專利名稱：熒光偏振增強(qiáng)免疫毛細(xì)管電泳分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是將熒光偏振與免疫毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，提 高免疫毛細(xì)管電泳分析水平，可應(yīng)用于多種生物分子的分析。
背景技術(shù)：
免疫毛細(xì)管電泳技術(shù)是結(jié)合毛細(xì)管電泳的高效快速分離技術(shù)和免疫分析的高度專一性而 發(fā)展起來(lái)的一種分析方法，被廣泛的應(yīng)用于研究生物大分子(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、DNA-蛋白質(zhì)、 抗原-抗體)的相互作用，DNA加合物檢測(cè)等方面。結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)方法可達(dá)單分子 水平的高靈敏度等特性，該方法已成為生物樣品分離檢測(cè)的重要技術(shù)之一，具有樣品用量少、 檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但由于熒光染料與生物大分子的結(jié)合存在一定的不穩(wěn)定性， 進(jìn)行免疫毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)時(shí)，可能出現(xiàn)熒光染料水解脫落現(xiàn)象從而影響分析結(jié) 果，需要進(jìn)一步分離去除。
熒光偏振技術(shù)是一種重要的分析手段，可以在納秒范圍內(nèi)反映熒光標(biāo)記的旋轉(zhuǎn)差異，在 研究分子間相互作用方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。通常，熒光物質(zhì)由于其分子量小，旋轉(zhuǎn)速度 快，受偏振光激發(fā)時(shí)產(chǎn)生的熒光幾乎可以消偏振；當(dāng)熒光物質(zhì)結(jié)合到大分子物質(zhì)，如DNA， 蛋白質(zhì)等，其旋轉(zhuǎn)受限而速度變慢，熒光偏振顯著增大。根據(jù)熒光分子受到平面偏振光激發(fā) 時(shí)發(fā)射的偏振光變化，判斷目標(biāo)分子間的作用模式。
本發(fā)明將熒光偏振與免疫毛細(xì)管電泳兩種分析技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)偏振減扣的方法消除免 疫毛細(xì)管電泳檢測(cè)中熒光染料從標(biāo)記的生物大分子上水解脫落產(chǎn)生的干擾，無(wú)需進(jìn)一步分離， 具有操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)勢(shì)，可以應(yīng)用于多種生物樣品的免疫毛細(xì)管電泳分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種熒光偏振增強(qiáng)型的免疫毛細(xì)管電泳分析技術(shù)。 用垂直偏振光激發(fā)熒光染料，可以在垂直和水平的偏振平面檢測(cè)發(fā)射光，即垂直偏振光 (/v)和水平偏振光(A)。 一般情況下，分子量小的熒光染料，其旋轉(zhuǎn)速度快，受偏振光激
發(fā)時(shí)，垂直偏振光和水平偏振光的熒光響應(yīng)大致相同，幾乎可以消偏振；而當(dāng)熒光染料結(jié)合
到DNA和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)后旋轉(zhuǎn)速度變慢，熒光偏振顯著增大。
基于這一特性，本發(fā)明利用垂直偏振光和水平偏振光減扣(/V-/A)技術(shù)排除免疫毛細(xì)管電 泳檢測(cè)中從熒光標(biāo)記生物大分子上脫落的熒光染料對(duì)目標(biāo)免疫復(fù)合物的千擾。由于熒光染料Ka， /v- A接近于零，偏振減扣后幾乎可以完全去除其干擾。標(biāo)記于生物大分子上的熒光染 料，具有較大的偏振值，因此標(biāo)記于生物大分子上的熒光染料進(jìn)行偏振減扣后仍部分存在。 因此免疫毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光偏振減扣后只能夠檢測(cè)到標(biāo)記在生物大分子上的熒光染 料信號(hào)，無(wú)需進(jìn)一步分離即可排除脫落熒光染料的干擾。
本發(fā)明克服了傳統(tǒng)免疫毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)方法中脫落熒光染料的千擾，將在 線熒光偏振技術(shù)與之結(jié)合，通過(guò)偏振減扣方法無(wú)需進(jìn)一步分離，在色譜工作站中直接實(shí)現(xiàn)脫 落熒光染料的扣除，操作簡(jiǎn)便，可以用于DNA加合物、DNA甲基化水平以及生物大分子相 互作用等多種生物樣品的免疫毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光精確分析。


圖l為在線熒光偏振技術(shù)雙通道檢測(cè)示意圖2為抗體復(fù)合物的immuno-CE-LIFP檢測(cè)電泳圖3為imuno-CE-LIFP檢測(cè)3 ng/mL的m XDNA整體甲基化水平；
圖4為immuno-CE-LIFP檢測(cè)0.01 pg/mL的m XDNA整體甲基化水平。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的具體實(shí)施方法簡(jiǎn)述如下
進(jìn)行免疫分析時(shí)，熒光染料容易從標(biāo)記的生物大分子上脫落下來(lái)，影響目標(biāo)復(fù)合物的檢 測(cè)，而在線熒光偏振技術(shù)可以排除脫落熒光染料的干擾，無(wú)需進(jìn)一步分離，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo) 復(fù)合物的檢測(cè)。
免疫毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光偏振檢測(cè)(immuno-CE-LIFP)過(guò)程中，如附圖1所示熒 光染料被激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的水平偏振光(/A)和垂直偏振光(/v)，分別由不同光電倍增管 檢測(cè)，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化器將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)后記錄入計(jì)算機(jī)，利用色譜工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 在色譜工作站中進(jìn)行水平偏振光和垂直偏振光之間信號(hào)的減扣，得到水平偏振光(/A)和垂 直偏振光(/v)信號(hào)減扣后的新電泳譜圖。
單純熒光染料由于分子量小/v-A接近于零，在減扣后的新電泳譜圖中幾乎消失。而標(biāo)記 于生物大分子上的熒光染料，分子量增大旋轉(zhuǎn)速度受限，其偏振值增大，所以標(biāo)記于生物大 分子上的熒光染料在垂直偏振光(/v)和水平偏振光(A)信號(hào)減扣后仍部分存在。在偏振減 扣后的新電泳譜圖中僅有標(biāo)記于生物大分子上的熒光染料信號(hào)，而脫落熒光染料的信號(hào)干擾則幾乎被完全扣除，因此可以對(duì)目標(biāo)復(fù)合物進(jìn)行確定的定性及定量分析。
實(shí)施例1、熒光標(biāo)記抗體復(fù)合物的immuno-CE-LIFP檢測(cè)
Alexa Fluor 546熒光標(biāo)記的Fc特異性抗IgGl的F (ab，)片段能夠與IgGl亞型的5-甲基 胞嘧啶單克隆抗體非共價(jià)結(jié)合，形成抗體復(fù)合物，將此抗體復(fù)合物進(jìn)行immuno-CE-LIFP檢 測(cè)。附圖2顯示，譜圖1和2分別為對(duì)抗體復(fù)合物進(jìn)行immuno-CE-LIFP分析時(shí)水平偏振光 (A)和垂直偏振光(/v)信號(hào)的電泳譜圖。在色譜工作站中將水平偏振光電泳譜圖設(shè)為背景， 在垂直偏振光電泳譜圖中進(jìn)行背景扣除，通過(guò)在線偏振減扣(/V-/A)獲得譜圖3。對(duì)電泳譜圖 進(jìn)行分析，熒光標(biāo)記的二抗無(wú)法與一抗二抗復(fù)合物分開，重疊為一個(gè)峰(峰1)。分析譜圖1 和2的峰2，發(fā)現(xiàn)峰2由a和b兩部分組成，其中b為峰2的肩峰。偏振減扣后峰2a仍有8M 信號(hào)，而峰2b幾乎消失，證明峰2b為脫落熒光染料的信號(hào)峰。峰2a的部分存在可能是由未 知的蛋白-染料結(jié)合造成，具有一定的偏振因此不能完全扣除。結(jié)果證明脫落熒光染料近乎為 零的偏振可以通過(guò)偏振減扣消除。
實(shí)施例2、 imuno-CE-LIFP檢測(cè)3 ng/mL的m 5iDNA整體甲基化水平
利用5-甲基胞嘧啶單克隆抗體作為一抗，Alexa Fluor 546熒光標(biāo)記的Fc特異性抗IgGl 的F (ab')片段為本發(fā)明采用的二抗，將抗體與3 ng/mL的待測(cè)DNA反應(yīng)后，能夠形成DNA 抗體免疫復(fù)合物，根據(jù)免疫復(fù)合物生成量確定甲基化處理的XDNA(mXDNA)中整體甲基化 水平。Immuno-CE-LIFP分析待測(cè)DNA與抗體反應(yīng)混合物，附圖3中譜圖1和2分別為對(duì)反 應(yīng)混合物合物進(jìn)行immuno-CE-LIFP分析時(shí)水平偏振光(/"和垂直偏振光(/v)信號(hào)的電泳 譜圖，如實(shí)例1所述通過(guò)在線偏振減扣(/V-/A)獲得譜圖3。譜圖3顯示峰2有a和b兩個(gè)峰， 通過(guò)在線偏振扣除，峰2a和2b仍然存在，且通過(guò)扣除二者的分離度有所提高(至少2倍)， 與實(shí)例1對(duì)比結(jié)果顯示峰2b為排除脫落熒光染料干擾的目標(biāo)DNA-抗體免疫復(fù)合物,對(duì)DNA-抗體免疫復(fù)合物峰面積進(jìn)行積分可以對(duì)待測(cè)DNA中整體甲基化水平進(jìn)行精確定量。
實(shí)施例3、 immuno-CE-LIFP檢測(cè)0.01嗎/mL的mM)NA擎體甲基化水平
將O.Ol ng/mL的m人DNA與一抗(5-甲基胞嘧啶單克隆抗體)和二抗(Alexa Fluor 546 熒光標(biāo)記的Fc特異性抗IgGl的F (ab')片段)反應(yīng)，immuno-CE-LIFP檢測(cè)待測(cè)DNA的整 體甲基化水平。附圖4中譜圖1為抗體復(fù)合物的immuno-CE-LIFP在線偏振減扣(/v- /A)譜 圖，譜圖2為待測(cè)DNA與抗體反應(yīng)混合物的immuno-CE-LIFP在線偏振減扣(/V-/A)譜圖。譜圖1顯示峰2b通過(guò)在線偏振減扣后消失，為脫落熒光染料干擾；譜圖2顯示峰2b通過(guò)在線偏振減扣仍然存在，為排除脫落熒光染料干擾的目標(biāo)DNA-抗體免疫復(fù)合物。待測(cè)DNA濃度僅為0.01 ng/mL時(shí)通過(guò)在線偏振減扣技術(shù)，仍然能夠精確分析DNA-抗體免疫復(fù)合物，免疫毛細(xì)管電泳分析水平明顯提高。
權(quán)利要求
1、一種熒光偏振增強(qiáng)型免疫毛細(xì)管電泳分析技術(shù)。
2、 基于權(quán)利要求1所述的方法，其特征為本發(fā)明將熒光偏振技術(shù)與免疫毛細(xì)管電泳方 法相結(jié)合，使免疫毛細(xì)管電泳分析水平顯著提高。 .
3、 基于權(quán)利要求1所述的方法，其特征為光電倍增管分別檢測(cè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生 的水平偏振光(A)和垂直偏振光(/v )，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換后利用色譜工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在色 譜工作站中，將來(lái)源于垂直偏振光(或水平偏振光)的電泳譜圖設(shè)為背景譜圖，在源于水平 偏振光(或垂直偏振光)的電泳譜圖中進(jìn)行扣除背景操作，得到垂直偏振光(/v)和水平偏振 光(A)信號(hào)減扣后的新電泳譜圖。
4、 基于權(quán)利要求6所述的方法，其特征為由于熒光染料/v-A, /v-A接近于零，偏振 減扣后，在新電泳譜圖中幾乎可以完全消失。熒光染料標(biāo)記于生物大分子上，其偏振值增大， 偏振扣除后標(biāo)記于生物大分子上的熒光染料在新電泳譜圖中仍部分存在。
5、 基于權(quán)利要求1-4所述的方法，其特征為對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行免疫毛細(xì)管電泳-激光誘 導(dǎo)熒光分析，在偏振減扣后的新電泳譜圖中僅有標(biāo)記于生物大分子上的熒光染料信號(hào)，而脫 落熒光染料的信號(hào)干擾則幾乎被完全扣除，無(wú)需進(jìn)一步分離，因此可以對(duì)目標(biāo)復(fù)合物進(jìn)行確 定的定性及定量分析。
6、 基于權(quán)利要求1所述的方法，其特征為本發(fā)明可以用于DNA加合物、DNA甲基化水平以及生物大分子相互作用等諸多生物樣品的免疫毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光精確定性及 定量分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光偏振增強(qiáng)型免疫毛細(xì)管電泳分析技術(shù)及其在生物樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。小分子量的熒光染料旋轉(zhuǎn)速度快，受偏振光激發(fā)時(shí)幾乎可以消偏振；當(dāng)熒光染料結(jié)合到DNA或蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)后旋轉(zhuǎn)速度變慢，熒光偏振顯著增大。本發(fā)明基于這一特性，利用垂直偏振光和水平偏振光減扣(I_v-I_h)技術(shù)排除免疫毛細(xì)管電泳檢測(cè)中脫落熒光染料對(duì)目標(biāo)復(fù)合物的干擾，無(wú)需進(jìn)一步分離。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)勢(shì)，可以用于DNA加合物、DNA甲基化水平以及生物大分子相互作用等諸多方面的免疫毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光精確定性及定量分析。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101644708SQ20091009231
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者汪海林, 王曉利 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心