專利名稱：用于快速檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器及其組裝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，涉及一種用于快速檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器及
其組裝方法。
背景技術(shù)：
雜色曲霉素(Sterigmatocystin， ST)是一種致癌致畸的真菌毒素，是黃曲霉毒素 (Aflatoxin， AFT)的合成前體，二者結(jié)構(gòu)相似，都是由雙呋喃環(huán)與氧雜蒽醌連接組成。ST 是國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分的2B類致癌物質(zhì)，與肺癌、肝癌、胃癌密切相關(guān)，是糧食、飼草、玉 米、小麥、花生等谷物中的主要真菌污染源。在我國(guó)，惡性腫瘤高發(fā)區(qū)大部分是由于糧食 和谷物中ST的污染，然而，人們對(duì)ST的急慢性毒性認(rèn)識(shí)卻比較少，因此測(cè)定ST的含量具 有重要的意義。目前，測(cè)定ST的方法主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、 液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)和偶聯(lián)質(zhì)譜法(Tandem MS)等(Turner麗， Subrahmanyam S， Piletsky SA. Analytical methods fordetermination of mycotoxins: A review. Anal Chim Acta 2009;632:168-180.)。這些方法各有其特點(diǎn)，但有的需要使用 昂貴的儀器，有的操作繁瑣，有的樣品前處理麻煩；此外，由于ST發(fā)熒光的強(qiáng)度遠(yuǎn)不如黃曲 霉毒素，而使用衍生化的方法則容易引入較大的誤差，靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)通常需要使用質(zhì)譜 檢測(cè)器，從而難于實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中ST含量的快速檢測(cè)。 酶生物傳感器是一種較好的替代方法，具有檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，已報(bào) 道的酶生物傳感器法，如在發(fā)明人的中國(guó)專利ZL 200410028018.9中，提供了利用黃曲霉 毒素解毒酶修飾電極制備生物傳感器檢測(cè)雜色曲霉素，其檢測(cè)線為10ng/mL，響應(yīng)時(shí)間為 2min。但該類生物傳感器仍有待改進(jìn)，提高其靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可用于實(shí)際樣品中雜色曲霉素 含量快速檢測(cè)的生物傳感器。該生物傳感器靈敏度更高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性更好，響應(yīng)時(shí)間更 快，并且可快速用于實(shí)際樣品中ST檢測(cè)的生物傳感器及其組裝方法。 本發(fā)明所述的一種用于快速檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器，包括基底電極以及組 裝在基底電極上的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包括聚合物膜，由電聚合在基底電極上的聚鄰苯 二胺構(gòu)成；該聚合物膜修飾在所述基底電極上；電子傳遞體，為有機(jī)分子或高分子電子傳 遞體；殼聚糖凝膠，由殼聚糖溶液制成；以及6_甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶；其中，由活化 后的單壁碳納米管均勻分散在殼聚糖溶液中形成電子傳遞體_殼聚糖凝膠混合膜；所述 6_甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶包埋固定在電子傳遞體_殼聚糖凝膠混合膜上，再組裝在聚 合物膜修飾的基底電極上，形成用于檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器。 本發(fā)明優(yōu)選的聚合物膜是聚鄰苯二胺，鄰苯二胺可以通過電聚合，有機(jī)合成等方 法在很多導(dǎo)電基體上制得聚合薄膜，它即適合于在有機(jī)電解質(zhì)中使用，也可以用于水性電 解質(zhì)溶液，具有較高的庫(kù)倫效率和穩(wěn)定性。
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本發(fā)明所述的電子傳遞體可選用有機(jī)分子或高分子電子傳遞體。有機(jī)分子電子傳 遞體主要有二茂鐵及其衍生物、有機(jī)染料、醌及其衍生物、離子液體等；高分子電子傳遞體 主要有碳納米管、金屬納米顆粒、變價(jià)過渡金屬離子型和有機(jī)氧化還原型等氧化還原聚合 物等。本發(fā)明優(yōu)選的電子傳遞體是活化后的單壁碳納米管，可以采用強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑進(jìn)行 活化處理。本發(fā)明中將單壁碳納米管分散在殼聚糖溶液中，也可以選用溶膠凝膠(sol-gel) 及其復(fù)合物、明礬以及一些其他具有成膜能力的化合物代替殼聚糖。 本發(fā)明所述的一種用于快速檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器的組裝方法，包括以下 步驟 A、將鄰苯二胺單體通過電化學(xué)的方法聚合在基底電極表面，得到聚鄰苯二胺聚合 物膜修飾的基底電極； B、將殼聚糖溶液制成殼聚糖凝膠； C、將單壁碳納米管活化處理后，加入到上述的殼聚糖溶液中混勻，即得單壁碳納 米管-殼聚糖混合液，備用； D、制備6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶溶液，備用； E、將6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶溶液與單壁碳納米管_殼聚糖混合液混勻，滴
加在聚鄰苯二胺聚合物膜修飾的基底電極表面，4t:組裝過夜，即得所述的生物傳感器。 優(yōu)選的制備方法包括以下步驟
a、聚鄰苯二胺修飾基底電極的制備 清洗干凈的基底電極在使用前先在112504中進(jìn)行電化學(xué)預(yù)處理，用循環(huán)伏安法進(jìn) 行掃描直到電極信號(hào)穩(wěn)定為止；處理好的基底電極插入到氮?dú)怙柡偷暮?. 01-0. 05mol/L 鄰苯二胺的O. 1-0. 5mol/L !12504電聚合液中，以0. 05-0. 1V/s的掃速循環(huán)伏安電聚合30-60 圈，即可在基底電極表面形成一層聚鄰苯二胺膜；
b、殼聚糖溶液的制備 用乙酸溶解殼聚糖粉末，使其濃度在O. 1% _1.5%之間，充分溶解后濾去不溶雜 質(zhì)，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液的pH值為5.5，置于4t:保存?zhèn)溆茫?
c、單壁碳納米管_殼聚糖混合液的制備 用強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑活化單壁碳納米管，洗至中性烘干后溶于步驟b所制得的殼聚 糖溶液，超聲分散，制得分散均勻的0. lmg/mL-2. 5mg/mL的單壁碳納米管_殼聚糖溶液；
d、6_甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶的制備 將克隆有甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體， 超聲破碎細(xì)胞后用親和層析柱進(jìn)行純化，酶切融合蛋白得到單一的6-甲氧基雙呋喃香豆
素氧化酶；層析純化酶切產(chǎn)物，收集色譜過程中的酶活性峰組分，濃縮后得e-甲氧基雙呋
喃香豆素氧化酶；配制成蛋白濃度為2mg/mL的酶液，備用； e、6_甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶修飾的生物傳感器的制備 取步驟c中所制備的單壁碳納米管_殼聚糖混合液滴加在步驟a中聚鄰苯二胺修 飾的基底電極上，室溫下晾干成膜；然后再滴加步驟d中所制備的酶液，4t:組裝過夜，即得 6_甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶修飾的生物傳感器。 本發(fā)明所述的生物傳感器主要是利用6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶作為分子識(shí) 別原件來檢測(cè)雜色曲霉素(ST)，其原理是ST在6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶的催化作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，隨著電子的轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生可被檢測(cè)的電信號(hào)。本發(fā)明所述的生物傳感 器，對(duì)于雜色曲霉素的檢測(cè)是高特異性，高選擇性和高靈敏性的，完全能滿足實(shí)際樣品中雜 色曲霉素含量的檢測(cè)。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的生物傳感器具有如下有益效果
(1)利用本發(fā)明所述的生物傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品的快速檢測(cè)，只需對(duì)實(shí)際樣 品進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)處理，就可以實(shí)時(shí)在線監(jiān)控，其響應(yīng)時(shí)間快，小于10s，對(duì)ST響應(yīng)更靈敏；
(2)本發(fā)明所述的生物傳感器靈敏度更高，在0. lmol/L pH7. 0的PBS檢測(cè)體系中 對(duì)ST檢測(cè)的下限為3ng/mL，線性范圍寬，為10ng/mL-310ng/mL ; (3)本發(fā)明所述的生物傳感器具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；抗干擾能力強(qiáng)，能夠 快速實(shí)現(xiàn)單個(gè)或批量樣品的檢測(cè)；檢測(cè)實(shí)際樣品的回收率為87. 6-105. 5%，檢測(cè)速度快， 穩(wěn)定好，使用壽命長(zhǎng)； (4)本發(fā)明所述的生物傳感器使用起來省時(shí)、省力，檢測(cè)速度快且操作簡(jiǎn)單方便， 無須培訓(xùn)即可推廣使用。


圖1為MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修飾電極在含不同濃度ST的PBS中的循環(huán)伏安 曲線；其中，圖中曲線從a到c的變化對(duì)應(yīng)ST的濃度分別是Ong/mL， 10ng/mL， 20ng/mL。
圖2為計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)傳感器對(duì)ST的響應(yīng)；其中，圖中內(nèi)插圖為響應(yīng)電流與ST濃 度的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一 用于快速檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器 本發(fā)明所述的用于快速檢測(cè)實(shí)際樣品中雜色曲霉素的生物傳感器，包括金電極 (All)為基底電極以及組裝在金電極上的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包括聚合物膜，電子傳遞體， 殼聚糖凝膠和e-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶。首先在金電極上利用電化學(xué)的方法組裝上 一層聚合物膜，然后將電子傳遞體均勻分散在殼聚糖中，再將6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化 酶包埋在電子傳遞體_殼聚糖的混合物中，所形成的電子傳遞體_6-甲氧基雙呋喃香豆素 氧化酶-殼聚糖雜合物組裝在聚合物膜修飾的金電極上，形成了 6-甲氧基雙呋喃香豆素氧 化酶修飾的生物傳感器。 本實(shí)施例中，選擇聚鄰苯二胺作為聚合物膜組裝在金電極上，所采用的電子傳遞 體是活化后的單壁碳納米管。單壁碳納米管均勻分散在殼聚糖中形成單壁碳納米管-殼聚 糖混懸液，通過包埋法在混合膜中固定6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶，組裝成對(duì)雜色曲霉 素靈敏的酶生物傳感器。
實(shí)施例二 用于檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器的制備
( — )、材料的準(zhǔn)備 (1)工作電極選用金電極，內(nèi)直徑為2mm，購(gòu)自上海辰華儀器公司。
(2)鄰苯二胺(0PD):化學(xué)純，購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。 (3)單壁碳納米管(SWCNTs):直徑2nm，長(zhǎng)度5 15 y m，純度95% ，購(gòu)自深圳納米港。
(4)殼聚糖(CS) :85-90%的脫乙酰度，平均分子量為1 X 106g/mol，購(gòu)自浙江澳興 生物科技有限公司。 ( 二 )、聚鄰苯二胺修飾金電極的制備 將金電極在由7體積98 %的H2S04和3體積30 % H202組成的溶液中浸泡30分鐘， 用雙蒸水沖洗干凈，再依次用粒徑為1. 0 P m、0. 3 m和0. 05 m的氧化鋁粉末打磨至鏡面， 清洗干凈后晾干備用。金電極在使用前先在4504中進(jìn)行電化學(xué)預(yù)處理，循環(huán)伏安法進(jìn)行掃 描直到電極信號(hào)穩(wěn)定為止。處理好的金電極插入到氮?dú)怙柡偷暮?. 01-0. 05mol/L鄰苯二 胺的0. 1-0. 5mol/L H2S04電聚合液中，以0. 05-0. 1V/s的掃速循環(huán)伏安電聚合30-60圈， 即可在金電極表面形成一層聚鄰苯二胺膜，記為P0PD/Au。
(三)殼聚糖溶液的制備 將適量的殼聚糖粉末溶于乙酸溶液中，配置成0. 1 % -1. 5 %的殼聚糖溶液，充分 溶解后，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液的PH值為5. 5，置于fC保存?zhèn)溆谩?
(四)單壁碳納米管-殼聚糖混合液的制備 單壁碳納米管在使用前先進(jìn)行純化處理，用強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑使其活化，洗至中性 烘干后溶于步驟三所制得的殼聚糖溶液，超聲分散，制得分散均勻的O. lmg/mL-2. 5mg/mL 的單壁碳納米管_殼聚糖溶液。(五)6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶的制備 將6_甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶(MDC0)基因的0RF(開放閱讀框)克隆到含有融 合標(biāo)簽MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)的pMAL-C2X載體(購(gòu)自美國(guó)NEB)上，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì) 粒pMAL-C2X-MDC0，將其導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta(DE3)中(購(gòu)自天津博美科生物科技有限公 司)，即得重組甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶基因工程大腸桿菌(Rosetta(DE3)-C2X-MDC0)， 用IPTG(異丙基硫代P-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了MBP—MDCO融合蛋白的高效表達(dá)。收 集菌體，超聲破碎細(xì)胞后用填充有amylose介質(zhì)的親和層析柱(amylose購(gòu)自北京NEB)進(jìn) 行純化，收集洗脫峰。用Factor Xa酶切融合蛋白得到單一的MDC0(6-甲氧基雙呋喃香豆 素氧化酶)。酶切產(chǎn)物用PhenylS印harose 6 Fast Flow疏水柱層析進(jìn)一步純化(Phenyl S印harose 6 Fast Flow疏水柱層析為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品，苯基瓊脂糖疏水層析介質(zhì) 6Fast Flow型號(hào))，采用鹽濃度遞減的連續(xù)線性梯度洗脫，洗脫A液為0. 05mol/L PBS， pH 6. 5，洗脫B液為0. 05mol/L PBS， 2mol/L (NH4) 2S04， pH 6. 5，收集色譜過程中的酶活性峰組 分，濃縮后得6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶(MDC0)。配制成蛋白濃度為2mg/mL的酶液，備 用。(六)6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶修飾的生物傳感器的制備 取適量的步驟四中所制備的單壁碳納米管-殼聚糖混合液滴加在步驟二中聚鄰
苯二胺修飾的金電極上，晾干成膜；然后再適量的滴加步驟五中所制備的酶液，4t:組裝過
夜，即得6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶修飾的生物傳感器，記為MDC0/CS-SWCNTs/P0PD/
Au，電極使用前先在0. 1M pH7. 0的PBS中浸泡2min，不用時(shí)置于4"干燥保存。 本實(shí)施例中，選用雜色曲霉素(ST)作為測(cè)試底物。 實(shí)施例三MDC0/CS-SWCNTs/P0PD/Au修飾電極對(duì)雜色曲霉素的電化學(xué)響應(yīng)
將實(shí)施例二所制備的MDC0/CS-SWCNTs/P0PD/Au修飾電極作為工作電極，與通用 的對(duì)電極和任選的參比電極一起組成一個(gè)三電極系統(tǒng)。
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本實(shí)施例中，選用Ag/AgCl電極(飽和KC1)為參比電極，Pt絲電極為對(duì)電極組成 三電極系統(tǒng)，O. lmol/L pH7. 0的PBS為電解支持液。 [OO56]( — )、循環(huán)伏安法檢測(cè)ST 采用CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，利用三電極系統(tǒng)(參比電極 Ag/AgCl電極，對(duì)電極Pt絲電極，工作電極MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修飾電極)，選擇循 環(huán)伏安掃描模式，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下
工作電位-O. 8V-+0. 2V
掃描速率100mV/s
靜息時(shí)間2s 設(shè)置好參數(shù)后，在0. lmol/L pH7. 0的PBS中滴加不同濃度的ST，混勻后采用循環(huán) 伏安法進(jìn)行檢測(cè)。如圖1所示，在沒有ST的電解質(zhì)溶液中，MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au展現(xiàn) 出一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，實(shí)現(xiàn)了MDCO在修飾電極上的直接電化學(xué)反應(yīng)(曲線a)。隨著 ST濃度的增加(如曲線b = 10ng/mL ST， c = 20ng/mL ST) ， MDCO修飾電極的還原峰電流 增大，而氧化峰電流減小，氧化峰與還原峰電位基本保持不變，說明MDCO/CS-SWCNTs/POPD/ Au對(duì)ST具有良好的電催化還原作用。
( 二 )、檢測(cè)ST的電流-時(shí)間曲線 CHI660C電化學(xué)工作站選擇電流_時(shí)間檢測(cè)模式，采用三電極系統(tǒng)(參比電極
Ag/AgCl電極，對(duì)電極Pt絲電極，工作電極MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修飾電極)，設(shè)置電
化學(xué)參數(shù)如下 檢測(cè)電位-0.4V 靜息時(shí)間2s 攪拌速度50r/min 待背景電流穩(wěn)定后，往lOmL 0. lmol/L pH7. 0的PBS中等時(shí)間滴加ST，可以是不同 濃度的ST，也可以是等濃度的ST，本發(fā)明優(yōu)選的是每滴加一次，ST濃度變化為10ng/mL。由 圖2可見，隨著ST濃度梯度變化，響應(yīng)電流持續(xù)增大，該酶生物傳感器響應(yīng)迅速且靈敏，平 均響應(yīng)時(shí)間小于10s。酶電極的響應(yīng)電流與ST濃度在10-310ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(圖 2插圖)，線性回歸方程為<formula>formula see original document page 8</formula>檢出限為3ng/ mL。
實(shí)施例四酶電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 將一支MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修飾電極置于含20ng/mL ST的pH7. OPBS溶液 中，連續(xù)循環(huán)伏安掃描100圈，峰形幾乎保持不變，說明本發(fā)明的酶生物傳感器具有很好的 穩(wěn)定性。用該生物傳感器對(duì)20ng/mL ST重復(fù)測(cè)定11次，其電流響應(yīng)的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)為3.9%，表明該電極具有很好的檢測(cè)重復(fù)性。另外，同時(shí)制備7根酶修飾電極，相同 條件下對(duì)20ng/mL ST的響應(yīng)電流的RSD為4. 4% 。表明該修飾電極具有很好的制作重現(xiàn) 性。電極不用時(shí)置于4t:的pH 7.0 PBS溶液上方保存，期間間歇性使用，4天后響應(yīng)信號(hào)為 初始值的95. 5%，30天后仍能保持91%，本發(fā)明所述的生物傳感器能夠長(zhǎng)時(shí)間使用。
實(shí)施例五MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修飾電極的抗干擾能力
采用計(jì)時(shí)電流法對(duì)MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修飾電極的抗干擾能力進(jìn)行研究， 測(cè)試條件參數(shù)設(shè)置如實(shí)施例3 ( 二 )所示，在10mL含50ng/mL ST的0. lmol/L pH7. 0的PBS中，分別滴加下列不同濃度的可能干擾物，分析其抗干擾能力。
分別滴加的干擾物的種類 1000倍于ST濃度的P0/—、N03—、檸檬酸根、果糖、葡萄糖；
500倍于ST濃度的EDTA、 Ntf+、草酸、a -乳糖、抗壞血酸；
100倍于ST濃度的甘氨酸、L-絲氨酸、尿酸、甲醇、油酸；
10倍于ST濃度的Fe"、對(duì)硝基苯酚、乙酸。 測(cè)試效果當(dāng)控制相對(duì)誤差不超過檢測(cè)50ng/mL ST的電流響應(yīng)值的±5%的情況 下，1000倍的P0/—、N03—、檸檬酸根、果糖、葡萄糖；500倍的EDTA、Ntf+、草酸、a-乳糖、抗壞 血酸；100倍的甘氨酸、L-絲氨酸、尿酸、甲醇、油酸；10倍的Fe"、對(duì)硝基苯酚、乙酸等對(duì)測(cè) 定不產(chǎn)生干擾。 實(shí)施例六實(shí)際樣品測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn) 將本發(fā)明所述的酶生物傳感器用于實(shí)際樣品測(cè)定以及檢測(cè)其回收率，所述的實(shí)際 樣品可以是玉米、花生、大米、小麥等一系列農(nóng)副產(chǎn)品和糧食作物，也可以是飼料、飲料、醬 油、橄欖油、花生油等一系列可能含ST的產(chǎn)品。
本實(shí)施例中選用玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)。 玉米樣品的處理取lg優(yōu)質(zhì)玉米粉，加入不同濃度的ST，于5ml 80%的甲醇溶液
中振蕩萃取45min，離心(5000r/min， 10min)，上清用0. lmol/L pH7. 0的PBS按1 : 5 (V/V)
稀釋后檢測(cè)。其他樣品按照類似的方法，經(jīng)過簡(jiǎn)單的預(yù)處理后即可檢測(cè)。 循環(huán)伏安檢測(cè)測(cè)試條件參數(shù)設(shè)置如實(shí)施例三的( 一 )所示，對(duì)分別含10ng/nL，
50ng/nL， 100ng/nL， 150ng/nL ST的玉米樣品進(jìn)行循環(huán)伏安檢測(cè)，每個(gè)濃度的玉米樣品均測(cè)
量5次。測(cè)試結(jié)果如表一所示。 表一 玉米樣品中ST含量的測(cè)定結(jié)果
樣品號(hào)滴加量(ng/ml)檢測(cè)量(ng/ml)RSD(%)回收率(％)
1108.92,889
25043.83.287.6
3100105.54.1105.5
4150151.63.6101.1 如上表所示，所測(cè)得樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2. 8% 4. 1%之間，加標(biāo)回收率在 87. 6% 105. 5%之間，平均回收率為95. 8%。
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權(quán)利要求
一種用于快速檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器，包括基底電極以及組裝在基底電極上的反應(yīng)層，其特征在于，所述的反應(yīng)層包括聚合物膜，由電聚合在基底電極上的聚鄰苯二胺構(gòu)成；該聚合物膜修飾在所述基底電極上；電子傳遞體，為有機(jī)分子或高分子電子傳遞體；殼聚糖凝膠，由殼聚糖溶液制成；以及6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶；其中，由活化后的單壁碳納米管均勻分散在殼聚糖溶液中形成電子傳遞體-殼聚糖凝膠混合膜；所述6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶包埋固定在電子傳遞體-殼聚糖凝膠混合膜上，再組裝在聚合物膜修飾的基底電極上，形成用于檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于所述的電子傳遞體是經(jīng)強(qiáng)酸或強(qiáng) 氧化劑活化處理的單壁碳納米管。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器的組裝方法，其特征在于，包括以下步驟A、 將鄰苯二胺單體通過電化學(xué)的方法聚合在基底電極表面，得到聚鄰苯二胺聚合物膜 修飾的基底電極；B、 將殼聚糖溶液制成殼聚糖凝膠；C、 將單壁碳納米管活化處理后，加入到上述的殼聚糖溶液中混勻，即得單壁碳納米 管-殼聚糖混合液，備用；D、 制備6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶溶液，備用；E、 將6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶溶液與單壁碳納米管_殼聚糖混合液混勻，滴加在聚鄰苯二胺聚合物膜修飾的基底電極表面，4t:組裝過夜，即得所述的生物傳感器。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物傳感器的組裝方法，其特征在于，包括以下步驟a、 聚鄰苯二胺修飾基底電極的制備清洗干凈的基底電極在使用前先在H2S04中進(jìn)行電化學(xué)預(yù)處理，用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃 描直到電極信號(hào)穩(wěn)定為止；處理好的基底電極插入到氮?dú)怙柡偷暮?. 01-0. 05mol/L鄰苯 二胺的0. 1-0. 5mol/L H2S04電聚合液中，以0. 05-0. 1V/s的掃速循環(huán)伏安電聚合30-60圈， 即可在基底電極表面形成一層聚鄰苯二胺膜；b、 殼聚糖溶液的制備用乙酸溶解殼聚糖粉末，使其濃度在0. 1% _1.5%之間，充分溶解后濾去不溶雜質(zhì)，調(diào) 節(jié)殼聚糖溶液的pH值為5. 5，置于fC保存?zhèn)溆?；c、 單壁碳納米管-殼聚糖混合液的制備用強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑活化單壁碳納米管，洗至中性烘干后溶于步驟b所制得的殼聚糖溶 液，超聲分散，制得分散均勻的0. lmg/mL-2. 5mg/mL的單壁碳納米管_殼聚糖溶液；d、 6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶的制備將克隆有甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，超聲 破碎細(xì)胞后用親和層析柱進(jìn)行純化，酶切融合蛋白得到單一的6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶；層析純化酶切產(chǎn)物，收集色譜過程中的酶活性峰組分，濃縮后得e-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶；配制成蛋白濃度為2mg/mL的酶液，備用；e、 6_甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶修飾的生物傳感器的制備取步驟c中所制備的單壁碳納米管-殼聚糖混合液滴加在步驟a中聚鄰苯二胺修飾的 基底電極上，室溫下晾干成膜；然后再滴加步驟d中所制備的酶液，4t:組裝過夜，即得6-甲 氧基雙呋喃香豆素氧化酶修飾的生物傳感器。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于快速檢測(cè)樣品中雜色曲霉素的生物傳感器及其組裝方法，所述的生物傳感器包括基底電極以及組裝在基底電極上的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包括聚合物膜，電子傳遞體，殼聚糖凝膠和6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶。6-甲氧基雙呋喃香豆素氧化酶固定在電子傳遞體-殼聚糖混合膜中，再組裝在聚合物膜修飾的基底電極上，即得用于檢測(cè)雜色曲霉素的生物傳感器。本發(fā)明的生物傳感器靈敏度高，響應(yīng)時(shí)間快，抗干擾能力強(qiáng)，對(duì)雜色曲霉素的檢測(cè)下限達(dá)到3ng/mL，能用于實(shí)際樣品檢測(cè)，其平均回收率為95.8％。該生物傳感器制作簡(jiǎn)單，使用方便，穩(wěn)定性好，使用壽命長(zhǎng)，為實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中雜色曲霉素含量的快速檢測(cè)提供了一種新的檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)G01N27/327GK101726521SQ200910194260
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者劉大嶺, 陳俊華 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)