專利名稱：用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，涉及一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極，以及該生物傳感器電極的制備方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(AFT)、雜色曲霉素(ST)是目前已知的強致癌物之一，它們常污染動物飼料和人類的食品。用污染的飼料喂養(yǎng)禽畜會導(dǎo)致肉、乳及其制品的污染。人們?nèi)绻秤帽晃廴镜氖称?，會?dǎo)致急性中毒，引起肝臟壞死出血，慢性中毒可引起肝癌、肺癌。同時，用被污染的飼料飼養(yǎng)禽畜會使禽畜生產(chǎn)率降低，增重減慢，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。各國對食品及飼料中的黃曲霉毒素均有嚴(yán)格的限量規(guī)定。雜色曲霉素是結(jié)構(gòu)與黃曲霉毒素十分相似的霉菌毒素，其毒性、致癌性與黃曲霉毒素相似，因此對于食品及飼料中的雜色曲霉素各國也有嚴(yán)格的規(guī)定。
目前，對食品及飼料中黃曲霉毒素的檢測方法大致有TLC(薄層色譜法)、HPLC(高效液相色譜)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)等幾種(黃曲霉毒素B1檢測方法的分析，食品與發(fā)酵工業(yè)2003年10期)。TLC法較為簡單，不需要價格高昂的儀器設(shè)備，但樣品的前處理繁瑣，提取效果不理想，操作費時。HPLC法需要高昂的設(shè)備費用，專業(yè)的操作人員。ELISA法也需要專業(yè)的技術(shù)人員，需要專門的設(shè)備，還需要購買昂貴的試劑盒，僅適合于批量的檢驗，操作費時，需約4小時。而對于食品及飼料中黃曲霉毒素、雜色曲霉素的檢測方法，則未見詳細(xì)報道。
多壁碳納米管自從1991年問世以來，由于其獨特的物化特性以及所具有的納米顆粒的大比表面積賦予了其在酶生物傳感器研制方面無可比擬的優(yōu)點。其納米顆粒的大比表面積可以大大提高固化酶的數(shù)量，增加酶與底物反應(yīng)的面積，從而大大提高酶生物傳感器的響應(yīng)性，并且其具有獨特的金屬或?qū)w的性質(zhì)，能在電極表面迅速傳遞電子，從而促進(jìn)電極表面的電流響應(yīng)，提高傳感器的靈敏度。另外一個引人注目的優(yōu)點是碳納米管在酸氧化環(huán)境下經(jīng)活化后，能在碳納米管表面引入活性的功能基團(tuán)-COOH，-OH，-CHO等基團(tuán)，利用其這一特性可通過蛋白交聯(lián)劑EDC、NHS將帶有-NH2，-COOH的蛋白酶通過縮和反應(yīng)共價結(jié)合在碳納米管載體上，以固相酶的形式保持酶活力，從某種程度上大大節(jié)約酶用量和損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極。
本發(fā)明所述的用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極，包括基底層與在基底層上形成的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包含電子介體和黃曲霉毒素解毒酶，電子介體固定在基底層上成膜，該膜作為酶載體聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶，形成黃曲霉毒素解毒酶修飾電極。
所述的電子介體可選用有機(jī)分子電子介體和高分子電子介體。有機(jī)分子電子介體主要有二茂鐵及其衍生物、有機(jī)染料、醌及其衍生物、四硫富瓦烯；高分子介體主要包括變價過渡金屬離子型和有機(jī)氧化還原型等氧化還原聚合物。高分子介體化合物通常是由低分子介體化合物與高分子鏈所帶的活性基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)固載生成的。
本發(fā)明優(yōu)選的電子介體由在酸氧化環(huán)境下活化的多壁碳納米管構(gòu)成，其通過蛋白交聯(lián)劑聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶?；罨蟮亩啾谔技{米管起了一個增敏的作用，即增強電極的靈敏性，同時，活化后的多壁碳納米管具有較大量的羧基，這十分有利于對蛋白質(zhì)的固定。
所述的多壁碳納米管優(yōu)選是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管，也可以是其他強酸或強氧化劑活化處理所得的羧基化多壁碳納米管。
所述的蛋白交聯(lián)劑為EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺)、NHS(N-羥基丁二酰亞胺酯)，也可以為其它的聯(lián)結(jié)蛋白質(zhì)的方式。
當(dāng)選用其他不同的電子介體時，可選用適合該電子介體的不同的聯(lián)結(jié)方法。例如，選用二茂鐵衍生物作為電子介體時，先利用雙異硫氰酸酯與酶分子進(jìn)行交替共聚制成酶膜，然后再將帶有羧基的二茂鐵衍生物通過與酶分子上的氨基反應(yīng)鍵合到酶分子上去。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法。
本發(fā)明所述的一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法，包括以下步驟A、將多壁碳納米管進(jìn)行羧基化的活化處理，加表面活性劑促溶并配成羧基化多壁碳納米管溶液；B、制備黃曲霉毒素解毒酶；C、以羧基化多壁碳納米管溶液對基底層進(jìn)行修飾成膜，在黃曲霉毒素解毒酶的酶液中加入適量的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末，底物的加入量足以保護(hù)黃曲霉毒素解毒酶的活性中心，混勻，滴加于電極表面，羧基化多壁碳納米管聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶，得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
所述的步驟C中，滴加于電極表面的黃曲霉毒素解毒酶酶液中還加入適量的穩(wěn)定劑，如PEG、甘油、吐溫等。穩(wěn)定劑的加入量與酶液的體積比為1∶10。
優(yōu)選的制備方法包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流8～12小時，離心，棄上清，干燥后為羧基化多壁碳納米管；稱取羧基化多壁碳納米管溶于二甲基甲酰胺中，超聲波攪拌均勻后，配成0.01～1.0mg/ml的羧基化多壁碳納米管溶液；B、黃曲霉毒素解毒酶的制備采用Armillariella sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法獲得黃曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液，備用；C、多壁碳納米管修飾酶電極的制備以金電極為基底層，打磨至光亮，并依次在丙酮，強堿溶液，強酸溶液以及蒸餾水中超聲波清洗，將步驟A所得的羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面，烘干成膜；再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/L的NHS溶液中30分鐘；取步驟B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末，混勻，滴加于電極表面，15～25℃放置30分鐘后，在用于配制EDC溶液和NHS溶液的PBS溶液中清洗數(shù)次；將電極置于黃曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下12～24小時，用PBS緩沖液沖洗電極數(shù)次，洗去電極表面未固定上的酶，即得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
所述的步驟C中，每100μl酶液中還加入10μl的穩(wěn)定劑PEG-200，混勻，然后滴加于電極表面。
更為優(yōu)選的制備方法包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流8～10小時，10000g離心15分鐘，棄上清，用雙蒸水清洗沉淀，10000g離心15分鐘，洗滌沉淀，重復(fù)此步驟兩次；將沉淀置于烘箱中烘干，為羧基化多壁碳納米管；稱取上述1mg羧基化多壁碳納米管溶于10ml的二甲基甲酰胺中，超聲波攪拌均勻后，配成0.1mg/ml的溶液；B、黃曲霉毒素解毒酶的制備采用Armillariellla sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法獲得黃曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液，備用；C、多壁碳納米管修飾酶電極的制備將金電極以牙膏、硅藻土在絨布上打磨至光亮，并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1濃硝酸以及雙蒸水中超聲波清洗，每次3～5分鐘，將10μl羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面，置于60℃烘箱中烘干成膜。然后，再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液中30分鐘，EDC溶液和NHS溶液均以0.01M，pH7.4PBS配制；取步驟B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末，在振蕩器上混勻后，取20μl滴加于電極表面，15～25℃放置30分鐘后，在0.01M，pH7.4PBS溶液中清洗數(shù)次；為減低黃曲霉毒素解毒酶的酶分子活性中心在交聯(lián)過程中載體上失活，采用底物保護(hù)酶活性中心的方法，先用底物即雜色曲霉素和/或黃曲霉毒素封閉黃曲霉毒素解毒酶的酶活性中心和維持構(gòu)象的必需基團(tuán)，然后用交聯(lián)劑EDC、NHS將黃曲霉毒素解毒酶固定在羧基化多壁碳納米管載體上，最后去掉保護(hù)劑即雜色曲霉素和/或黃曲霉毒素；將電極置于黃曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下過夜，用PBS緩沖液沖洗電極數(shù)次，洗去電極表面未固定上的酶，即得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
所述的步驟C中，每100μl酶液中還加入10μl的穩(wěn)定劑PEG-200，混勻，然后滴加于電極表面。
基于碳納米管的在酶生物傳感器上的潛在應(yīng)用，本發(fā)明以硝化氧化方式活化處理多壁碳納米管，以MWNT-COOH作為酶載體構(gòu)建了ADTZ固相酶生物傳感器電極。
用原子力顯微鏡(AFM)觀察固化酶修飾電極的膜表面，發(fā)現(xiàn)有很多酶分子附在羧基化開管處理的MWNT納米顆粒上。AFM結(jié)果顯示共價交聯(lián)固化酶方式形成的膜面上ADTZ酶生物大分子均一的分布在MWNT上。這主要是由于MWNT具有納米顆粒的均一自組裝性，MWNT先在電極基質(zhì)上均勻分散，自組裝成均一的酶固化基底層；并且因為硝化處理的MWNT表面帶有-COOH基團(tuán)，提供有酶共價結(jié)合位點，在EDC，NHS交聯(lián)劑的作用下，ADTZ酶生物大分子被定向引入到MWNT的-COOH位點上，從而防止了直接吸附固化ADTZ的無向性引起的ADTZ酶分散的無序性或聚集成團(tuán)性，這樣通過MWNT的納米自組裝均一性賦予了上面一層酶膜的ADTZ分布的有序性和均一性。
本發(fā)明用蛋白交聯(lián)劑EDC、NHS將ADTZ酶分子通過直接共價結(jié)合的方式連接在MWNT納米顆粒上。為減低ADTZ酶分子活性中心在交聯(lián)過程中載體上失活，采用底物保護(hù)酶活性中心的方法，先用底物ST封閉ADTZ酶活性中心和維持構(gòu)象的必需基團(tuán)，然后用交聯(lián)劑EDC、NHS將ADTZ固定在MWNT載體上，最后去掉保護(hù)劑ST，得到具有離剛性載體MWNT，又有較高活性的ADTZ固定化酶，制備得到交聯(lián)固化ADTZ酶修飾電極，如圖1所示。
本發(fā)明所述的生物傳感器電極，主要是利用所含的黃曲霉毒素解毒酶(aflatoxin-detoxifizyme，ADTZ)來檢測黃曲霉毒素(AFT)及雜色曲霉素(ST)，其原理如下
Aflatoxin B1Aflatoxin B1-8，9-dihydrodiol黃曲霉毒素B1(反應(yīng)產(chǎn)物)黃曲霉毒素-8，9-二羥二醇 Sterigmatocystin Sterigmatocystin-8，9-dihydrodiol雜色曲霉素 (反應(yīng)產(chǎn)物)雜色曲霉素-8，9-二羥二醇由于ST與AFTB1在結(jié)構(gòu)上相似，在ADTZ催化下發(fā)生相似的氧化反應(yīng)，均可在上述反應(yīng)過程中產(chǎn)生可以被檢測的電信號。因此，本發(fā)明所述的生物傳感器電極，對于黃曲霉毒素(AFT)及雜色曲霉素(ST)的檢測是高特異性的，而且其檢測的靈敏度非常高。
本發(fā)明利用發(fā)明人報道的ADTZ酶首次制備出生物傳感器電極，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有響應(yīng)快、信號靈敏、特異性高、使用方便、可定量檢測等優(yōu)點。利用本發(fā)明所述的生物傳感器電極，僅需要對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)處理，可用于在線檢測，響應(yīng)時間較快，僅2分鐘，靈敏度高(可檢出雜色曲霉素10個ppb、黃曲霉毒素5個ppb的樣品)，比HPLC法高約10倍，單個樣品或批量檢測均可以方便地使用。本發(fā)明所述的生物傳感器電極的靈敏度可達(dá)到1ppm～10ppb的水平。本發(fā)明省時、省力，操作簡單，幾乎無須培訓(xùn)即可推廣應(yīng)用。


圖1為ADTZ通過交聯(lián)劑EDC、NHS交聯(lián)固化在MWNT上示意圖。
圖2為不同濃度ST的循環(huán)伏安圖，圖中，1為空白PBS；2～5為不同濃度的ST溶液，Scan rate100mv/s；圖3為不同濃度ST的微分脈沖圖；
圖4為不同濃度ST與峰電流的關(guān)系圖。
具體實施例方式
實施例一黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修飾的生物傳感器電極本發(fā)明所述的用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極，包括基底層與在基底層上形成的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包含電子介體和黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)，電子介體固定在基底層上，并作為酶載體聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)。
本實施例中，所采用的電子介體是由在酸氧化環(huán)境下活化的多壁碳納米管構(gòu)成，具體是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管，其通過蛋白交聯(lián)劑EDC、NHS聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶。
實施例二黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修飾的生物傳感器電極的制備(一)、材料的準(zhǔn)備(1)基底層選用金電極，購自天津蘭力科技公司。
(2)多壁碳納米管(MWNT)購自深圳納米港。
(3)蛋白交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺酯(NHS)購自Sigma公司。
(二)、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管(MWNT)用王水1∶3(濃硝酸∶濃硫酸)回流8～10小時，10000g離心15分鐘，棄上清，用雙蒸水清洗沉淀，10000g離心15分鐘，洗滌沉淀，重復(fù)此步驟兩次。將沉淀置于烘箱中烘干，為羧基化多壁碳納米管。
稱取上述1mg羧基化的MWNT溶于10ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，超聲波攪拌均勻后，配成0.1mg/ml的溶液。
(三)、黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)的制備采用Armillariella sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶，參照發(fā)明人所報道的方法(Da Ling Liu，Dong Sheng Yao，et al.，Production，purification，andcharacterization of an intracellar aflatoxin-detoxifizyme from Armillariellatabescens(E-20)，F(xiàn)ood and chemical toxicology，39(2001)461-466)，或由該方法的部分步驟獲得?；蛘卟捎没蚩寺?、基因工程等方法獲得該酶。
配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液，備用。
(四)、多壁碳納米管修飾酶電極的制備將金電極以牙膏、硅藻土在絨布上打磨至光亮，并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1濃硝酸以及雙蒸水中超聲波清洗，每次3～5分鐘，將10μlMWNT溶液滴加在電極表面，置于60℃烘箱中烘干成膜。然后，再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液(均以0.01M，pH7.4 PBS配制)中30分鐘；100μl ADTZ酶液中加入0.01～0.5μg ST粉末，10μl的穩(wěn)定劑PEG-200，混勻振蕩器上混勻后，取20μl滴加于電極表面，15～25℃放置30分鐘后，在0.01M，pH7.4 PBS溶液中清洗數(shù)次。為減低ADTZ酶分子活性中心在交聯(lián)過程中載體上失活，采用底物保護(hù)酶活性中心的方法，先用底物ST封閉ADTZ酶活性中心和維持構(gòu)象的必需基團(tuán)，然后用交聯(lián)劑EDC、NHS將ADTZ固定在MWNT載體上，最后去掉保護(hù)劑ST。
將電極置于ADTZ酶液中0～4℃下過夜，用PBS緩沖液沖洗電極數(shù)次，洗去電極表面未固定上的酶。
本實施例中，選用雜色曲霉素(ST)作為底物，還可選用黃曲霉毒素(AFT)作為底物，原理和操作方法相同。
本實施例為優(yōu)選方案，在滴加于電極表面的ADTZ酶液中加入了穩(wěn)定劑PEG-200，此步驟中即使不加入穩(wěn)定劑也可制備出有相同功能的生物傳感器電極。
所加入的穩(wěn)定劑，除了本實施例所采用的PEG外，還可選用甘油、吐溫等。
實施例三黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修飾的的生物傳感器電極用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉毒素的實驗分析將本發(fā)明所述的黃曲霉毒素解毒酶修飾的Au電極作為基底層，與通用的對電極和任選的參比電極一起組成一個電極系統(tǒng)。
本實施例中，選用Ag/AgCl電極為參比電極，Pt絲電極為對電極組成三電極系統(tǒng)，磷酸鹽緩沖液為電解液。
以雜色曲霉素(ST)的檢測方法為例進(jìn)行詳細(xì)說明(一)樣品的處理固態(tài)樣品100g樣品以粉碎機(jī)粉碎，用甲醇∶水＝45∶55(v/v)充分溶解震蕩，以1∶1的氯仿提取3次，通過含有無水硫酸鈉的漏斗，65℃下吹氮氣揮干。
液態(tài)樣品100ml樣品以0.5∶1的氯仿提取3次，通過含有無水硫酸鈉的漏斗，65℃下吹氮氣揮干。
(二)MWNT修飾ADTZ酶電極對雜色曲霉素的電化學(xué)響應(yīng)在電位范圍-1000mV～1000mV，10ml的0.1mol/L，NaH2PO4-Na2HPO4(PBS)，pH6.0含0.1g/L KCL支持電解質(zhì)的緩沖液中，用BAS-100 Electrochemical analyzer進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)研究和示差脈沖伏安(DPV)研究，掃描速率100mV/s。分別檢測MWNT固化ADTZ修飾電極對雜色曲霉素的響應(yīng)情況。
一、循環(huán)伏安法檢測采用BAS-100電化學(xué)分析儀三電極系統(tǒng)(參比電極Ag/AgCl電極，對電極Pt絲電極，基底層修飾Au電極)，選擇循環(huán)伏安掃描模式，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下工作電位范圍-1000mv～+1200mv掃描速率100mv/s；靈敏度10μA/V；靜息時間2s設(shè)置好參數(shù)后，分別用不同的修飾基底層對10ml0.2M，pH6.60PBS(含1g/lKCl)的底液以及相同底液體系中加入不同濃度的ST的乙醇溶液或上述樣品進(jìn)行循環(huán)伏安掃描檢測。
測試效果以100mv/s的掃描速率，在0～1200mv工作電位范圍內(nèi)用循環(huán)伏安法對不同濃度的ST溶液進(jìn)行測定，如圖2所示，峰電流隨ST濃度的增加而增加。
二、微分脈沖伏安法檢測選擇微分脈沖伏安掃描模式，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下脈沖振幅50mv；采集數(shù)據(jù)電位區(qū)間-1000mv～+1200mv；采樣寬度20ms；掃描速度100mv/s；靜息時間2s測試效果以交聯(lián)固化ADTZ酶修飾電極對不同濃度的ST溶液進(jìn)行微分脈沖伏安掃描，所測結(jié)果如圖3所示，表明該電極對ST敏感，不同的濃度下產(chǎn)生不同大小的脈沖信號(信號大小與濃度有正比例關(guān)系)。即雜色曲霉素的含量可以通過脈沖信號表示出來。
如圖4所示，以交聯(lián)固化ADTZ酶修飾電極在+400mv位置用微分脈沖伏安法對ST進(jìn)行定量分析，得到在4.16×10-5～2.66×10-3g/L濃度范圍內(nèi)，峰電流隨著ST濃度的增加而上升，ST的線性檢測范圍為4.16×10-5～1.33×10-3g/L，線性方程為ip＝0.03C+0.497，R2＝0.9023。而當(dāng)ST的濃度1.33×10-3～2.66×10-3g/L時，峰電流已趨于平緩，并且當(dāng)ST的濃度大于2.66×10-3g/L后，峰電流反而隨ST濃度的增加而下降。這可能于ST在水中溶解度低有關(guān)(≤g10-3g/L)。而且通常食品的ST污染亦不到這么高。
圖4表明本發(fā)明所指的電極對ST響應(yīng)靈敏，產(chǎn)生的峰電流大小與ST的含量成正比例關(guān)系，即可以通過峰電流表示樣品中雜色曲霉素的含量。
由于雜色曲霉素(ST)與黃曲霉毒素(AFT)B1在結(jié)構(gòu)上相似，在ADTZ催化下發(fā)生相似的氧化反應(yīng)，均可在上述反應(yīng)過程中產(chǎn)生可以被檢測的電信號。因此，本實施例所述的檢測方法，同樣可用于檢測黃曲霉毒素(AFT)，并達(dá)到相近的靈敏度。
權(quán)利要求
1.用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極，包括基底層與在基底層上形成的反應(yīng)層，其特征在于所述的反應(yīng)層包含電子介體和黃曲霉毒素解毒酶，電子介體固定在基底層上成膜，該膜作為酶載體聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶，形成黃曲霉毒素解毒酶修飾電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器電極，其特征在于所述的電子介體由在酸氧化環(huán)境下活化的多壁碳納米管構(gòu)成，其通過蛋白交聯(lián)劑聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物傳感器電極，其特征在于所述的多壁碳納米管是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物傳感器電極，其特征在于所述的蛋白交聯(lián)劑為EDC、NHS。
5.一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法，其特征在于包括以下步驟A、將多壁碳納米管進(jìn)行羧基化的活化處理，加表面活性劑促溶并配成羧基化多壁碳納米管溶液；B、制備黃曲霉毒素解毒酶；C、以羧基化多壁碳納米管溶液對基底層進(jìn)行修飾成膜；在黃曲霉毒素解毒酶的酶液中加入適量的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末，底物的加入量足以保護(hù)黃曲霉毒素解毒酶的活性中心，混勻，滴加于電極表面，羧基化多壁碳納米管聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶，得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的步驟C中，滴加于電極表面的黃曲霉毒素解毒酶酶液中還加入適量的穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑的加入量與酶液的體積比為1∶10。
7.一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法，其特征在于包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流8～12小時，離心，棄上清，干燥后為羧基化多壁碳納米管；稱取羧基化多壁碳納米管溶于二甲基甲酰胺中，超聲波攪拌均勻后，配成0.01～1.0mg/ml的羧基化多壁碳納米管溶液；B、黃曲霉毒素解毒酶的制備采用Armillariella sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法獲得黃曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液，備用；C、多壁碳納米管修飾酶電極的制備以金電極為基底層，打磨至光亮，并依次在丙酮，強堿溶液，強酸溶液以及蒸餾水中超聲波清洗，將步驟A所得的羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面，烘干成膜；再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/L的NHS溶液中30分鐘；取步驟B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末，混勻，滴加于電極表面，15～25℃放置30分鐘后，在用于配制EDC溶液和NHS溶液的PBS溶液中清洗數(shù)次；將電極置于黃曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下12～24小時，用PBS緩沖液沖洗電極數(shù)次，洗去電極表面未固定上的酶，即得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的步驟C中，每100μl酶液中還加入10μl的穩(wěn)定劑PEG-200，混勻，然后滴加于電極表面。
9.一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法，其特征在于包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流8～10小時，10000g離心15分鐘，棄上清，用雙蒸水清洗沉淀，10000g離心15分鐘，洗滌沉淀，重復(fù)此步驟兩次；將沉淀置于烘箱中烘干，為羧基化多壁碳納米管；稱取上述1mg羧基化多壁碳納米管溶于10ml的二甲基甲酰胺中，超聲波攪拌均勻后，配成0.1mg/ml的溶液；B、黃曲霉毒素解毒酶的制備采用Armillariella sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法獲得黃曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液，備用；C、多壁碳納米管修飾酶電極的制備將金電極以牙膏、硅藻土在絨布上打磨至光亮，并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1濃硝酸以及雙蒸水中超聲波清洗，每次3～5分鐘，將10μl羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面，置于60℃烘箱中烘干成膜；再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液中30分鐘，EDC溶液和NHS溶液均以0.01M，pH7.4PBS配制；取步驟B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末，在振蕩器上混勻后，取20μl滴加于電極表面，15～25℃放置30分鐘后，在0.01M，pH7.4PBS溶液中清洗數(shù)次；為減低黃曲霉毒素解毒酶的酶分子活性中心在交聯(lián)過程中載體上失活，采用底物保護(hù)酶活性中心的方法，先用底物即雜色曲霉素和/或黃曲霉毒素封閉黃曲霉毒素解毒酶的酶活性中心和維持構(gòu)象的必需基團(tuán)，然后用交聯(lián)劑EDC、NHS將黃曲霉毒素解毒酶固定在羧基化多壁碳納米管載體上，最后去掉保護(hù)劑即雜色曲霉素和/或黃曲霉毒素；將電極置于黃曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下過夜，用PBS緩沖液沖洗電極數(shù)次，洗去電極表面未固定上的酶，即得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于所述的步驟C中，每100μl酶液中還加入10μl的穩(wěn)定劑PEG-200，混勻，然后滴加于電極表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極，以及該生物傳感器電極的制備方法。本發(fā)明所述的用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極，包括基底層與在基底層上形成的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包含電子介體和黃曲霉毒素解毒酶，電子介體固定在基底層上成膜，該膜作為酶載體聯(lián)結(jié)黃曲霉毒素解毒酶，形成黃曲霉毒素解毒酶修飾電極。本發(fā)明利用發(fā)明人報道的黃曲霉毒素解毒酶首次制備出生物傳感器電極，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有響應(yīng)快、信號靈敏、特異性高、使用方便、可定量檢測等優(yōu)點。本發(fā)明所述的生物傳感器電極的靈敏度可達(dá)到1ppm～10ppb的水平。本發(fā)明省時、省力，操作簡單，幾乎無須培訓(xùn)即可推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N27/403GK1719243SQ200410028018
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月9日
發(fā)明者姚冬生, 劉大嶺, 文圣梅, 謝春芳, 鄭文杰 申請人:暨南大學(xué)