專利名稱：一種抗cd20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測方法。
背景技術(shù)：
近年來，單克隆抗體及其導向治療非霍奇金氏淋巴瘤的臨床試驗研究取得了重大進展，其中被廣泛使用且富有成效的是抗⑶20的單克隆抗體制劑。美國Genentech和IDEC公司開發(fā)的抗⑶20單克隆抗體利妥昔單抗(Rituximab,商品名Rituxan)于1997年獲得FDA批準上市，是第一個用于治療B細胞非霍奇金淋巴瘤的單克隆抗體藥物。Rituxan為IgGl (kappa)嵌合性單抗,含有鼠抗人⑶20單抗重鏈和輕鏈的可變區(qū)，人IgGl (Kappa)重鏈、輕鏈的恒定區(qū)及人IgGl的Fe部分，能與細胞表面CD20分子高親和力結(jié)合，從而導致被結(jié)合的淋巴細胞的清除。由于其在非霍奇金淋巴瘤治療中表現(xiàn)出較好的療效和較低的毒副作用，已經(jīng)成為美國銷售額最大的抗腫瘤藥物之一。研究發(fā)現(xiàn)，當抗CD20單克隆抗體與抗原的親和力提高時，抗體的特異性增強，對腫瘤細胞的殺傷效果也會顯著提高。因此在抗CD20單克隆抗體的研制過程中，如何建立評價親和力強弱的結(jié)合活性檢測方法用于篩選出高親和力的抗⑶20單抗顯得非常重要，這在抗CD20單克隆抗體的研究開發(fā)，質(zhì)量控制乃至臨床應用中都具有重要的意義。從目前文獻報道看，檢測抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的方法主要有兩種1、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，主要將高表達⑶20的細胞直接包被，經(jīng)固定后，進行ELISA檢測。這種方法缺點是操作過程復雜、費時、費力，而且CD20膜蛋白比較容易受到細胞固定液的破壞，導致抗原與抗體的結(jié)合力降低，不能真實反映抗原抗體的結(jié)合活性，只能簡單地鑒別陰、陽性結(jié)果。2、流式細胞術(shù)檢測方法一種是競爭結(jié)合檢測法，采用熒光標記的抗CD20單抗與待測樣品競爭性結(jié)合細胞表面的CD20，由標記抗體的熒光強度來判斷待測樣品與抗原的親和力。這種方法缺點是①、熒光標記效率難以標準化，如果標記不完全，易導致未標記上的抗CD20單抗與待測樣品一起與標記上熒光的抗CD20單抗競爭結(jié)合細胞表面抗原，不能真實反應抗原抗體結(jié)合效率；②、該方法是一種競爭結(jié)合實驗，只能反映待測樣品與參考品的競爭結(jié)合細胞表面CD20能力的強弱，而且該方法在穩(wěn)定性，重復性，可靠性方面也缺乏系統(tǒng)性的研究，不能真實地對待測樣品的結(jié)合活性進行評價。另一種是間接檢測法，雖然也采用商品化突光標記的FITC ant1-Human IgG進行檢測,但是方法尚未標準化,多用于研發(fā)階段的單抗篩選，即鑒別陰、陽性結(jié)果，缺乏對方法進行專屬性，準確性，重復性等方面的相關(guān)評價，對實驗結(jié)果的評價也存在不同，難以保證檢測結(jié)果的準確性與可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有文獻報道的方法中存在的上述不足，提供了一種能夠快速、簡便、準確、高效地進行抗CD20單克隆抗體藥物篩選和結(jié)合活性分析的檢測方法，該方法能夠滿足方法驗證過程中對專屬性，精密度包括重復性，日間差，人員操作誤差，線性和范圍，準確性以及耐用性等方面的要求，對于抗CD20單克隆抗體的研究開發(fā)，質(zhì)量控制乃至臨床應用都具有重要的意義。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種抗⑶20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測方法，包括下列步驟a細胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期高表達CD20的細胞，用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，計數(shù)并計算細胞密度及活率，調(diào)整至0. 5-2. OX IO6個/ml活細胞密度，加入細胞培養(yǎng)板中，陰性對照孔以加入完全培養(yǎng)基；b參考品及待測樣品稀釋取參考品及待測樣品，根據(jù)標示濃度，用完全培養(yǎng)基先稀釋至預稀釋濃度，再進行系列梯度稀釋，得到11個稀釋度；C加樣將稀釋好的系列梯度濃度的參考品及待測樣品以500 U I/孔依次加入已鋪好細胞的細胞培養(yǎng)板中，陰性對照孔加入完全培養(yǎng)基。完成后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育0. 5-lh ；d收獲細胞收獲細胞至離心管內(nèi)，用Iml預冷的洗液洗滌細胞I次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細胞，將細胞重懸于100 ill預冷的洗液中；e染色加入FITC標記的Mouse ant1-Human IgG, 10 ii I/孔,4°C避光冰浴孵育
0.5-lh ；f洗滌用Iml預冷的洗液洗滌細胞2次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細胞，將細胞重懸于Iml預冷的洗液中；g流式細胞儀測定將細胞轉(zhuǎn)入流式管，以陰性對照細胞設置陰性門和陽性門的分界線，記錄各管細胞的平均突光強度(Mean Channel Fluorescence, MCF);以LogC-MCF進行曲線擬合，得出參考品和待測樣品的EC5tl值，計算兩者EC5tl值的比值得出待測樣品相對參考品的結(jié)合活性。本發(fā)明采用的對數(shù)生長期高表達⑶20的細胞為人Burkitt' s淋巴瘤細胞Raji細胞。本發(fā)明采用的完全培養(yǎng)基是RPMI1640完全培養(yǎng)基，即在RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加10% FBS和1%雙抗(鏈霉素與青霉素)。更進一步的，在實施步驟b中，所述參考品和待測樣品合適的預稀釋濃度是10-20 u g/ml。所述參考品和待測樣品為抗人⑶20單克隆抗體。更進一步的，在實施步驟b中，所述參考品和待測樣品的系列梯度稀釋是2倍系列梯度稀釋。更進一步的，在實施步驟d、f中，所述洗液是含1% FBS的PBS溶液。本發(fā)明細胞與待測單抗若不在24孔板內(nèi)培養(yǎng)，改成在流式管或者EP管中進行抗原抗體孵育，缺點細胞容易沉降，堆積在管底，這樣就會導致細胞表面抗原與待測抗體的結(jié)合不充分，而在24孔中，板底面積大，實驗設計的細胞密度，正好鋪滿24孔板底面積的80%左右，而且細胞能夠均勻分散，這樣就有利于抗⑶20單抗到達細胞表面的⑶20表位，細胞表面的抗原與待測抗體可以充分結(jié)合。該方法專屬性好，特異性強；精密度高，重復性，日間差以及人員操作誤差RSD均小于10%，根據(jù)線性、精密度以及準確度的驗證結(jié)果，可知測定范圍為80% 120%。參考品和待測樣品的曲線擬合常數(shù)R2均大于0.95。因此，采用本發(fā)明的方法能夠快速，準確，高效的進行抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性分析，這對于抗CD20單克隆抗體的研究開發(fā)，質(zhì)量控制乃至臨床應用都具有重要的意義。


圖1 :流式熒光直方圖疊加圖，其中Plotl為陰性對照細胞，Plot 2為抗⑶20單抗與Raji細胞表面的CD20產(chǎn)生特異性結(jié)合的陽性細胞；圖2 :參考品和同型對照Human IgGl的結(jié)合活性曲線擬合圖；圖3 :參考品和待測樣品的結(jié)合活性曲線擬合圖；圖4 :抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性方法驗證(線性和范圍)_線性擬合圖；圖5 -M⑶20單克隆抗體結(jié)合活性ELISA檢測法4參數(shù)擬合圖；圖6 :參考品結(jié)合活性曲線擬合圖-不同樣品稀釋濃度范圍。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。下列實施例涉及到的材料和試劑，實驗條件和方法如下I材料和試劑材料參考品Rituxan (Biogen-1DEC公司產(chǎn)品，批號:B6027)，待測樣品(抗人0)20單克隆抗體，嘉和生物藥業(yè)有限公司制備)，Human IgGl Remicade (Johnson&Johnson公司產(chǎn)品)。試劑RPMI1640培養(yǎng)基粉末(購于GIBC0，Cat. No. 31800-022)，鏈霉素/青霉素雙抗(購于 GIBC0, Cat. No. 15070-063)，F(xiàn)BS (購于 GIBC0, Cat. No. 10099-141)，F(xiàn)ITC Mouseant1-Human IgG (購于 BD 公司，Cat. No. 555786)。細胞株Raji細胞株(購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，目錄號TCHu 44)。2抗⑶20單克隆抗體結(jié)合活性檢測過程I)細胞鋪板取對數(shù)生長期的Raji細胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，計數(shù)，并計算細胞密度及活率，調(diào)整活細胞密度至0. 5-2. 0 X IO6個/ml，以500 ii I/孔加A 24孔細胞培養(yǎng)板中，陰性對照孔以500 u I/孔加入完全培養(yǎng)基。2)參考品及待測樣品稀釋取參考品及待測樣品，根據(jù)標不濃度，用RPMI1640完全培養(yǎng)基預稀釋至10-20 y g/ml，再進行2倍系列梯度稀釋，得到11個稀釋度。3)加樣將稀釋好的系列梯度濃度的參考品及待測樣品以500 Ul/孔依次加入鋪好細胞的24孔細胞培養(yǎng)板中，陰性對照孔以500 u I/孔加入完全培養(yǎng)基。完成后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育0. 5-lh。4)收獲細胞收獲細胞至無菌的1. 5ml EP管，用Iml預冷的洗液洗滌細胞I次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細胞，將細胞重懸于100 U I預冷的洗液中。
5)染色加入FITC標記的Mouse ant1-Human IgG, 10 U I/孔，4°C避光冰浴孵育0.5-lh。6)洗滌用Iml預冷的洗液洗滌細胞2次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細胞，將細胞重懸于Iml預冷的洗液中。7)流式細胞儀測定將細胞轉(zhuǎn)入流式管中，以陰性對照細胞設置陰性門和陽性門的分界線，記錄各管細胞的平均熒光強度。8)結(jié)果分析以LogC-MCF進行曲線擬合，得出參考品和待測樣品的EC5tl值，曲線
擬合常數(shù)R2，按照下列公式計算待測樣品的結(jié)合活性
權(quán)利要求
1.ー種抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測方法，包括下列步驟 a細胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期高表達CD20的細胞，用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，計數(shù)并計算細胞密度及活率，調(diào)整至0. 5-2. OX IO6個/ml活細胞密度，加入細胞培養(yǎng)板中，陰性對照孔以加入完全培養(yǎng)基； b參考品及待測樣品稀釋取參考品及待測樣品，根據(jù)標示濃度，用完全培養(yǎng)基先稀釋至預稀釋濃度，再進行系列梯度稀釋，得到11個稀釋度； c加樣將稀釋好的系列梯度濃度的參考品及待測樣品以500 Ul/孔依次加入已鋪好細胞的細胞培養(yǎng)板中，陰性對照孔加入完全培養(yǎng)基；完成后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C，5%ニ氧化碳培養(yǎng)箱中孵育0. 5-lh ； d收獲細胞收獲細胞至離心管內(nèi)，用Iml預冷的洗液洗滌細胞I次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細胞，將細胞重懸于100 ill預冷的洗液中； e染色加入FITC標記的Mouse ant1-Human IgG, 10 u I/孔,4 °C避光冰浴孵育0.5-lh ； f洗滌用Iml預冷的洗液洗滌細胞2次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細胞，將細胞重懸于Iml預冷的洗液中； g流式細胞儀測定將細胞轉(zhuǎn)入流式管，以陰性對照細胞設置陰性門和陽性門的分界線，記錄各管細胞的平均熒光強度，以LogC-MCF進行曲線擬合，得出參考品和待測樣品的EC50值，計算兩者EC5tl值的比值得出待測樣品相對參考品的結(jié)合活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述針對對數(shù)生長期高表達CD20的細胞是人Burkitt' s淋巴瘤細胞Raji。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述完全培養(yǎng)基是含10%FBS和1%鏈霉素與青霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟b中，所述參考品和待測樣品為抗人⑶20單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟b中，所述預稀釋濃度是10-20u g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟b中，所述系列梯度稀釋是2倍系列梯度稀釋。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述洗液為PBS溶液或生理鹽水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述洗液是含1%-2% FBS的PBS溶液。
9.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述細胞培養(yǎng)板為24孔細胞培養(yǎng)板。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測方法。本發(fā)明公開了一種抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測方法，包括下列步驟a取對數(shù)生長期高表達CD20的細胞，進行細胞計數(shù)，調(diào)整至合適活細胞密度進行鋪板；b將參考品及待測樣品進行系列梯度稀釋后，依次加入鋪好細胞的培養(yǎng)板中培養(yǎng)一段時間；c收集細胞，加入FITC標記的二抗孵育一段時間；d用流式細胞儀檢測，根據(jù)檢測結(jié)果得出待測樣品結(jié)合活性。本發(fā)明所述檢測方法滿足專屬性、精密度、線性和范圍、準確性以及耐用性等驗證方面的要求，能夠有效地應用于抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測。
文檔編號G01N15/14GK103033621SQ201110302889
公開日2013年4月10日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者劉培培, 王少雄, 呂品, 陳香 申請人:嘉和生物藥業(yè)有限公司