播散的過程。腫瘤細胞與增殖、凋亡、分化和轉移相關的多種基因的表達都發(fā)生了改變，變化最終表現(xiàn)為細胞內(nèi)各種蛋白質的表達和功能改變，從而影響細胞的生命活動。在癌變過程中發(fā)生改變的蛋白質和小肽可以經(jīng)腫瘤細胞代謝、分泌釋放到血液或其它體液中。因此，通過研究食管癌血清蛋白質組的改變，有可能發(fā)現(xiàn)與食管癌相關或特異的蛋白質或肽類物質，即食管癌血清蛋白標志物。目前可用于食管癌輔助診斷、療效評價和術后隨訪的血清標志物主要包括癌胚抗原(CEA)、鱗狀上皮細胞癌相關抗原(SCC)、細胞角化素蛋白片段19(CYFRA21-1)、p53蛋白抗體(p53-Ab)等，雖具有一定的臨床應用價值，但敏感性低、特異性差。因此，尋找早期診斷、無創(chuàng)性、高敏感度、高特異性的新的食管癌相關的特異血清標志“蛋白指紋”具有重要臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種檢測食管癌血清蛋白指紋的方法，使用該方法從血清標本中尋找一組(若干個)差異表達的食管癌相關的特異蛋白質/小分子肽，并利用Biomarker Patterns Software軟件分析建立最佳的樹狀分類模型，達到區(qū)分食管癌患者與非腫瘤健康人、區(qū)分食管癌與食管良性病變、區(qū)分食管癌與人體其它消化道腫瘤、以及早期發(fā)現(xiàn)食管癌的目標。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種檢測食管癌血清蛋白指紋的新方法，其步驟是采集食管癌組血清標本、對照組血清標本、早期食管癌組血清標本、食管良性疾病組血清標本及其它惡性腫瘤組血清標本；所述血清標本在離體后2-3小時內(nèi)于4℃溫度下進行離心，分離血清后分裝保存?zhèn)溆?，保存溫度?80℃；將所述血清標本置于弱陽離子親和吸附類的蛋白質芯片上進行特異性結合與洗脫處理；將所述經(jīng)過處理的芯片置入蛋白質芯片閱讀器(串聯(lián)質譜儀)分析，獲得血清標本蛋白質組圖譜；使用蛋白質芯片數(shù)據(jù)采集軟件采集數(shù)據(jù)，對比分析食管癌組和對照組血清標本的蛋白質組圖譜，結合使用蛋白質指紋樹狀模型分析軟件獲得一組食管癌組與對照組的差異蛋白質圖譜即蛋白質指紋，并以該蛋白質指紋為判斷標準進行盲篩試驗；采用盲法對其余血清標本進行篩選試驗，確定食管癌血清蛋白質指紋標準的靈敏度、特異性指標。
本發(fā)明提出了一種靈敏度高、特異性強、無創(chuàng)性、快速、小標本量和高通量的檢測方法，使用本發(fā)明的食管癌血清蛋白指紋能夠對食管癌進行早期檢測，其敏感性和特異性均達到80％以上，為食管癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療和對高危人群的預防提供了新的方法，使食管癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療成為可能。
以下結合附圖對本發(fā)明的實施例及積極效果作進一步說明。


圖1是蛋白質3975.4的膠帶形2是蛋白質3975.4的峰形3是蛋白質2047.8的峰形4是線性組合分析模型ESCC-WCX2-1示意圖具體實施方式
實施例一一種檢測食管癌血清蛋白指紋的方法，其步驟如下采集食管癌組血清標本、對照組血清標本、早期食管癌組血清標本、食管良性疾病組血清標本及其它惡性腫瘤組血清標本；其中，食管癌組為臨床病理確診為食管癌的單純手術治療病例，共199例；對照組為年齡、性別匹配的非腫瘤健康志愿者，共106例；早期食管癌組為食管早期癌微小病變(原位癌)病例，共14例；食管良性疾病組為食管炎、返流性食管炎、食管平滑肌瘤等病例，共10例；其它惡性腫瘤組為消化系統(tǒng)其它惡性腫瘤病例，共30例。
在本實施例中，被采集者清晨空腹靜脈采集全血3ml(毫升)，在離體后2-3小時內(nèi)于4℃溫度下進行離心，分離血清后分裝保存?zhèn)溆?，保存溫度?80℃。
將所述血清標本置于弱陽離子親和吸附類的蛋白質芯片上進行特異性結合與洗脫處理；經(jīng)處理后，該芯片成為結合了特定類型蛋白質的芯片。
將所述經(jīng)過處理的芯片置入蛋白質芯片閱讀器(串聯(lián)質譜儀)分析，獲得血清標本蛋白質組圖譜。
使用蛋白質芯片數(shù)據(jù)采集軟件采集數(shù)據(jù)，對比分析食管癌組和對照組血清標本的蛋白質組圖譜，結合使用蛋白質指紋樹狀模型分析軟件獲得一組食管癌組與對照組的差異蛋白質圖譜即蛋白質指紋，并以該蛋白質指紋為判斷標準進行盲篩試驗。
采用盲法對其余血清標本進行篩選試驗，確定食管癌血清蛋白質指紋標準的靈敏度、特異性指標。
實施例二一種檢測食管癌血清蛋白指紋的新方法，其步驟如下采集食管癌組血清標本、對照組血清標本、早期食管癌組血清標本、食管良性疾病組血清標本及其它惡性腫瘤組血清標本。
其中，食管癌組為臨床病理確診為食管癌的單純手術治療病例，共199例；對照組為年齡、性別匹配的非腫瘤健康志愿者，共106例；早期食管癌組為食管早期癌微小病變病例，共14例；食管良性疾病組為食管炎、返流性食管炎、食管平滑肌瘤等病例，共10例；其它惡性腫瘤組為消化系統(tǒng)其它惡性腫瘤病例，共30例。
在本實施例中，被采集者清晨空腹靜脈采集全血3ml，在離體后2-3小時內(nèi)于4℃溫度下進行離心，分離血清后分裝保存?zhèn)溆?，保存溫度?80℃。
將所述血清標本置于弱陽離子親和吸附類的蛋白質芯片上進行特異性結合與洗脫處理；所用蛋白質芯片為美國賽弗吉公司(Ciphergen Biosystems，Inc.出品。
在本實施例中，所述芯片裝入特定的加樣器(Bioprocessor)中，每個加樣點上加200μl(微升)結合緩沖液(50mM醋酸鈉，pH 4.0，Sigma公司產(chǎn)品)，搖床孵育5分鐘后棄去結合緩沖液。重復此過程一次。棄去孔中的液體，備用。
所述血清標本需經(jīng)稀釋處理，該稀釋處理的步驟是血清標本先經(jīng)蛋白濃度定量，(Micro BCA Protein Assay Kit，PIERCE公司產(chǎn)品)。
將3μl血清和6μl樣本稀釋液U9(9M Urea、2％CHAPS、50mM Tris-HCl、pH9.0和1％DTT)混合，置于冰上30分鐘，每隔5分鐘輕微混勻一次。在上述稀釋血清中加入108μl結合緩沖液，混勻后置于冰上。
所述特異性結合與洗脫處理的步驟是在所述蛋白質芯片的每個加樣孔中加入100μl稀釋的血清，蓋上錫紙，室溫下在搖床上孵育1小時。
棄去血清樣品，每個加樣孔中加入200μl結合緩沖液，搖床上洗5分鐘；棄去結合緩沖液，重復此步驟兩次；棄去結合緩沖液，每個加樣孔中加入200μl HPLC級純凈水(Millipore公司產(chǎn)品)，輕搖后立即棄去水，從加樣器上卸下所述芯片，該芯片在室溫下自然干燥。
加能量吸收分子(Energy Absorbing Molecules，EAM)取出所述芯片待微干后，在每個加樣孔上加0.5μl飽和SPA(50％乙腈(V/V)、0.5％三氟乙酸(V/V)，Sigma公司產(chǎn)品)，SPA(Sinapinic acid，EAM的一種，Ciphergen公司產(chǎn)品)。
將芯片放入芯片閱讀器(PBS II-C)，可以檢測到結合到芯片上的所有蛋白質，通過蛋白質芯片數(shù)據(jù)采集軟件(ProteinChip@Software)讀取數(shù)據(jù)，得到每一個加樣點上的所有的蛋白質圖譜。儀器的主要參數(shù)設置如下檢測分子量范圍0-50,000道爾頓；激光強度175；檢測敏感度8；檢測點24-84區(qū)(即，對芯片每點上結合蛋白恒定的激光轟擊范圍，兩相鄰激光激發(fā)位置間隔5個區(qū)，覆蓋每點中央60％的最佳蛋白結合區(qū)域)。
血清蛋白質組圖譜的初步分析利用蛋白質芯片系統(tǒng)專用軟件Ciphergen Proteinchip Software(Ciphergen公司)對已經(jīng)整合的所有數(shù)據(jù)進行初步處理，選擇其中的一些參數(shù)，如調(diào)整基線(baseline)，并將所有的蛋白質圖譜標準化到相同的總的粒子流(totalioncurrent)，再用Biomarker Wizard軟件檢測數(shù)據(jù)對已經(jīng)得到的蛋白質圖譜進行分析(選擇信噪比S/N參數(shù)為5最小峰參數(shù)為20％)，系統(tǒng)共探測到一百多個蛋白質峰，經(jīng)過T檢測得到49個P＜0.05的蛋白質峰。
食管癌患者血清差異表達蛋白質峰的獲得使用Biomarker Patterns Software高級樹狀模型分析軟件處理已經(jīng)初步得到的蛋白質的數(shù)據(jù)，選擇特定的參數(shù)配置，通過對59例食管癌和61例正常對照的分析，尋找出最佳的分析模型(命名為線性組合分析模型ESCC-WCX2-1)。食管癌血清蛋白指紋由12個不同質荷比(M/Z)的蛋白質組成。在這種分析模型中得到12個在食管癌組和對照組中具有差異表達的蛋白質峰，并聯(lián)合應用這12種蛋白質的差異可以有效地區(qū)分食管癌和非腫瘤正常對照組。這12種蛋白質的線性組合系數(shù)和分子量分別為+0.278(1028.35Da)；-0.268(1098.97Da)；-0.239(1301.71Da)；-0.235(2047.86Da)；+0.0693(2742.74Da)；-0.328(4130.07Da)；+0.308(3975.46Da)；+0.0912(4283.96Da)；-0.409(4301.17Da)；+0.153(5635.14Da)；+0.293(6203.80Da)；和+0.496(13749.1Da)。在對這兩組共計120例標本的分析中，檢測的靈敏度為91.53％，特異性為86.89％。
線性組合分析模型ESCC-WCX2-1的盲篩應用進一步選用了3組共195例血清標本，其中包括食管癌血清140例、非腫瘤正常對照血清45例和食管良性病變血清10例。
采用相同的實驗操作條件，相同的軟件處理參數(shù)，得到的蛋白質圖譜應用Biomarker Patterns Software高級線性組合模型分析軟件的盲篩功能進行篩選，觀察運用該線性組合分析模型ESCC-WCX2-1判斷的靈敏度、特異性等指標。實驗者在檢測時不知道這些標本的臨床診斷信息。
檢測結果參見圖1、圖2、圖3、圖4，其中，
圖1顯示了蛋白質3975.4的在蛋白質圖譜中的表達，對照中的表達要高于腫瘤的表達。標記的為該蛋白質的分子量的大小。
圖2顯示了蛋白質3975.4的在蛋白質圖譜中的另一種表達，對照中的表達要高于腫瘤的表達。標記的為該蛋白質的分子量的大小。
圖3顯示了蛋白質2047.8在蛋白質圖譜中的表達，腫瘤中的表達要高于對照的表達。標記的為該蛋白質的分子量的大小。
使用該線性組合分析模型ESCC-WCX2-1檢測這195例標本得到的靈敏度為85％，特異性可達到84.44％。
與食管其它良性腫瘤的關系選擇10例食管其它良性疾病對照，線性組合分析模型ESCC-WCX2-1可以將之與食管癌區(qū)分開來。
與早期食管癌(原位癌)的關系選擇14例早期食管癌(原位癌)微小病變血清，線性組合分析模型ESCC-WCX2-1可以將12例區(qū)分為食管癌，準確率為85.71％(12/14)。
與消化系統(tǒng)其它惡性腫瘤的關系選擇22例消化系統(tǒng)其它惡性腫瘤血清，線性組合分析模型ESCC-WCX2-1可以將1例區(qū)分為食管癌，準確率為95.45％(1/22)。
權利要求
1.一種檢測食管癌血清蛋白指紋的新方法，其特征在于采集食管癌組血清標本、對照組血清標本、早期食管癌組血清標本、食管良性疾病組血清標本及其它惡性腫瘤組血清標本；所述血清標本在離體后2-3小時內(nèi)于4℃溫度下進行離心，分離血清后分裝保存?zhèn)溆?，保存溫度?80℃；將所述血清標本置于弱陽離子親和吸附類的蛋白質芯片上進行特異性結合與洗脫處理；將所述經(jīng)過處理的芯片置入蛋白質芯片閱讀器(串聯(lián)質譜儀)分析，獲得血清標本蛋白質組圖譜；使用蛋白質芯片數(shù)據(jù)采集軟件采集數(shù)據(jù)，對比分析食管癌組和對照組血清標本的蛋白質組圖譜，結合使用蛋白質指紋樹狀模型分析軟件獲得一組食管癌組與對照組的差異蛋白質圖譜即蛋白質指紋，并以該蛋白質指紋為判斷標準進行盲篩試驗；采用盲法對其余血清標本進行篩選試驗，確定食管癌血清蛋白質指紋標準的靈敏度、特異性指標。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測食管癌血清蛋白指紋的方法，其步驟如下法，其特征在于所述血清標本為清晨空腹靜脈血清；所述血清標本需經(jīng)稀釋處理，該稀釋處理的步驟是血清標本先經(jīng)蛋白濃度定量，將3μl血清和6μl樣本稀釋液U9混合，置于冰上30分鐘，每隔5分鐘輕微混勻一次。在上述稀釋血清中加入108μl結合緩沖液，混勻后置于冰上；所述特異性結合與洗脫處理的步驟是在所述蛋白質芯片的每個加樣孔中加入100μl稀釋的血清，蓋上錫紙，室溫下在搖床上孵育1小時；棄去血清樣品，每個加樣孔中加入200μl結合緩沖液，搖床上洗5分鐘；棄去結合緩沖液，重復此步驟兩次；棄去結合緩沖液，每個加樣孔中加入200μl純凈水，輕搖后立即棄去水，從加樣器上卸下所述芯片，該芯片在室溫下自然干燥；取出所述芯片后，待微干后，在每個加樣孔上加0.5μl飽和SPA，芯片自然干燥后重復此步驟一次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測食管癌血清蛋白指紋的方法。該蛋白指紋由采集人血清、血清與弱陽離子親和蛋白芯片結合、用質譜儀讀取血清蛋白圖譜、以及用蛋白質指紋分析軟件對質譜數(shù)據(jù)的分析而獲得。食管癌血清蛋白指紋由12個不同質荷比(M/Z)的蛋白質組成。本發(fā)明提供的食管癌血清蛋白指紋能夠對食管癌進行早期檢測，其敏感性和特異性均達到80％以上，為食管癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療和對高危人群的預防提供了新的方法。
文檔編號G01N30/00GK1673734SQ20041000629
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月23日 優(yōu)先權日2004年3月23日
發(fā)明者趙曉航, 許洋, 毛友生 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所