專利名稱：：Tnf拮抗劑的制作方法TNF拮抗劑發(fā)紹銀誠本發(fā)明總的來說涉及可以結(jié)合TNF并作為其拮抗劑的多肽和化合物。腫瘤壞死因子(TNF)是由多種細胞類型(包括單核細胞和巨噬細胞)產(chǎn)生的同型三聚體細胞因子，其最初是基于它們誘導(dǎo)某種小鼠腫瘤壞死的能力而得以鑒定。TNF是免疫和炎癥應(yīng)答的主要介質(zhì)之一，并且據(jù)知它例如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理中具有重要作用，所述的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種普遍的自身免疫炎性疾病，其影響大約0.5-1%的人群。而且，TNF也涉及各種各樣疾病的發(fā)病機理，包括內(nèi)毒素休克、腦型瘧和移植物抗宿主反應(yīng)。可溶并且有生物活性形式的TNF由三個相同的17kD蛋白質(zhì)亞基(同型三聚體)組成，而膜結(jié)合形式由三個相同的26kD亞基組成。重組或修飾蛋白是新興的一類治療劑。迄今，已經(jīng)公開了作為TNF拮抗劑的數(shù)種重組或修飾蛋白。特別是，已經(jīng)尋求能結(jié)合并中和TNF的抗體作為抑制TNF活性的手段。英夫利昔單抗(Remicade)和Eternarcept(Enbrel)是兩種TNF拮抗劑的實例，它們都已經(jīng)在美國和歐洲獲得了上市核準用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。這兩種產(chǎn)品也已經(jīng)顯示能有效地治療銀屑病和節(jié)段性回腸炎。英夫利昔單抗是具有鼠可變區(qū)和人IgGl和k恒定區(qū)的嵌合抗體，其通過結(jié)合可溶和跨膜形式的TNF而中和TNF的生物學(xué)活性并抑制TNF與其配體的結(jié)合。英夫利昔單抗的結(jié)構(gòu)與天然存在的抗體的結(jié)構(gòu)相似。Eternacept是一種融合蛋白，其由p75TNF受體的細胞外結(jié)構(gòu)域和人IgGl的鉸鏈和Fc結(jié)構(gòu)域制成。WO2004/0398公開了能結(jié)合TNF的4種基于人四連蛋白C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)的特異性結(jié)合多肽。該蛋白在環(huán)1區(qū)的氨基酸序列KVRSRYF(SEQIDNO:79中的四連蛋白氨基酸116-122)和環(huán)3/4區(qū)的PRHT、PTNN、PTNR或PNNR(SEQIDNO:79中的四連蛋白氨基酸146-149)與野生型CTLD不同(參見WO2004/0398,表4，46頁)。本發(fā)明已經(jīng)鑒定并分離了基于人四連蛋白C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域的特異性TNF結(jié)合蛋白，所述的蛋白具有改良的結(jié)合特性和改良的效力。該鑒定的TNF結(jié)合蛋白在它們體內(nèi)抑制和中和TNF的能力方面優(yōu)于上面的現(xiàn)有技術(shù)基于CTLD的TNF結(jié)合蛋白。這已經(jīng)例如通過它們在鼠成纖維細胞系測定法中抑制TNFa介導(dǎo)的細胞毒性的能力得到證明，這根據(jù)后面的實施例將是顯然的。而且，也已經(jīng)證明該分離的特異性TNF結(jié)合蛋白與可商業(yè)獲得的TNF拮抗劑英夫利昔單抗(Remicade)和Eternarcept(Enbrel)相比具有較好的TNF拮抗劑特性。發(fā)坊凝迷因此，本發(fā)明在第一方面涉及能結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)的多肽，其中所述的多肽含有TNF結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列KRWSRYF(SEQIDNO:1)。在進一步的方面，本發(fā)明提供了含有編碼上面確定的多肽的序列的核酸，以及提供了制備本發(fā)明的特異性多肽的方法，所述的方法包括在所述特異性多肽得以表達的條件下表達所述的核酸并回收所述特異性多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以用于制備藥物組合物，并且可用于治療患有TNF介導(dǎo)的病理學(xué)的受試者的方法，例如治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述的方法包括施用有效量的本發(fā)明特異性結(jié)合劑給受試者。本發(fā)明的這些及其它方面在下面更詳細地描述。本發(fā)明涉及以高親和力、低解離速率與TNF結(jié)合并具有高的腫瘤壞死因子(TNF)中和能力的多肽。如上面提到的，本發(fā)明的多肽源于四連蛋白C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)的支架結(jié)構(gòu)(scaffoldstructure)。C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)是已經(jīng)在大量分離自許多動物種的蛋白質(zhì)中鑒定的一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域家族。最初，CTLD結(jié)構(gòu)域被鑒定為通常所說的C型凝集素(鈣依賴糖類結(jié)合蛋白)共有的結(jié)構(gòu)域并稱為"糖識別結(jié)構(gòu)域"("CRD")。更近一些，已經(jīng)變清楚，該結(jié)構(gòu)域是許多真核蛋白質(zhì)如四連蛋白所共有的，這些真核蛋白中數(shù)種不結(jié)合糖部分，因而這種典型的結(jié)構(gòu)域被稱為CTLD。CTLD由約120個氨基酸殘基組成并且，特征性地含有兩個或三個鏈內(nèi)的二硫橋。先前在WO/0248189中已經(jīng)公開了CTLD結(jié)構(gòu)域適合用于生成配體-結(jié)合蛋白亞基的隨機化文庫。該文庫通過組合其中CTLD的環(huán)-區(qū)部分或完全用一個或多個隨機化多肽片段替換的四連蛋白CTLD框架結(jié)構(gòu)(frameworkstructure)而構(gòu)建。本發(fā)明的多肽通過使用這種隨機化文庫系統(tǒng)構(gòu)建，其中四連蛋白的CTLD結(jié)構(gòu)域用于構(gòu)建新的TNF結(jié)合多肽。根據(jù)本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽通過在體外演化步驟中的一系列仔細操作已經(jīng)達到了它們高的親和力和體內(nèi)抑制并中和TNF的能力?？偟膩碚f，本發(fā)明包括選取一種高特異性而低親和力的多肽，通過連續(xù)的親和性和結(jié)合動力學(xué)成熟步驟。根據(jù)本發(fā)明的多肽是來自多次選擇和成熟步驟的"后代"。應(yīng)該理解，本發(fā)明涉及能結(jié)合并優(yōu)選中和TNF的多肽，其中所述的多肽包含如SEQIDNO:1列出的氨基酸序列。該氨基酸序列已經(jīng)在四連蛋白CTLD框架結(jié)構(gòu)(SEQIDNO:79中的氣基酸116-122)中的所謂的環(huán)l中產(chǎn)生。該序列提供了特別有利的性質(zhì)，包括高的TNF中和活性。該氨基酸序列在下面表l中列出<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽能結(jié)合TNF多個部分。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"能結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)"指結(jié)合TNF的特異性多肽。在有用的實施方案中，本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽具有對TNF的結(jié)合親和力(Kd)優(yōu)選是lxl(T8M或更小，該結(jié)合親和力通過表面等離子共振測定。在另外有用的實施方案中，Kd值是少于1x10—9M、1x10—"M、1x101lxl(T12M、lxl(T13M、lxl(T"M，或甚至少于1x10—15M。在進一步有用的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽的K-解離速率是小于lx10—3S—、例如小于lxl(Ts-1，包括小于1x10-5S—1以及甚至少于lxIO"S-1，這通過表面等離子共振測定。術(shù)語"K-解離"，如此處使用的，旨在指根據(jù)本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽從TNF結(jié)合多肽/TNF復(fù)合物解離的解離速率常數(shù)。術(shù)語"表面等離子共振"，如此處使用的，指通過檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度的改變而使得能分析實時生物特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象，例如通過使用BIAcore系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala，Sweden)。優(yōu)選地，本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽能夠以這樣的方式結(jié)合TNF，以該方式它們部分或完全阻斷、抑制或中和TNF的生物學(xué)活性和/或其它TNF-相關(guān)活性。如此處使用的，表述"中和"表示抑制或減少體內(nèi)或體外測量的TNF的生物活性。根據(jù)本發(fā)明多肽的TNF中和或拮抗活性可以通過體外測定法如下面實施例中描述的鼠成纖維細胞L929細胞系測定法或HUVEC測定法證明的。備選地，通過體內(nèi)動物實驗測量TNF拮抗劑活性是可能合適的，所述的體內(nèi)動物實驗是如下面實施例描述的通過例如應(yīng)用Tgl97轉(zhuǎn)基因小鼠細胞系進行。在本文中，術(shù)語"腫瘤壞死因子"(在此簡寫為TNF)旨在指人細胞因子，該因子的可溶和生物活性形式由三個相同的17kD非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)亞基組成，而膜結(jié)合形式由三個相同的26kD蛋白質(zhì)亞基組成。特另'J是本術(shù)i吾旨在指ExPASy:theproteomicsserverforin—depthproteinknowledgeandanalysisNucleicAcidsRes.31:3784-3788(2003)(通過網(wǎng)址http:〃www.expasy.org登陸)中登錄名稱"TNFA-HUMAN"和主要登陸號P01375下描述的蛋白質(zhì)。TNF的結(jié)構(gòu)進一步在例如PennicaD.等，(1984)Nature312:724-729中描述。通常用于TNF的同義詞包括TNF-alpha、腫瘤壞死因子配體超家族成員2、TNF-ot和惡液質(zhì)素。如上面提到的，本發(fā)明的多肽包含基本如KRWSRYF(SEQIDNO:l)列出的氨基酸序列。"基本如……列出的"指本發(fā)明的多肽將包含與本發(fā)明的氨基酸序列KRWSRYF相同或者高度同源的氨基酸序列。"高度同源"指的是序列KRWSRYF的7個氨基酸中1、2、3或甚至是4個可以由其它氨基酸取代。因而，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的多肽可以包含與氨基酸序列KRWSRYF(SEQIDNO:l)有至少43%、57%、71%、86°/。氨基酸序列同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，氨基酸的取代是保守性取代，該保守性取代導(dǎo)致具有與具有初始氨基酸序列的多肽類似的功能和化學(xué)特性的多肽?；谙嗤膫?cè)鏈性質(zhì)，天然出現(xiàn)的氨基酸殘基可以分成(重疊的)幾類(1)疏水性氨酸基酸丙氨酸(Ala;A)、纈氨酸(Val;V)、亮氨酸(Leu;L)、異亮氨酸(Ile;I)、脯氨酸(Pro;P)、色氨酸(Trp;W)、苯丙氨酸(Phe;F)、酪氨酸(Tyr;Y)和甲硫氨酸(Met，M);(2)親水性氨基酸絲氨酸(Ser;S)、蘇氨酸(Thr;T)、天冬氨酸(Asn;N)、谷氨酰胺(Glu;Q)、谷氨酸(Glu;E)、天冬氨酸(Asp;D)、賴氨酸(Lys;K)、精氨酸(Arg;R)、組氨酸(His;H);(3)芳香族氨基酸色氨酸(Trp;W)、酪氨酸(Tyr;Y)、苯丙氨酸(Phe;F);(4)酸性氨基酸天冬氨酸(Asp;D)、谷氨酸(Glu;E);(5)堿性氨基酸賴氨酸(Lys;K)、精氨酸(Arg;R)、組氨酸(His;H);(6)帶電氨基酸天冬氨酸(Asp;D)、谷氨酸(Glu;E)、賴氨酸(Lys;K)、精氨酸(Arg;R)、組氨酸(His;H);(7)影響鏈取向的殘基甘氨酸(Gly;G))、脯氨酸(Pro;P)。保守性氨基酸取代涉及將一種上述氨基酸類型的一個成員替換相同類型的另一成員。保守性改變可以包含非常規(guī)氨基酸殘基，所述的非常規(guī)氨基酸殘基通常通過化學(xué)肽合成來整合而不是通過在生物系統(tǒng)中合成。正如從以下實施例將會明白的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多肽，除上面的序列KRWSRYF外，進一步包含通常的氨基酸序列基序PX!PX2N(SEQIDNO:2),其中Xi和l是各自獨立的氨基酸殘基，其具有特別有利的特性，包括高的TNF中和活性。在一個進一步的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽包含另外的共有氨基酸序列基序X!PX2PX3NX4(SEQIDNO:3)，其中X:是選自S、T、N、Q、E、D、K、R和H的親水性氨基酸；X2和X;是各自獨立的氨基酸殘基，并且X4是選自M、A、V、L、P、W、F、Y和C的疏水性氨基酸。在一個進一步有用的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽進一步包含氨基酸序列X,PX2PX肌(SEQIDN0:3)，其中X,是選自S、T、N、Q、E、D、K、R和H的親水性氨基酸；X2和X3是各自獨立的氨基酸殘基，并且X4是選自W、F和Y的芳香族氨基酸。在當(dāng)前優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽含有選自如下表2中SEQIDNO2-28列出的氨基酸序列表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表2清楚地看出，序列基序PXPXN可以在所有已鑒定的序列(SEQIDN0:4-28)找到。因而，可以考慮，如先前描述地，也可以將氨基酸取代(例如保守性取代)應(yīng)用于上表2中顯示的氨基酸序列。因而，可以考慮將序列SEQIDNO:4-28的13個氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至IO個用另外的氨基酸取代。因而，根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以進一步包含與任意氨基酸序列SEQIDN0:4-28具有至少約23%、31%、38%、46%、54%、62%、69%、77%、85%或92%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，氨基酸的取代是保守性取代，該保守性取代導(dǎo)致具有與具有初始氨基酸序列的多肽類似的功能和化學(xué)特性的多肽。本發(fā)明技術(shù)人員將認識到，可以將根據(jù)本發(fā)明的多種鑒定的氨基酸序列插入進特異性結(jié)合劑結(jié)構(gòu)。因而，根據(jù)本發(fā)明的給定氨基酸序列可以形成部分的任何合適的蛋白質(zhì)框架結(jié)構(gòu)或由它攜帶，前提是得到的多肽保持其如上定義的結(jié)合TNF并優(yōu)選中和TNF的生物活性的能力。然而，在優(yōu)選的實施方案中，用于攜帶產(chǎn)生的本發(fā)明氨基酸序列的結(jié)構(gòu)將一般是C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)或其實質(zhì)部分，其中產(chǎn)生的氨基酸序列SEQIDNO:1位于對應(yīng)CTLD的環(huán)1區(qū)(例如人四連蛋白氨基酸的環(huán)1區(qū)(SEQIDNO:79中的氨基酸116-122))的位置。類似地，C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)或其實質(zhì)部分可以進一步包含選自SEQIDNO2-28的產(chǎn)生的氨基酸序列，其優(yōu)選位于對應(yīng)CTLD的環(huán)3/4區(qū)(例如人四連蛋白氨基酸的環(huán)1區(qū)(SEQIDNO:79中的氨基酸116-122))的位置。在當(dāng)前優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的氨基酸連接至源于四連蛋白(如人四連蛋白)的CTLD框架結(jié)構(gòu)并因而由其攜帶。優(yōu)選地，源于人四連蛋白的CTLD結(jié)構(gòu)域是基本如SEQIDNO:79中殘基50-181列出的氨基酸序列。正如根據(jù)下面的實施例將變得明顯的，本發(fā)明人另外發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的多肽，其中源于四連蛋白的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域是基本如SEQIDNO:79中殘基50-181列出的氨基酸序列，并且其中165號天冬氨酸殘基突變?yōu)楦拾彼?，具有特別好的TNF中和性質(zhì)。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽是基于源于四連蛋白的CTLD框架的單體TNF結(jié)合多肽，其包括如以下的多肽TN3-2-B1-C22(SEQIDNO:29)、TN3-2-B1-C31(SEQIDNO:30)、TN3-2-B1-C24(SEQIDNO:31)、TN3-2-B1-C22-7(SEQIDNO:32)、TN3-2-Bl-c22-l(SEQIDNO:33)、TN3-2-Bl-c22-2(SEQIDNO:34)、TN3-2-Bl-c22-3(SEQIDNO:35)、TN3-2-Bl-c22-4(SEQIDNO:36)、TN3-2-Bl-c22-6(SEQIDNO:37)、TN3—2-Bl-c22-7(SEQIDNO:38)、TN3-2-Bl-c22-8(SEQIDNO:39)、TN3-2-Bl-c22-9(SEQIDNO:40)、TN3-2-Bl-c22-10(SEQIDNO:41)、TN3-2-Bl-c22-11(SEQIDNO:42)、TN3-2-Bl-c22-12(SEQIDNO:43)、TN3-2-Bl-c22-13(SEQIDNO:44)、TN3-2-B1-c22-14(SEQIDNO:45)、TN3-2-Bl-c22-15(SEQIDNO:46)、TN3-2-Bl-c22-16(SEQIDNO:47)、TN3-2-Bl-c7(SEQIDNO:48)、TN3-2-B1-C19(SEQIDNO:49)、TN3-2-Bl-Cl(SEQIDNO:50)、TN3-2-B1-C20(SEQIDNO:51)、TN3-2-B1-C53(SEQIDNO:52)和TN3+B1-C29(SEQIDNO:53)。為了提供提高的效力或中和能力、減少的毒性、減少的免疫原性、延長的血漿半衰期和/或防止蛋白水解降解，在有用的實施方案中本發(fā)明的多肽可通過N末端或C-末端或一個氨基酸殘基的側(cè)鏈連接至載體。示例性的載體包括Fc結(jié)構(gòu)域、線性聚合物如聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、葡聚糖；支鏈聚合物；脂質(zhì)；膽固醇類(如類固醇)；糖或寡糖；或任意天然的或合成的蛋白質(zhì)、多肽或肽，包括人血清白蛋白。連接至載體的根據(jù)本發(fā)明的多肽的一個實例是稱為GG-I10-TN-2-B1-C22-7的聚乙二醇化TNF結(jié)合多肽，其可以在實施例5中找到。在一特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽由多聚化結(jié)構(gòu)域攜帶或連接至其上。在本文中，術(shù)語"多聚化結(jié)構(gòu)域"是能與其它的、類似的或相同的多聚化結(jié)構(gòu)域相互作用的肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分。所述的相互作用是產(chǎn)生多聚化蛋白質(zhì)或多肽的相互作用類型。這種相互作用可以由該多聚化結(jié)構(gòu)域的組分之間的共價鍵以及通過氫鍵力、疏水力、范德華力和鹽橋引起。在有用的實施方案中，所述的多聚化結(jié)構(gòu)域是二聚化結(jié)構(gòu)域、三聚化結(jié)構(gòu)域、四聚化結(jié)構(gòu)域、五聚化結(jié)構(gòu)域或六聚化結(jié)構(gòu)域。三聚化結(jié)構(gòu)域的一個實施例在W095/31540中公開，其描述了含有膠原凝素頸區(qū)(neckregion)的多肽。構(gòu)成該膠原凝素頸區(qū)的氨基酸序列可以連接至任何選擇的多肽。三聚體則可以在合適的條件下用含有膠原凝素頸區(qū)氨基酸序列的三個多肽制成。在當(dāng)前一個優(yōu)選的實施方案中，C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域由源于四連蛋白的三聚化結(jié)構(gòu)域攜帶或連接至其上，并且更特別含有該四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件(后面稱為TTSE)，其先前已經(jīng)在W098/56906中詳細描述了。TTSE的氨基酸序列在SEQIDNO:80中顯示；TTSE的三聚化效果由巻曲的巻曲結(jié)構(gòu)(coilstructure)引起，該巻曲結(jié)構(gòu)與兩個另外的TTSE的巻曲的巻曲結(jié)構(gòu)相互作用形成三體a螺旋巻曲的巻曲三聚體，該三聚體格外穩(wěn)定，甚至是在相當(dāng)高的溫度下。術(shù)語TTSE也旨在包含蛋白的四連蛋白家族天然存在成員的TTSE變體、已經(jīng)在氨基酸序列中修飾而沒有在任何實質(zhì)程度上對TTSE形成a螺旋巻曲的巻曲三聚體有不利影響的變體。因而，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以包含TTSE作為三聚化結(jié)構(gòu)域，其包含與SEQIDNO:80的序列具有至少68°/。的氨基酸序列同一性，例如至少75%(包括至少87%，如至少92%)的序列。據(jù)此，TTSE(SEQIDNO:50)的半胱氨酸50可以有利地誘變?yōu)榻z氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或誘變?yōu)槿魏纹渌线m的氨基酸殘基以便避免形成不希望的鏈間二硫橋，該二硫橋的形成可以導(dǎo)致不希望的多聚化。在一個進一步的實施方案中，TTSE三聚化結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:50)可以通過下面進行修飾(i)整合進聚組氨酸序列和/或凝血因子Xa切割位點，(ii)用Ser取代Cys50,以及(iii)包括C-末端KGS序列。這種修飾的TTSE的實例在SEQIDNO:81中給出，并且稱為TripA。根據(jù)本發(fā)明的數(shù)種不同三聚體多肽的實例在下面實例中提供，在所述的三聚體多肽中應(yīng)用了上面的TTSE三聚化結(jié)構(gòu)域。這些包括基于三聚體CTLD的TNF結(jié)合多肽TN2-2-Bl-C22(SEQIDNO:54)、TN2--2--B1--C31卿IDNO:55)、TN2--2--Bl國-C24(SEQIDNO:56)、TN2--2--B1--C22--7卿IDNO:57)、TN2'-2-Bl-c22--1(SEQIDNO:58)、TN2--2-陽Bl--c22-曙2鵬IDNO:59)、TN2.-2-Bl-c22--3(SEQIDNO:60)、TN2--2--B1--c22--4(SEQIDNO:61)、TN2--2-Bl-c22--6鵬IDNO:62)、TN2--2-隱Bl--c22--7(SEQIDNO:63)、TN2--2'-Bl-c22--8(SEQIDNO:64)、TN2--2--B1-曙c22國隱9卿IDNO:65)、TN2--2--Bl--c22-10卿IDNO:66)、TN2--2--B1--c22--11卿IDNO:67)、TN2--2.-Bl-c22--12(SEQIDNO:68)、TN2--2--B1--c22--13(SEQIDNO:69)、TN2.-2--Bl-c22--14(SEQIDNO:70)、TN2--2-隱Bl--c22--15(SEQIDNO:71)、TN2--2--Bl-c22--16(SEQIDNO:72)、TN2--2.陽Bl--c7卿IDNO:73)、TN2-2-Bl-C19(SEQIDNO:74)、TN2--2--B1-隱Cl(SEQIDNO:75)、TN2-2-Bl-C20(SEQIDNO:76)、TN2--2--B1--C53鵬IDNO:77)、TN2--2--Bl--C29(SEQIDNO:78)和GG-I10-TN-2-B1-C22-7(SEQIDNO:79)。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽可以連接至該三聚化結(jié)構(gòu)域的N-或C-末端氨基酸殘基上。然而，也設(shè)想在某些實施方案中，有利地是將本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽連接至單體的三聚化結(jié)構(gòu)域的N-末端和C-末端兩者，并因而提供了含有六個能結(jié)合并中和TNF的特異性多肽的三聚體多肽。應(yīng)該理解，可任選將一柔性分子連接體插入本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽和三聚化結(jié)構(gòu)域之間并共價連接。在某些實施方案中，該連接體是約l-20個氨基酸殘基的多肽序列。該連接體可以少于IO個氨基酸，更優(yōu)選5、4、3、2或1個氨基酸。在某些案例中可能9、8、7或6個氨基酸是合適的。在有用的實施方案中，該連接體基本是非免疫原性的，不易于蛋白水解裂解并且不包含已知能與其它殘基(如半胱氨酸殘基)相互作用的氨基酸殘基。本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸。核酸包括DNA和RNA。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的核酸，所述的多肽包括包含如氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNOs2-28、SEQIDNOs29-53列出的氨基酸序列的多肽，并且更優(yōu)選包括整個三聚體多肽SEQIDNOs54-78。本發(fā)明也提供了質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達盒形式的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有如上描述的至少一種核酸。可以選擇或構(gòu)建合適的載體，使其包含合適的調(diào)控序列(包括啟動子序列、終止子序列、多聚腺苷化序列、增強子序列)、標記序列和根據(jù)需要的其它序列。根據(jù)需要，載體可以是質(zhì)粒、病毒例如噬菌體或噬菌粒。對于進一步的細節(jié)，參見例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:2ndedition,Sambrooketal.，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress。本發(fā)明也提供包含如上的一種或多種構(gòu)建體的重組宿主細胞。合適的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、酵母和桿狀病毒體系。本領(lǐng)域可用于表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NS0小鼠黑色素瘤細胞以及許多其它細胞系。一種通常的優(yōu)選的細菌宿主是大腸桿菌。本發(fā)明的多肽的表達可以方便地通過在合適條件下培養(yǎng)含有例如如下面實施例2中詳細描述的核酸的重組宿主細胞完成。優(yōu)選地，表達在期望的蛋白質(zhì)可以容易地從其中分離并在體外重折疊的表達系統(tǒng)中進行。作為一個一般性的問題，原核表達系統(tǒng)是優(yōu)選的，包括基于大腸桿菌的系統(tǒng)，因為可以獲得高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)并且可以利用有效的純化和重折疊策略。因而，不需要過度的試驗而選擇合適的或合意的表達系統(tǒng)是完全在技術(shù)人員的能力和判斷力之內(nèi)。類似地，一旦選擇了本發(fā)明多肽的一級氨基酸序列，考慮這些因素如所選擇的宿主中的密碼子偏愛、在宿主中分泌信號序列的需要、信號序列內(nèi)蛋白酶切割位點的引入等，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以容易地設(shè)計合適的多核苷酸例如編碼期望蛋白質(zhì)的重組DNA構(gòu)建體?？梢詫⑦@些重組DM構(gòu)建體按讀碼框插入進許多合適選擇的宿主的表達載體的任意一種中。合適的或合意的表達載體的選擇同樣是完全在熟練從業(yè)人員的能力和辨別力范圍內(nèi)的事情。優(yōu)選地，表達載體將包括強啟動子來驅(qū)動所述重組構(gòu)建體的表達。最后，本發(fā)明的多肽可以用本領(lǐng)域熟知的合適標準方法來分離，并任選讓其接受進行進一步的處理如冷凍干燥。本發(fā)明的多肽也可以通過選擇本領(lǐng)域已知的合適的材料和反應(yīng)條件通過化學(xué)合成產(chǎn)生。本發(fā)明的多肽將通常以藥物組合物的形式施用，所述的藥物組合物除了所述多肽外可以包含至少一種組分，并任選其它治療成分。因而，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，并且對于根據(jù)本發(fā)明的用途，除活性成分外可以包含可藥用賦型劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的材料。所述的材料在與其它成分兼容的意義上是可接受的并且對其接受者是無毒的。一般來說，用于制備藥物組合物的方法包括將活性成分與另外的組分聯(lián)合的步驟。用于經(jīng)口施用的藥物組合物可以是以片劑、膠囊劑、粉劑或液體的形式施用。片劑可以包含固體載體如明膠或輔料。液體藥物組合物通常包含液體載體如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。可以包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二元醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對于靜脈內(nèi)注射或在病患位點注射，活性成分將是腸胃外可接受的含水溶液的形式，所述的含水溶液是無熱源的并且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員完全能夠用例如等滲載體(如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液)制備合適的溶液。根據(jù)需要，可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。藥物組合物可以單獨或與其它治療結(jié)合施用，根據(jù)要治療的疾病所述的施用是同時或順序進行。其它治療可以包括施用合適劑量的疼痛緩解藥物如非齒體抗炎藥物(如阿斯匹林、樸熱息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片制劑如嗎啡或止吐劑。本發(fā)明的治療應(yīng)用包括通過施用給受試者治療有效量的本發(fā)明多肽或藥物組合物治療患有TNF介導(dǎo)的病理學(xué)的受試者。如上提到的，TNF是免疫和炎癥應(yīng)答的一種主要介質(zhì)，并且例如已知其在由TNF介導(dǎo)的廣泛疾病的發(fā)病機理中起重要作用。如此處使用的，"TNF-介導(dǎo)的疾病"或"TNF介導(dǎo)的病理學(xué)"指TNF相關(guān)的病理學(xué)或疾病。TNF相關(guān)的病理學(xué)或疾病包括但不限于以下(A)急性和慢性免疫和自身免疫病理學(xué)，例如但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、青少年慢性關(guān)節(jié)炎(JCA)、曱狀腺炎、移植物抗宿主病(GVHD)、硬皮癥、糖尿病、格雷夫斯病、變態(tài)反應(yīng)，與同種異體移植相關(guān)的急性或慢性免疫疾病，例如但不限于腎臟移植、心臟移植、骨髓移植、肝臟移植、胰腺移植、小腸移植、肺移植和皮膚移植；(B)感染，包括但不限于，膿毒病綜合征、惡病質(zhì)、急性或慢性細菌感染引起的循環(huán)性虛脫和休克、急性和慢性寄生性和/或傳染性疾病、細菌、病毒或真菌，如人免疫缺陷癥病毒(HIV)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)(包括惡病質(zhì)、自身免疫障礙、艾滋病癡呆復(fù)合征和感染的癥狀)；(C)炎性疾病，例如慢性炎性病理學(xué)，例如但不限于，結(jié)節(jié)病、慢性炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎；血管炎性病理學(xué)，例如但不限于，彌散性血管內(nèi)凝血、動脈粥樣硬化、川畸病理學(xué)和血管炎綜合征，例如但不限于，結(jié)節(jié)性多動脈炎、韋格納氏肉芽胂病、亨諾-許蘭紫癜、巨細胞動脈炎和腎臟微管炎；慢性活動性肝炎；斯耶格倫綜合征；脊推關(guān)節(jié)病，例如強直性脊柱炎、4艮屑病關(guān)節(jié)炎和脊推炎、腸病性關(guān)節(jié)炎和脊推炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和與炎性腸病相關(guān)的關(guān)節(jié)炎；以及色素膜炎；(D)神經(jīng)變性疾病，包括但不限于脫髄鞘性病，例如多發(fā)性硬化癥和急性橫貫性脊髄炎；重癥肌無力；錐體外束病和小腦障礙，例如皮質(zhì)脊髓系統(tǒng)的損傷；基底神經(jīng)節(jié)的障礙或小腦障礙；運動亢進障礙，例如亨廷頓舞蹈病和老年性舞蹈??；藥物誘導(dǎo)的運動障礙例如由阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)多巴胺受體的藥物誘導(dǎo)的運動障礙；運動不足障礙，例如帕金森??；進行性核上性麻痹；小腦和脊髓小腦障礙，例如小腦的結(jié)構(gòu)性損傷；脊髄小腦變性病(脊髄性共濟失調(diào)、弗里德賴希共濟失調(diào)、小腦皮質(zhì)變性、多系統(tǒng)變性病(Mencel、代-托二氏、Shi-Drager和MachadoJoseph))和系統(tǒng)性障礙(雷弗素姆病、血p脂蛋白缺乏癥、共濟失調(diào)、毛細血管擴張和線粒體多系統(tǒng)障礙)；運動單位障礙，例如神經(jīng)源性肌萎縮(前角細胞變性，例如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、嬰兒型脊髓性肌萎縮和青少年脊髄性肌萎縮)；阿耳茨海默病；中年的唐氏綜合征；彌漫性Lewy體疾?。籐ewy體類型的老年性癡呆；韋-科二氏綜合征；慢性酒精中毒；原發(fā)性膽汁性肝硬變；隱原性纖維化肺泡炎和其它纖維化肺疾?。蝗苎载氀?；克雅氏??；亞急性硬化性全腦炎、哈-斯二氏?。缓腿瓝魡T癡呆或它們的任意亞型；(E)涉及TNF-分泌腫瘤的惡性病理學(xué)或其它涉及TNF的惡性腫瘤，例如但不限于，白血病(急性、慢性髄細胞性、慢性淋巴細胞性和/或骨髓增生異常綜合征)；淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤，例如惡性淋巴瘤(伯基特淋巴瘤或覃樣霉菌病))；(F)涉及過量TNF的惡病質(zhì)綜合征和其它病理學(xué)和疾病，例如但不限于癌惡病質(zhì)、寄生蟲病和心臟衰竭；以及(G)乙醇誘導(dǎo)的肝炎和其它形式的慢性肝炎。本發(fā)明的多肽可以通過任何合適的途徑，通常是注射進血流中或直接注射進TNF介導(dǎo)的疾病的位點中而直接施用給有此需要的受試者或患者。例如對于診斷目的、測定方法和診斷試劑盒，本發(fā)明的多肽也可以用可檢測或功能性標記物標記?？蓹z測標記物包括放射性標記物(如1251、1311和"Tc)和熒光探針(如熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、氨基甲基香豆素和藻紅蛋白)，它們可以用蛋白質(zhì)標記領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)連接至本發(fā)明的多肽上。標記也可以包括酶標記如辣根過氧化物酶。標記進一步包括化學(xué)部分如生物素，其可以通過結(jié)合至特異性相關(guān)的可檢測部分(例如標記的抗生物素蛋白)而得以檢測。功能性標記物包括設(shè)計來靶向TNF影響區(qū)域的位點的物質(zhì)。這些功能性標記物包括毒素(如蓖麻毒素)和酶(如細菌羧肽酶或硝基還原酶)，其能夠在TNF影響的區(qū)域的位點處將前藥轉(zhuǎn)化為活性藥物。因而，牟發(fā)明也提供用于檢測樣品中的TNF的測定方法，所述的方法包括(i)將樣品與根據(jù)本發(fā)明的多肽接觸，并(ii)檢測所述多肽與TNF的結(jié)合。本發(fā)明現(xiàn)在將在以下非限制性實例和圖中通過舉例說明的方式描述。圖l顯示了L929細胞測定法中TNF的抑制，所述的細胞測定法使用作為完全的三聚體形式(TN2B1C22)和作為單體(TN3-2-Bl-c22)的TNF拮抗劑TN2-2-Bl-C22，并與Enbrel、Remicade和TNF受體II片段(RII)相比較。圖2顯示了L929細胞測定法中TNF的抑制，所述的細胞測定法使用作為單體(TN3-B1-C22-7)的TNF拮抗劑TN2-2-Bl-C22-7，并與Enbrel、Remicade和TNF受體II片段(RII)相比較。圖3顯示了L929細胞測定法中TNF的抑制，所述的細胞測定法使用作為完整三聚體形式(TN2B1C31)的TNF拮抗劑TN2-2-B1-C31，并與Enbrel、Remicade和TNF受體II片段(RII)相比較。圖4顯示了L929細胞測定法中TNF的抑制，所述的細胞測定法使用作為完整三聚體形式(TN2B1C24)的TNF拮抗劑TN2-2-Bl-C24，并與Enbrel、Remicade和TNF受體II片段(RII)相比較。圖5顯示了L929細胞測定法中TNF的抑制，所述的測定法使用TNF拮抗劑TN2-2-Bl-C22-8、TN2-2-B1-C22-14、TN2-2-B1-C22-2、TN2+Bl-C22-7、TN2-2-Bl-C22-12、TN2-2-B1-C22-19,并與Enbrel、Remicade和TNF受體II片段(RII)比較。圖6顯示了L929細胞測定法中TNF的抑制，所述的測定法使用TNF拮抗劑TN2-2-Bl-C22-8、TN2-2-B1-C22-7和TN2-2-B1-C31,并與Enbrel和Remicade相比較。圖7顯示了HUVEC測定法中TNF誘導(dǎo)的IL6和IL8生產(chǎn)的抑制，所述的測定法^f吏用TN3-2-B1-C31、TN3-2-Bl-C22-7、TN3-2-Bl-C22-8，并與Enbrel和Remicade相比較。圖8顯示了L929細胞測定法中TNF的抑制，所述的測定法使用了聚乙二醇化的GG-110-TN-2-B1-C22-7(2OkPEG-GG-110-TN-2-B1-C22-7)、非聚乙二醇化的GG-I10-TN-2-B1-C22-7(GGC22-7)和未突變的TN-2-Bl-C22-7(C22-7)(SEQIDN0:32)。Enbrel和Remicade用作對照。圖9顯示了在小鼠中TNF誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生的阻斷，所述的小鼠用TN2-2-B1-C31以三種不同的濃度注射每只小鼠12.5、25和50Pg。30分鐘后，用3Pg人TNF靜脈內(nèi)注射小鼠。圖IO顯示了在小鼠中TNF誘導(dǎo)的MCP-1產(chǎn)生的阻斷，所述的小鼠用TN2-2-B1-C31以三種不同的濃度注射每只小鼠12.5、25和50Pg。30分鐘后，用3M"g人TNF靜脈內(nèi)注射小鼠。圖11顯示了對不同組的小鼠的關(guān)節(jié)炎評分，所述的小鼠用3種不同劑量的TN2-2-B1-C31(在圖中稱為"Boreanconstruct")、鹽水溶液(陰性對照)、野生型四連蛋白(陰性對照)和Remicade(陽性對照)處理。其磁辨實施例1:TNF結(jié)合多肽的分離和構(gòu)建將四連蛋白(SEQIDNO:6)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)的支架結(jié)構(gòu)，如先前在WO/0248189中公開的，用于分離和構(gòu)建TNF結(jié)合多肽。開發(fā)的TNF結(jié)合多肽通過仔細操作的一系列體外成熟步驟獲得了它們的效力。對高特異性但是低親和力的第一種候選分子進行連續(xù)的親和力和結(jié)合動力學(xué)成熟步驟，得到的候選物是成熟的第3和第4個步驟的"后代"。成熟用噬菌體展示技術(shù)，基本上如W0/0248189中描述的進行。鑒定的基于單體CTLD的TNF結(jié)合克隆在下表3中列出，一起列出了它們對應(yīng)的SEQIDNO和環(huán)1和環(huán)3/4氨基酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>a:四連蛋白中的環(huán)1和環(huán)3/4位置外的突變；wt:野生型鑒定的克隆也用四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件(TTSE;SEQIDN0:80)以三聚體形式產(chǎn)生。上面鑒定的克隆對應(yīng)的三聚體形式在下表4中列出。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例2:TNF結(jié)合多肽的產(chǎn)生和純化本發(fā)明的TNF結(jié)合多肽一般用下列方法產(chǎn)生和純化。從含有質(zhì)粒載體(含有TNF結(jié)合多肽的編碼序列)的單個BL21-AI菌落，讓具有100Hg/mLAmp的2xTY中的6L培養(yǎng)物生長至A600=0.8，隨后用0.2%L-阿拉伯糖對其誘導(dǎo)并持續(xù)表達4小時。釆集細胞并回收包涵體。將來自6L培養(yǎng)物的壓縮的細胞沉淀顆粒在100mL50mMTris-HCLpH8.0，25w/v%蔗糖、1mMEDTA(裂解緩沖液)中通過超聲勻化。然后每100mL-裂解緩沖液加入100mg溶菌酶并混合，隨后讓樣品保留在室溫下15分鐘。然后將樣品超聲處理2-5分鐘，中間混合。加入100mL0.2MNaCl、1w/v%脫氧膽酸鈉鹽、1w/v%NonidetP40、20mMTris-HCl，pH7.5、2mMEDTA(去垢緩沖液)并混合樣品并再次超聲處理。通過在4TC、8.OOOrpm下離心25分鐘回收包涵體。棄去上清液并將沉淀顆粒再懸浮于100mL0.5w/v%TritonX-IOO、1mMEDTA，pH8中。通過在4"€、8.000rpm下離心25分鐘回收包涵體。再次重復(fù)用TritonX-100緩沖液洗滌。通過在4*C、12.000rpra下離心5分鐘回收包涵體。將包涵體再懸浮于50mL6M胍、50mMTrispH8.0、50mMDTT中。將溶液在SephadexG-25Finematrix柱上與8M脲、50mMTrispH8.0、500mMNaCl、5mMP-mere進行緩沖交換。然后在NiNTAIMAC柱(NiNTA瓊脂糖購自Qiagen)捕獲蛋白質(zhì)并用8M脲、50mMTrispH8.0、500mMNaCl、5mMP-merc洗滌該柱。然后在8M脲、50mMTrispH8.0、500mMNaCl、5mMp-merc、20mMEDTA中洗脫蛋白質(zhì)。將來自NiNTAIMAC捕獲柱的捕獲洗脫液用于IL量的稀釋重折疊。將含有3M脲、50mM甘氨酸pH9.5、250mMNaCl、2mMCaCl2、0.3mM胱胺的1L重折疊緩沖液過濾并置于7C冷藏室中的2L瓶中。加入磁性攪拌棒并將攪拌設(shè)置為250rpm。然后將變性的捕獲洗脫液蛋白質(zhì)溶液用蠕動泵以100PL/分鐘的恒定流速緩慢滴入重折疊緩沖液中。當(dāng)重折疊結(jié)束時最終的蛋白質(zhì)濃度為250Pg/mL。用從8M脲、50mM醋酸鈉pH4.5、2mMTris、2mMCaCl2至8M脲、50mM醋酸鈉pH4.5、2mMTris、2mMCaCl2、400mMNaCl的梯度(R.T.)在SP-Sepharose(Amersham)上除去多聚體。然后用總基質(zhì)體積約400mL的SephadexG-25Finematrix裝填柱子，并以10ml/min速率用1M脲、25mMNaCl、25mMTris，pH7.0平衡。將來自SP-瓊脂糖柱的洗脫液以約8ml/min的流速上樣至SephadexG-25Finematrix上。用1M脲、25mMNaCl、25mMTris，pH7.0以約8ml/min的流速洗脫蛋白質(zhì)。合并洗脫液并測量蛋白質(zhì)的濃度。以相當(dāng)于1:250%w/w(mgGrB/mg三聚體TNF結(jié)合多肽)的比率加入粒酶B。加入該酶后將溶液輕輕混合并在25匸下孵育24小時。消化后，將固體脲加入進該溶液產(chǎn)生8M脲溶液并將pH用1M醋酸鈉調(diào)至pH4.5。精選TNF結(jié)合多肽并在Source15S柱(Amersham)上用從8M脲、50mM醋酸鈉pH4.5、2mMTris、2mMCaCh至8M脲、50mM醋酸鈉pH4.5、2mMTris、2mMCaCl2、1000mMNaCl的梯度(R.T.)濃縮。最后，洗脫的單體級分可以在SephadexG-25Finematrix上通過凝膠過濾在25mM醋酸鈉pH5.0、50mMNaCl、50mM蔗糖中配制。該步驟產(chǎn)量多于95%并且蛋白質(zhì)能抵抗多次凍-融循環(huán)而通過A410沒有可見的或可測量的沉淀產(chǎn)生。實施例3:TNF結(jié)合多肽的生物學(xué)活性將表4中顯示的選擇的TNF結(jié)合多肽，即TN2-2-Bl-C22、TN2-2-B1-C31、TN2-2-Bl-C24、TN2-2-Bl-C22-7、TN2-2-Bl-C22-2、TN2-2-B1-C22-8、TN2-2-B1-C22-12、TN2-2-B1-C22-14、TN2-2-B1-C22-19以及單體TN3-2-B1-C22和TN3-2-Bl-C22-7(分別對應(yīng)TN2-2-B1-C22和TN2-2-Bl-C22-7)用L929腫瘤細胞系(一種鼠成纖維樣細胞)通過測量它們抑制TNF的生物學(xué)活性的能力進行測定。將選擇的克隆的TNF中和活性與可商業(yè)獲得的TNF拮抗劑Remicade(Eternacept)、Enbrel(英夫利昔單抗)和可溶性TNF受體II(TNFRII/TNFRSF1B,R&DSystemsCatalogno.1089-R2-025/CF)比較。TNF抑制測定根據(jù)以下測定方法進行將L929細胞(ECACCno.:85011425)在安排測定前一天以3xl07ml涂板。在開始試驗前必須讓細胞貼壁并變成匯合。將75jiL體積的細胞懸液加入進平底96-孔微量滴定板(Nunclon;Cat.No.:167008)中。保留一行8個孔沒有細胞，作為ELISA酶標儀的空白。將試驗樣品稀釋進含有2Pg/ml放線菌素D的培養(yǎng)基中得到1Pg/ml放線菌素D的最終培養(yǎng)物濃度，這時加入至細胞中。將放線菌素D(Sigma)以20Pg/ml溶解于PBS中(如果必要，升溫至37r)并以5ml(或適當(dāng)量)等份在-20C下保存。根據(jù)需要解凍出人TNF并用培養(yǎng)基稀釋至4Pg/ml-解凍的濃縮溶液在4匸下穩(wěn)定多達2周。對培養(yǎng)基中的試驗樣品進行一系列稀釋(4倍適合于TNFQC)。然后以不同濃度稀釋試驗樣品與人TNF的比例為1:1。對于每次稀釋加入75W體積至L929細胞，重復(fù)三份。在每個板上包括一個陰性對照(即僅組織培養(yǎng)基)和一個陽性對照(沒有阻斷劑的人TNF)。加入試驗樣品后在37X:、5%C02下孵育所述微量滴定板16小時。用MTT(3-[4，5-二甲基-噻唑-2-基]-2，5-二-苯基-溴化四唑錯)測量細胞增殖，MTT是CellTiter96非-放射性細胞增殖測定試劑盒(Promega)的一部分解凍MTS-和PMS溶液。為了制備足夠用于含有在150ju1體積中培養(yǎng)的細胞的96孔板，用無菌技術(shù)從棕色試劑瓶中移出3.OmlMTS溶液并轉(zhuǎn)移至試管中。在加入含有細胞的培養(yǎng)板前立即將150jj1PMS溶液加至3.0mlMTS溶液中。輕輕旋轉(zhuǎn)晃動試管以確保合并的MTS/PMS溶液完全混合。吸移30yl合并的MTS/PMS溶液進含有150jul培養(yǎng)基中的細胞的96孔測定板的每個孔中。將該板在潮濕的、5%0)2氣氛中于37'C孵育1-4小時。用ELISA酶標儀紀錄490nm下的吸光度。上面的TNF抑制測定獲得的結(jié)果在圖1、2、3、4、5和6中說明。從圖1、3和4中清楚地看出，三聚體克隆TN2B1C22、TN2B1C31和TN2B1C24(對應(yīng)單體TN3-2-Bl-C22、TN3-2-B1-C31和TN3-2-B1-C24)與Remicade(英夫利昔單抗)和可溶性TNF受體II(RII)相比全部具有相當(dāng)?shù)幕蚋玫腡NF中和能力。特別是，可以從圖1和3看出，TN2-2-B1-C22和TN2-2-B1-C31也優(yōu)于Enbrel。圖1顯示，單體形式的TN2B1C22(即TN3-2-B1-C22)的TNF抑制能力與Remicade相當(dāng)。從圖2可以看出，單體形式的TN2B1C22-7(即TN3-Bl-C22-7)優(yōu)于Remicade。實施例4:HUVEC測定法人胯帶靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)是分離自胯帶的原代未轉(zhuǎn)化的人細胞。該細胞可以在培養(yǎng)物中傳代幾次。臍帶靜脈內(nèi)皮細胞對TNF敏感。在用TNF激活后，該細胞開始產(chǎn)生炎性細胞因子如IL8和IL6。這些應(yīng)答代表了在細菌感染后的第一道防線。為了研究TNF結(jié)合多肽的效力，我們試驗了TNF誘導(dǎo)的IL6和IL8生產(chǎn)的抑制。在EGM-2培養(yǎng)基中開始測定前一天涂布HUVEC細胞(CambrexLot.Nr.2fl828)。在開始試驗前必須讓細胞貼壁并變成匯合。以每孔200W5x107mLHUVEC細胞懸液吸移進平底96孔微量滴定板(Nunclon;Cat.No.:167008)的孔中。在培養(yǎng)基中稀釋試驗樣品。試驗樣品如下制備將標明濃度的TNF結(jié)合多肽、Enbrel或Remicade與3ng/ml人TNF孵育15分鐘，然后將IOOPg所述溶液加至HUVEC細胞中，得到lng/ml的TNF終濃度。確切的稀釋范圍取決于試驗樣品的性質(zhì)和靶標的靈敏性。每個板包括一個陰性對照(即僅組織培養(yǎng)基)和一個陽性對照。加入試驗樣品后在37"C、5%C02下孵育所述微量滴定板16-24小時。第二天從板孔收集上清液并根據(jù)人IL-6&IL-8-ELISA(96孔maxisorpNunc板)的方法進行IL6和IL8(10x稀釋)Elisa來測量TNF誘導(dǎo)的細胞因子。下列材料用于ELISA:人重組IL-6:Cat.No.:206-IL-010(R&DSystems)、單克隆抗-人IL-6抗體Codeno.:MAB206(R&DSystems)、生物素化抗-人IL-6抗體Cat.No.:BAF206(R&DSystems)、人重組IL-8:Cat.No.:208-IL(R&DSystems)、單克隆抗-人IL-8抗體Codeno.:MAB208(R&DSystems),生物素化抗-人IH抗體Cat.No.:BAF208(R&DSystems)。TNF結(jié)合多肽TN3-2-Bl-C31、TN3-2-B1-C22-7、TN3-2-Bl-C22-8在上面的HUVEC測定法中試驗。該試驗得到的結(jié)果在圖6和7中說明。如可以從這些圖看到的，TNF結(jié)合多肽TN3-2-B1-C31，TN3-2-Bl-C22-7，TN3-2-B1-C22-8完全能阻斷IL8(圖6)和IL6(圖7)的誘導(dǎo)。在這方面，TNF結(jié)合多肽TN3-2-Bl-C22-7(C22-7)和TN3-2-B1-C22-8(C22-8)與Enbrel—樣好并且顯著好于Remicade。實施例5:聚乙二醇化TNF結(jié)合多肽GG-I10-TN-2-Bl-C22-7三聚體TNF結(jié)合多肽GG-I10-TN-2-Bl-C22-7(SEQIDN0:79)基本如實施例2中描述的制備，不同的是所述的溶液在SephadexG-25Finematrix柱上緩沖改變?yōu)橄旅嫣岬降木垡叶蓟彌_液。已經(jīng)通過在N-末端刪除序列中的前9個氨基酸并在N末端加入兩個甘氨酸殘基采用這種構(gòu)建體用于聚乙二醇化。將含有20mMNaCNBH3的8M脲、50mMNaH2P04pH6.0、50mMNaCl中的0.5mg/mLGG-110-TN-2-B1-C22-7溶液加入至10摩爾過量的甲氧基聚(乙二醇)丁醛(mPEG-ALD)，所述的mPEG-ALD具有20kDa的平均分子量。在約20n下過夜攪拌反應(yīng)物。隨后，通過SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)和mPEG-ALD之間的反應(yīng)程度。為了從未反應(yīng)的單體分離聚乙二醇化的GG-110-TN-2-B1-C22-7,進行了陽離子交換柱層析。將在8M脲、50mM醋酸鈉pH4.5、2mMCaCl2中平衡的1血LSource15S柱(Amersham)用反應(yīng)混合物上樣并將從8M脲、50mM醋酸鈉pH4.5、2mMCaCL至8M脲、50mM醋酸鈉pH4.5、2mMCaCl2、1000mMNaCl的線性梯度用于將聚乙二醇化蛋白和未聚乙二醇化蛋白分級。L929測定法如實施例3中描述的進行，所述的測定法使用了聚乙二醇化的GG-I10-TN-2-B1-C22-7(20kPEG-GG-I10—TN-2-B1-C22-7)、非聚乙二醇化的GG-I10-TN-2-B1-C22-7(GGC22-7)和未突變的TN-2-B1-C22-7(C22-7)(SEQIDNO:32)。Enbrel和Remicade用作對照。如從圖8可以看出的，在體外測定法中所述聚乙二醇化物質(zhì)的效力與未聚乙二醇化的物質(zhì)沒有顯著不同。實施例6:小鼠中炎性細胞因子誘導(dǎo)的體內(nèi)阻斷用3種不同濃度的TNF結(jié)合多肽TN2-2-B1-C31注射小鼠每只小鼠12.5、25和50jug。30分鐘后，用3Pg人TNF靜脈內(nèi)注射小鼠。通?？梢栽趯φ罩锌吹剑薚NF誘導(dǎo)炎性細胞因子(如IL-6和MCP-1)產(chǎn)生。然而，如從圖9和10中看到的，TNF結(jié)合多肽TN2-2-B1-C31能阻斷這些炎性細胞因子的誘導(dǎo)。實施例6:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的體內(nèi)預(yù)防。Tgl97轉(zhuǎn)基因小鼠品系表達人TNF。該小鼠攜帶5個拷貝的人TNF并在3-4周大時發(fā)展多關(guān)節(jié)炎。該疾病在第4周時是臨床上可檢測的，其具有踝關(guān)節(jié)腫脹和變形。在8-10周大時這導(dǎo)致嚴重的關(guān)節(jié)破壞和后腿腿部運動的受損。進行性體重減輕是常見的。TNF中和劑的適當(dāng)施用防止了該疾病的發(fā)展。為了試驗本發(fā)明TNF結(jié)合多肽在預(yù)防Tgl97鼠關(guān)節(jié)炎模型中的多關(guān)節(jié)炎的效力，將TN-2-Bl-C31施用給多組Tg197小鼠，這些小鼠在年齡和體重上是相當(dāng)?shù)?。?-4周大時開始預(yù)防性治療。TNF結(jié)合多肽以三種劑量施用3.3、1.0和0.5mg/kg，每周三次，腹膜內(nèi)(i.p.)施用5周。在第二次i.p.注射和試驗?zāi)┢谔崛⊙簶悠?。評估關(guān)節(jié)炎的嚴重性并表示為AS-0至AS-3的關(guān)節(jié)炎評分范圍，其中O是無關(guān)節(jié)炎以及3是由于關(guān)節(jié)中軟骨降解和骨降解引起的完全變跛。圖ll顯示了對不同組的小鼠的關(guān)節(jié)炎評分，所述的小鼠用3種不同劑量的TN2-2-Bl-C31(在圖中稱為"Boreanconstruct")、鹽水溶液(陰性對照)、野生型四連蛋白(陰性對照)和Remicade(陽性對照)處理。如可以在圖11中看到的，TN2-2-B1-C31劑量越高關(guān)節(jié)炎評分越低。這表明TN2-2-B1-C31治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是有效的。權(quán)利要求1.能結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)的多肽，其中所述的多肽包含氨基酸序列KRWSRYF(SEQIDNO1)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述的氨基酸序列形成C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域的一部分。3.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽，其中所述C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域源于四連蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其中源于四連蛋白的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域是基本如SEQIDNO:79中的殘基50-181列出的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4的多肽，其中SEQIDNO:79中的165號天冬氨酸殘基突變?yōu)楦拾彼帷?.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，所述多肽進一步包含氨基酸序列PXiPX2N(SEQIDNO:2)，其中t和^各自獨立地是氨基酸殘基。7.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，所述多肽進一步包含氨基酸序列IPXJX^(SEQIDNO:3)，其中l(wèi)是選自S、T、N、Q、E、D、K、R和H的親水性氨基酸；X2和X3各自獨立地是氨基酸殘基，以及^是選自M、A、V、L、P、W、F、Y和C的疏水性氨基酸。8.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，所述多肽進一步包含氨基酸序列X!PX2PX肌(SEQIDNO:3)，其中X!是選自S、T、N、Q、E、D、K、R和H的親水性氨基酸；X2和X3各自獨立地是氨基酸殘基，以及X,是選自W、F和Y的芳香族氨基酸。9.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，所述多肽進一步包含選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27和SEQIDNO:28。10.根據(jù)權(quán)利要求9的多肽，所述多肽選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>11.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其中所述C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域連接至源于四連蛋白的三聚化結(jié)構(gòu)域。12.根據(jù)權(quán)利要求11的多肽，其中所述源于四連蛋白的三聚化結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNO:80的序列具有至少68%氨基酸序列同一性的序列。13．根據(jù)權(quán)利要求12的多膚，其中所述氨基酸序列同一性是至少75%，例如至少87%，包括至少92%o14．根據(jù)權(quán)利要求11的多膚，其中所述源于四連蛋白的三聚化結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQIDNO:81。15．根據(jù)權(quán)利要求n的多膚，所述多膚選自TNZ一2一B1一c22(SBQIDNO:54)、TNZ一2一Bl一C31(SBQIDNO:55)、TNZ一2一Bl一C24(SEQIDNO:56)、TNZ一卜Bl一C22一7(SBQIDNO:57)、TNZ一2一Bl一c22一1(SEQIDNO:58)、TNZ一2一Bl一c22一2(SBQIDNO:59)、TNZ一2一Bl一c22一3(SEQIDNO:60)、TNZ一2一Bl一c22一4(SBQIDNO:61)、TNZ一2一Bl一c22一6(SEQIDNO:62)、TNZ一2一Bl一c22一7(SBQIDNO:63)、TNZ一2一Bl一c22一8(SBQIDNO:64)、TNZ一2一Bl一c22一9(SEQIDNO:65)、TNZ一2一Bl一c22一10(SBQIDNO:66)、TNZ一2一Bl一c22一11(SEQIDNO:67)、TNZ一2一Bl一c22一12(SBQIDNO:68)、TNZ一2一Bl一c22一13(SBQIDNO:69)、TNZ一2一Bl一c22一14(SBQIDNO:70)、TNZ一2一Bl一c22一15(SEQIDNO:71)、TNZ-2-Bl-c22一16(SEQIDNO:72)、TNZ一2一Bl一c7(SEQIDNO:73)、TNZ一2一Bl一C19(SBQIDNO:74)、TNZ-2-Bl一Cl(SBQIDNO:75)、TNZ一2一Bl一C20(SEQIDNO:76)、TNZ一2一Bl一C53(SBQIDNO:77)、TNZ-2一Bl一C29(SEQIDNO:78)和GG一110一TN一2一Bl一C22一7(SBQIDNO:79)。16．分離的核酸，所述核酸包含編碼權(quán)利要求1-15任意一項中定義的多膚的序列。17．表達載體，所述表達載體包含權(quán)利要求16的分離的核酸。18．宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求17的表達載體。19.用于制備如權(quán)利要求1-15任意一項中定義的能結(jié)合TNF的多肽的方法，所述方法包括以下步驟(i)在所述多肽得以表達的條件下表達權(quán)利要求16的分離的核酸，以及(ii)回收所述多肽。20.藥物組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求l-15任意一項的多肽。21.治療患有由TNF介導(dǎo)的病理學(xué)的受試者的方法，所述方法包括施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-15任意一項的多肽或根據(jù)權(quán)利要求20的組合物給所述受試者。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述由TNF介導(dǎo)的病理學(xué)選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和節(jié)段性回腸炎。23.用于檢測樣品中的TNF的測定方法，所述方法包括(i)讓所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求1-15任意一項的多肽接觸，并(ii)檢測TNF與所述多肽的結(jié)合。24.如權(quán)利要求l-15任意一項定義的多肽，所述多肽用作藥物。25.如權(quán)利要求l-15任意一項定義的多肽，所述多肽用于治療由TNF介導(dǎo)的疾病。26.如權(quán)利要求1-15任意一項中定義的多肽在制備藥物制劑中的用途。全文摘要具有改良結(jié)合特性和改良效力的基于人四連蛋白C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)的TNF結(jié)合多肽。該多肽包含具有氨基酸序列KRWSRYF(SEQIDNO1)的TNF結(jié)合結(jié)構(gòu)域。也提供的是制備本發(fā)明的多肽的方法。該多肽可用于制備藥物組合物，并且可用于治療具有由TNF介導(dǎo)的病理學(xué)的受試者，例如用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。文檔編號G01N33/68GK101098888SQ200580046429公開日2008年1月2日申請日期2005年11月21日優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日發(fā)明者H·K·奧托,J·D·尼蘭德,M·H·安德森,M·蒙奇,T·L·霍爾泰特申請人:伯瑞恩藥物私人有限公司