專利名稱：一種檢測(cè)血清中27-5β-降膽甾烷-3,7,12,24,25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物的試劑盒及使用過程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是一種基于檢測(cè)血清中27-5β-降膽甾烷-3，7，12，對(duì)，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3，7，12，24， 25 pentol glucuronide)的試劑盒對(duì)人血清進(jìn)行超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用高通量分析，以快速測(cè)定血清中27-5β-降膽留烷-3，7，12J4，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronic^)含量來早期診斷卵巢癌的技術(shù)。
背景技術(shù)：
卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌并稱為“婦科三癌”。我國(guó)原發(fā)性卵巢癌的發(fā)病率有上升趨勢(shì)。卵巢位于盆腔深處，部位隱蔽，難以在惡性腫瘤形成的早期發(fā)現(xiàn)其存在。一般體檢和影像學(xué)檢查作用有限，一旦能夠發(fā)現(xiàn)和明確診斷時(shí)，往往已到了中、晚期，缺少預(yù)警價(jià)值。卵巢癌多為上皮性卵巢癌，早期癥狀不明顯，卵巢癌一旦出現(xiàn)癥狀，即癌組織開始增大或擴(kuò)散，表示患者大多已進(jìn)入中晚期。目前，中晚期卵巢癌的術(shù)后五年存活率低，早期卵巢癌的術(shù)后五年存活率一般較高。因此，開發(fā)新的試劑盒對(duì)卵巢癌的早期診斷十分重要。腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué)檢查是卵巢腫瘤診斷的主要手段，其中血清標(biāo)志物的檢測(cè)尤為重要。癌抗原125(CA12Q是目前最常用的漿液性卵巢癌血清標(biāo)志物，然而其特異性尚不令人滿意。在包括炎癥、結(jié)核、良性腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥及其他器官的惡性腫瘤中也有顯著升高。(文獻(xiàn) 1 :Bast RC, Xu FJ, Yu YH, et al. Int J Biol Markers 13 179-187，1998 文獻(xiàn) 2 :An HJ, Miyamoto S, Lancaster KS, et al. J Proteome Res 5 :1626-1635, 2006)。 CA125的血清水平在診斷卵巢癌時(shí)敏感性和特異性較低，對(duì)于早期卵巢癌的診斷，敏感性往往低于 25% (文獻(xiàn) 3:Rosen DG, Wang L, Atkinson JN, et al. GynecolOncol 99:267—277， 2005)。因此，為子提高臨床診斷的靈敏度和特異性，開發(fā)新的早期檢測(cè)方法勢(shì)在必行。我們通過代謝組學(xué)研究，基于超高效液相色譜-質(zhì)譜分析平臺(tái)分離檢測(cè)健康婦女、良性卵巢腫瘤和卵巢癌病人血清中的代謝物小分子，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段分析比對(duì)三組人群的代謝差異，發(fā)現(xiàn)27-5β-降膽留烷-3，7，12J4，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3,7,12,24,25 pentolglucuronide 在血清中的含量跟卵巢癌有關(guān)。27-5β-降膽留烷-3，7，12，M，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3,7,12, 24, 25 pentolglucuronide)是一種膽 it 醇葡萄糖醛酸結(jié)合物，存在于人類血液和尿液中。27-5β-降膽留烷-3，7，12J4，25-五醇 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7，12，24，25pentol)的前體物質(zhì)是膽固醇。根據(jù)卵巢癌在西方發(fā)達(dá)國(guó)家中的發(fā)病率比較高這一現(xiàn)狀，目前普遍認(rèn)為飲食中大量攝入膽固醇是導(dǎo)致卵巢癌的誘因之一。因此，測(cè)定血清中27-5 β -降膽留烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronic^)的含量變化情況有利于我們了解卵巢癌的代謝變化。目前只有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)報(bào)道了 27-5 β -降膽留烷-3，7，12，24, 25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronic^)的檢測(cè)方法，主要是氣相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用方法(文獻(xiàn)4 :Karlaganis G, AlmeB, Karlaganis V，et al. J Steroid Biochem 14:341-345,1981 文獻(xiàn) 5:Une Μ, Takenaka S, Kuramoto Τ, at al. J Lipid Res 41 :1562-1567，2000)。氣相色譜及其質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)預(yù)處理過程復(fù)雜， 需衍生化，給檢測(cè)過程帶來不可預(yù)知的誤差。目前，還沒有一種快速高效的方法既夠檢測(cè) 27-5 β -降膽留烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12,24,25pentol glucuronide)，并且還沒有人將其與卵巢癌聯(lián)系起來。本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)血清中27-5β-降膽留烷-3，7，12J4，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronide)用于卵巢癌診斷和早期檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒預(yù)處理簡(jiǎn)單，通量高，成本低、重復(fù)性好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種檢測(cè)血清中27-5 β-降膽甾烷-3，7，12，對(duì)，25-五醇葡萄糖酸酸結(jié)合物(27-ηοι·-5β-cholestane-3，7，12，24，25 pentolglucuronide)用于卵巢癌診斷和早期檢測(cè)的試劑盒。使用該試劑盒檢測(cè)血清中27-5B-降膽留烷-3， 7，12，24，25-五醇葡萄糖酸酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12，24，25 pentol glucuronide)的方法具有檢測(cè)成本低，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，通量高的特點(diǎn)，測(cè)定一個(gè)實(shí)際樣本只需10分鐘，適于臨床應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下該試劑盒由三部分構(gòu)成(1)內(nèi)標(biāo)-亮氨酸腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)品；(2)弱洗脫液-水(含體積濃度0.1%甲酸，體積濃度2%乙腈)；C3)強(qiáng)洗脫液-乙腈或甲醇。本試劑盒選用亮氨酸腦啡肽作為內(nèi)標(biāo)，可加強(qiáng)檢測(cè)準(zhǔn)確性；流動(dòng)相采用水(含體積濃度0. 1 %甲酸，體積濃度2%乙腈)、乙腈體系可以達(dá)到快速分離分析27-5 β -降膽甾烷-3，7，12，對(duì)，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3, 7，12，24，25 pentol glucuronide)的目的。本發(fā)明還開發(fā)了基于檢測(cè)試劑盒的使用條件，并在正常對(duì)照、良性卵巢腫瘤、和卵巢癌樣本中進(jìn)行了應(yīng)用。具體步驟如下1)優(yōu)化試劑盒最佳組成內(nèi)標(biāo)選擇為亮氨酸腦啡肽，可以有效加強(qiáng)檢測(cè)準(zhǔn)確性； 弱洗脫液選擇水(含體積濃度0.1%甲酸，體積濃度2%乙腈)；強(qiáng)洗脫液選擇乙腈。2)試劑盒使用條件色譜儀器為Waters超高效液相色譜，色譜柱為C18柱，柱溫 35攝氏度，流速0. ^il/min，質(zhì)譜儀器為單四極桿質(zhì)譜。3)在相同條件下取早晨空腹健康婦女、確診的良性卵巢腫瘤和卵巢癌的離體血清，采集后于4°C靜置半小時(shí)、離心15分鐘取上清(血清)后立即儲(chǔ)存于-80°C的冰箱中備用。4)血清樣品預(yù)處理樣品待測(cè)時(shí)室溫解凍，取180μ1血清，加入720μ1乙腈 (含0. 625 μ g/ml亮氨酸腦啡肽)，振蕩30秒，4°C 13000g條件下離心10分鐘后取上清液凍干，采用體積比為1 4的乙腈水混合溶液150μ1復(fù)溶后直接上樣分析，通過m/z556、m/z403提取離子流圖計(jì)算亮氨酸腦啡肽、27_5 β -降膽甾烷-3，7，12，M，25-五醇葡萄糖酸酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronic^)的峰面積及二者的比值，以確定27-5 β -降膽留烷-3，7，12，24, 25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor_5 β-cholestane-3，7，12，24，25 pentol glucuronide)的含量。5)對(duì)分析方法進(jìn)行了表征，單針進(jìn)樣重復(fù)性和日內(nèi)精密度均符合美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)3組血清樣本按隨機(jī)順序依次進(jìn)行超高效液相色譜質(zhì)譜分析。6)在血清樣本測(cè)試中，27-5 β-降膽留烷-3，7，12，M，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 θ7-ηοι·-5β-cholestane-3，7，12,24,25 pentol glucuronide)在卵巢癌組中相對(duì)健康組和良性卵巢腫瘤組有顯著性升高。27-5 β-降膽留烷-3，7，12，對(duì)，25-五醇葡萄糖酸酸結(jié)合物(27-ηοι·-5β-cholestane-3，7，12，24，25pentol glucuronide)判斷卵巢癌的靈敏度為67.2%，特異性為76.8% ；而采用CA125判斷卵巢癌的靈敏度為64. 2 %， 特異性為 45.1% (文獻(xiàn) 6:Chi DS, Zivanovic 0, Palayekar MJ, at al. Gynecol Oncol 112 :6-10, 2009) 0這說明27_5 β -降膽留烷-3，7，12，M，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronide)具有較好的卵巢癌篩查價(jià)值。本發(fā)明方法具有的效果是亮氨酸腦啡肽與27-5 β -降膽留烷-3，7，12，24, 25-五醇葡萄糖酸酸結(jié)合物 θ7-ηοι·-5β-cholestane-3，7，12，M，25 pentolglucuronide)保留時(shí)間相近，且亮氨酸腦啡肽比較穩(wěn)定，易獲得。基于上述優(yōu)點(diǎn)，利用亮氨酸腦啡肽作為內(nèi)標(biāo)， 其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可信度高?；谠摍z測(cè)方法得到的27-5 β -降膽留烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖酸酸結(jié)合物 07-nor-5 β -cholestane-3, 7，12，24，25 pentol glucuronide)含量用于卵巢癌診斷是準(zhǔn)確可信的。流動(dòng)相選擇水(含0. 甲酸，2%乙腈)和乙腈體系，可以得到最好的分離效果。基于試劑盒開發(fā)的方法具有以下特點(diǎn)樣本的采集、儲(chǔ)存采用了標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，避免引入人為誤差；預(yù)處理簡(jiǎn)單，分析過程采用超高效的液相色譜分離方法， 降低了基質(zhì)對(duì)被分析物的干擾，而且大大提高了分析通量。在血清樣本測(cè)試中，27-5β-降膽甾烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3, 7，12，24，25 pentolglucuronide)可輔助甚至代替CA125進(jìn)行原發(fā)性卵巢癌癌的診斷。利用其進(jìn)行早期診斷靈敏度和特異度均由于CA125。采用這種方法建立的診斷卵巢癌的方法，具有通量高、 靈敏度和特異性高的特點(diǎn)，適于卵巢癌的高危人群篩查和輔助診斷。


圖1人血清液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果，27-5 β-降膽留烷-3，7，12，M，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 θ7-ηοι·-5β-cholestane-3，7，12，24，25 pentolglucuronide)和亮氨酸腦啡肽的提取離子流圖。圖2㈧血清27-5 β -降膽甾烷_3，7，12，M，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronide)在健康、良性卵巢腫瘤、和卵巢癌血清樣本中的含量變化(均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)。圖2 (B)血清27-5 β -降膽甾烷_3，7，12，對(duì)，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12，24，25pentol glucuronide)在健康、良性卵巢腫瘤、和早期卵巢癌(I期)血清樣本中的含量變化(均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)。
圖3(A)非卵巢癌(健康+良性卵巢腫瘤)和卵巢癌組血清樣本中27-5β-降膽甾烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3，7，12，24，25 pentol glucuronic^)的 ROC 曲線圖AUC 值為 0· 74。圖3(B)非卵巢癌(健康+良性卵巢腫瘤)和早期卵巢癌組(I期)血清樣本中 27-5 β -降膽留烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3, 7， 12,24,25 pentol glucuronic^)的 ROC 曲線圖AUC 值為 0. 743.
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.血清樣品收集采集前，納入志愿者簽署知情同意書。在相同條件下收集43例健康婦女、確診的92例良性卵巢腫瘤、84例卵巢癌患者的血清(含45例I期卵巢癌)，采集后于4°C靜置半小時(shí)、離心15分鐘取上清后立即儲(chǔ)存于-80°C的冰箱中備用。2.分析方法2. 1血清樣本預(yù)處理樣品待測(cè)時(shí)室溫解凍，取180 μ 1血清，加入720 μ 1乙腈(含0. 625 μ g/ml亮氨酸腦啡肽)，振蕩30秒，4°C 13000g條件下離心10分鐘后取上清液凍干，采用體積比為1 4 的乙腈水混合溶液150 μ 1復(fù)溶后直接上樣分析。2. 2超高效液相色譜質(zhì)譜高溫高速分析(1)液相條件為色譜儀器為Waters超高效液相色譜，色譜柱為WatersACQUITY UPLC BEH C18柱，流動(dòng)相A為水(含體積濃度0. 1 %甲酸，體積濃度2%乙腈)，B為乙腈； 梯度洗脫條件為0 0. 5min為體積濃度2% B相，0. 5 7min線性變化至體積濃度100% B相，7min-8min保持體積濃度100% B相，8. Imin降至體積濃度2% B相，并保持2min ；流速0. 4mL/min,柱溫35°C，進(jìn)樣量3 μ L，柱后流出液不經(jīng)分流直接進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。(2)質(zhì)譜條件為質(zhì)譜儀器為Waters單四極桿質(zhì)譜，采用電噴霧離子源正離子模式檢測(cè)；脫溶劑氣和錐孔氣流量分為500L/h和50L/h，脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)?；脫溶劑氣溫度?00°C，離子源溫度為120°C;毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為3350V和33V ；采用選擇性離子監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)檢測(cè)離子為m/z 556(內(nèi)標(biāo))、m/z 403 (27_5 β -降膽留烷-3， 7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物)。每0. 05秒采集一次數(shù)據(jù)(圖1)。2. 3數(shù)據(jù)分析通過m/Z556、m/Z403提取離子流圖計(jì)算亮氨酸腦啡肽、27-5β-降膽留烷-3， 7，12，24，25-五醇葡萄糖酸酸結(jié)合物(27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronide)的峰面積，求二者的比值，以確定27-5 β -降膽甾燒-3,7,12, 24，25-五醇葡萄糖酸酸結(jié)合物 θ7-ηοι·-5β-cholestane-3，7，12，24，25 pentol glucuronide)的含量。3.血清測(cè)試結(jié)果與輔助診斷潛力分析在血清樣本測(cè)試中，27-5 β -降膽留烷-3，7，12，24, 25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronide)在 43 例健康婦女、92 例良性卵巢腫瘤、84例卵巢癌患者(含45例I期卵巢癌)的含量總結(jié)在表1中。
表1 :27-5 β -降膽甾烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7,12, 24, 25 pentol glucuronic^)在 43 例健康婦女、92 例良性卵巢腫瘤和84例卵巢癌血清中的含量
權(quán)利要求
1.一種通過檢測(cè)血清中代謝產(chǎn)物早期診斷卵巢癌的試劑盒，其特征在于該試劑盒由三部分構(gòu)成(1)內(nèi)標(biāo)-亮氨酸腦啡肽；(2)弱洗脫液-水(含體積濃度0. 1 %甲酸，體積濃度 2%乙腈或甲醇)；(3)強(qiáng)洗脫液-乙腈或甲醇。
2.—種權(quán)利要求1所述試劑盒的使用過程，其特征在于權(quán)利要求1所述試劑盒檢測(cè)的血清為采集的空腹血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用過程，其特征在于檢測(cè)過程是通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)血清中27-5 β-降膽留烷-3，7，12，M，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3,7,12,24,25pentol glucuronide)；27-5β-降膽留烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物 (27-nor-5 β -cholestane-3, 7，12，24，25pentol glucuronide)的正離子模式下的特征質(zhì)荷比為m/z 403 ；選取亮氨酸腦啡肽作為內(nèi)標(biāo)，可加強(qiáng)檢測(cè)準(zhǔn)確性，其正離子模式下的特征質(zhì)荷比為m/z 556。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的使用過程，其特征在于血清樣品待測(cè)時(shí)室溫解凍，取 100-200 μ 1血清，加入3-5倍體積乙腈(含0. 6-0. 65 μ g/ml亮氨酸腦啡肽)，振蕩20-40 秒，4-10°C 10000-15000g條件下離心10-15分鐘后取上清液凍干，采用體積比為1 4的乙腈水混合溶液5/6血清體積復(fù)溶后上樣分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的使用過程，其特征在于色譜分析采用C18柱，內(nèi)徑為2.Imm, 長(zhǎng)度為30-100mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的使用過程，其特征在于梯度洗脫條件為0 0.5min為體積濃度2%強(qiáng)洗脫液，0. 5 7min線性變化至體積濃度100%強(qiáng)洗脫液，7min-8min保持體積濃度100%強(qiáng)洗脫液，8. Imin降至體積濃度2 %強(qiáng)洗脫液，并保持2min，流速0. 2-0. 5mL/ min，柱溫 30-40 °C，進(jìn)樣量 1-5 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的使用過程，其特征在于采用電噴霧離子源正離子模式檢測(cè)；脫溶劑氣和錐孔氣流量分為400-600L/h和30-60L/h，脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)?；脫溶劑氣溫度?80-320°C，離子源溫度為110-130°C ；毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為 3000-3500V 和 30-35V ；每 0. 03-0. 1 秒采集一次數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過檢測(cè)血清中代謝產(chǎn)物早期診斷卵巢癌的試劑盒及使用過程。該試劑盒的核心在于利用液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)(LC-MS)檢測(cè)27-5β-降膽甾烷-3，7，12，24，25-五醇葡萄糖醛酸結(jié)合物(27-nor-5β-cholestane-3，7，12，24，25pentol glucuronide)。該試劑盒由內(nèi)標(biāo)亮氨酸腦啡肽、水溶液(含0.1％甲酸，2％乙腈)和乙腈組成。使用該試劑盒早期診斷卵巢癌具有檢測(cè)成本低，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，快速高效的特點(diǎn)；測(cè)定一個(gè)實(shí)際樣本只需10分鐘，適于臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N30/36GK102243216SQ201010172229
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者張曉燕, 徐叢劍, 曹銳, 王宜生, 許國(guó)旺, 路鑫, 陳靜, 黃以萍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院, 大連市婦產(chǎn)醫(yī)院