雜色曲霉毒素的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒制備及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明為雜色曲霉毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用試劑盒。其檢測快速、靈敏、準確、可定量，操作簡便，且對樣品純度要求不高，特異性強，特別適用于大批量樣品的檢測，為此，本發(fā)明還提供了專用試劑盒的制備及檢測方法。其中包括洗滌液，顯色液，終止液。其特征在于：包有雜色曲霉毒素固相抗原的包被板、雜色曲霉毒素（ST）標準品，雜色曲霉毒素單克隆抗體、雜色曲霉毒素酶標抗體。
【專利說明】雜色曲霉毒素的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒制備及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為對雜色曲霉毒素酶聯(lián)免疫吸附檢測專用試劑盒的制備及專業(yè)檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]雜色曲霉素(ST)主要是雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉的最終代謝產(chǎn)物，同時又是黃曲霉和寄生曲霉生成黃血霉毒素過程后期的中間產(chǎn)物。據(jù)報道，感染了雜色曲霉的玉米在27°C的環(huán)境下，21天可產(chǎn)生雜色曲霉毒素12 g/kg以上。雜色曲霉毒素在1954年由雜色曲霉培養(yǎng)物中首先分離出的，但并未引起人們的足夠重視，至發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的強致癌性后，才開始注意。用14-標記方法已證實雜色曲霉毒素能轉(zhuǎn)變成黃曲霉毒素馬，而且有人認為雜色曲霉毒素可能是非洲某些地區(qū)肝癌的病因。
[0003]能產(chǎn)生ST的菌種主要是雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉和離蠕孢霉。此外，謝瓦曲霉、赤曲霉、焦曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黃褐曲霉、四脊曲霉、變色曲霉、爪曲霉、毛殼霉及黃曲霉和寄生曲霉等也可產(chǎn)生ST。上述這些霉菌廣泛存在于自然界，可污染大麥、小麥、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等糧食、食品和飼草，尤其對小麥、玉米、花生等飼料和飼草污染更為嚴重。產(chǎn)毒量最高的是雜色曲霉，其次是構(gòu)巢曲霉和離蠕孢霉，前者產(chǎn)生ST的量約為后者的2倍。
[0004]本發(fā)明為雜色曲霉毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用試劑盒。其檢測快速、靈敏、準確、可定量，操作簡便，且對樣品純度要求不高，特異性強，特別適用于大批量樣品的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了專用試劑盒的制備及檢測方法。其中包括洗滌液，顯色液，終止液。其特征在于:包有雜色曲霉毒素固相抗原的包被板、雜色曲霉毒素(ST)標準品，雜色曲霉毒素單克隆抗體、雜色曲霉毒素酶標抗體。
[0006]檢測時，取包被板，加入標準品/樣本50 μ L到對應(yīng)的微孔中，再加入酶標記物50 μ L/孔，然后再加入50 μ L/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30 min。小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液250 μ L/孔，每次浸泡15~30s，充分洗滌4飛次，用吸水紙拍干。加入顯色液100 yL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境反應(yīng)15 min。每孔各加50 μ L終止液，設(shè)定酶標儀在450 nm處，測定OD值(建議用450/630 nm雙波長檢測，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))。從標準曲線中計算樣品中ST的含量。測得的標準液或樣品吸光度的平均值(B)除以第一個標準液(O標準液)的吸光度(B。)值再乘以100%，得到百分吸光度值，
百分吸光度值(％) = B/B0X100%
以標準品濃度的10為底的對數(shù)為X軸，百分吸光值為Y軸，繪制標準曲線。將樣本的百分吸光值代入標準曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中所含雜色曲霉毒素的量?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0007]圖1為雜色曲霉毒素標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0008]實施例1樣本前處理方法
準確稱取5.00 g樣品，加45 mL乙腈，5 mL含有4%KC1的40%硫酸溶液后，在振蕩機上振蕩30 min傾出清液，再用10 mL乙腈分兩次洗殘渣，收集乙腈液并與上述提取液合并，合并的提取液用石油醚脫脂三(石油醚用量為20，15，10 mL)，脫脂后的提取液加水25mL，用氯仿萃取三次(氯仿用量為20，15，10mL)，收集的氯仿層在低溫(_6°C)下冷凍，然后過濾去冰，去脂，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干(溫度40°C以下)，殘渣用樣品稀釋液溶解后供色譜測定用。
[0009]實施例2雜色曲霉毒素的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒制備
1、雜色曲霉毒素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作封閉、液的配置、以及孵育。把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作。包被液:1.6 g碳酸鈉加上2.9 g碳酸氫鈉，加雙蒸水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至9.6。封閉液:1 gBSA，IOOmLPBS。包板時每孔100ML包板液，37°C下孵育2 h，后取出洗板兩次，加封閉液，每孔180 μ?，37°C下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥劑2~8°C保存；
2、包被原的偶聯(lián):
碳二亞胺(EDC)法偶聯(lián)雜色曲霉毒素半抗原與蛋白載體:取5 mg雜色曲霉毒素半抗原和2.5 mg cBSA溶解在250 μ? TE buffer (pH 8.0)中，充分震蕩使其溶解，再取EDC.HCl79 mg充分溶解于250 μ?ΤΕ buffer (pH 8.0)中。將雜色曲霉毒素半抗原和cBSA的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC溶液，在37°C搖床中反應(yīng)2 h以上。先用S^hadex柱分離偶聯(lián)產(chǎn)物和未結(jié)合的雜色曲霉毒素半抗原小分子，再透析純化，將0.5 mL溶液在I3BS中透析3 d，每天換液兩次，每次換液200 mL。透析產(chǎn)物雜色曲霉毒素半抗原偶聯(lián)蛋白小劑量分裝，于-20°C保存，備用；
3、雜色曲霉毒素單克隆抗體制備方法:
I材料和方法
(1)試劑 人工抗原:雜色曲霉毒素-牛血清白蛋白復合物，弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑，L-谷氨酰胺，牛血清白蛋白第五部分，聚乙二醇_1000，2，6，10，14-四甲基十五烷(Pristane ),鄰苯二胺,二甲基亞砜,Tris, Hepes pH緩沖劑,免疫球蛋白，辣根過氧化氫酶標物，小鼠IgG和羊抗小鼠IgG等，其它常規(guī)化學試劑均為優(yōu)級純、分析純試劑；
(2)免疫動物
8周齡BALB/c雄性小鼠用人工抗原雜色曲霉毒素-BSA行二次免疫；每只小鼠基礎(chǔ)免疫劑量為100 Pg，腹腔注射:24d后加強免疫，尾靜脈注射，4 d后取脾融合；
(3)細胞融合
免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp-2/O以10:1混合。用50%分子量為1000聚乙二醇作融合劑，融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，接種于似小鼠腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于50% C02, 37°C條件下培養(yǎng)，7 d后，每培養(yǎng)孔更換2/3HT培養(yǎng)液。9 d后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養(yǎng)孔，取上清液進行篩選，對檢測結(jié)果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆化；
(4)腹水抗體純化
用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體；
(5)雜交瘤篩選及抗體檢測
雜交瘤篩選用固相抗原間接競爭性ELISA法進行:包被抗原雜色曲霉毒素-BSA的濃度為15 Pg/mL，每孔加量120 PL ;每孔所含抗體抗原反應(yīng)物由80 PL培養(yǎng)上清液+2 μ?經(jīng)紫外分光光度計標定濃度的雜色曲霉毒素(10 Pg/mL)組成；檢測對照孔中的抗原部分則用20 PL毒素稀釋液(20%Me0H-PBS)代替；酶底物用鄰苯二胺(OPD);其它按標準方法進行；
(6)抗體的特性
①抗體滴度:
用固相抗原間接非競爭性ELISA測定，測試條件為:包被抗原為雜色曲霉毒素-BSA，濃度15 Pg/mL，每孔加量150 μ?:抗體從100倍開始對倍稀釋,每孔加量130μ? ;抗體稀釋液為0.1%的BSA-PBS ;陰性對照孔用SP-2/0骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液；封閉液為1%BSA_PBS，每孔加量250 μ? ;酶底物用OPD。其它按標準方法進行；
②檢測標準毒素靈敏度:
先用棋盤滴定法篩選出包 被抗原濃度和抗體工作稀釋度的優(yōu)化組合，以此為測試條件，用固相抗原間接競爭性ELISA法做出雜色曲霉毒素的標準抑制曲線，并對結(jié)果進行數(shù)理統(tǒng)計分析。其中ELISA測試條件為:包被包被原雜色曲霉毒素-BSA偶聯(lián)蛋白的濃度為5Kg/mL，每孔加量150 μ? ;抗體工作液稀釋比為1:25600 ;抗體稀釋液為0.1% BSA-PBS ;抗體抗原反應(yīng)液為每孔65 PL抗體+65 PL相應(yīng)濃度雜色曲霉毒素；封閉液為1%BSA-PBS,每孔加量250 μ? ;酶底物為OPD ;陰性對照用Sp-2/O骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液。其它按標準方法進行；
③抗體的特異性:
用固相抗原間接競爭性ELISA法測定，參試毒素為雜色曲霉毒素，構(gòu)巢曲霉，黃曲霉，寄生曲霉，黃曲霉毒素馬，其它測試條件同②；
④抗體亞類分析:
用免疫雙擴散法進行；
⑤抗體的親和力:
Friguet法。對應(yīng)小鼠IgG標準曲線滴定出抗體IgG含量，再對應(yīng)抗體滴度曲線求出平衡態(tài)下，抗體使抗原達到半飽和時的游離抗體克分子濃度[Ab]，代入下式求出抗體的親和常數(shù) K (L/moL),
Ka = I / [Ab]
(7)樣品中雜色曲霉毒素提取與純化；
II結(jié)果與討論
細胞融合一與雜交瘤細胞的篩選細胞融合后，約57.6%的孔中長出雜交瘤克隆，其中抗體檢測陽性率約為88%。從中選擇對抗原有強抑制作用的孔，經(jīng)多次亞克隆、建立了 5個穩(wěn)定分泌抗雜色曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株各細胞株經(jīng)兩次亞克隆以后，陽性率已達到100 %。2H8第3次克隆化時有反復(疑為假明性)，所以進行了 4次亞克隆。將上述抗體純化，即可。
[0010]4、雜色曲霉毒素的標準品由高標稀釋而成，稀釋液為PBS。0.1M PBS:1000 mL蒸餾水中加 NaCl 9 g, Na2HPO4.Iffi2O6 g, NaH2PO4.2H20 0.4 g, pH:7.2。
[0011]5、雜色曲霉毒素的酶標抗體的酶由辣根過氧化酶標記。該酶標抗體用交聯(lián)法制作，聯(lián)劑是25%的戊二醛水溶液。原理是利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基，分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結(jié)合而進行標記。標記時應(yīng)盡量采用新鮮純品，當戌二醛的0D235nm/0D28(lnm < 3時，即為好的交聯(lián)劑。該發(fā)明采用一步法制作，即把辣根過氧化酶、戊二醛和雜色曲霉抗體一起加入進行交聯(lián)。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有聞分子量的酶結(jié)合物。由于抗體分子量大(16萬)，酶分子量小(4萬)，抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多，結(jié)果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標物的活性小。一步法操作:
①抗IgG-雜色曲霉毒素的制備:將10 mg雜色曲霉毒素溶于含有5 mg抗IgG的ImLPBS (0.01 moL/L pH7.0)中，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產(chǎn)生，完全溶解后，緩緩滴加1%戊二醛溶液4 ml，使戊二醛的最終濃度為0.2%，移至室溫中靜置2tT3h后，以0.01moL/L pH7.0 PBS液4°C充分透析或以S印hadexG25柱除去過量的戊二醛，4°C保存?zhèn)溆?也可保存于50%甘油中置低溫冰箱);②抗IgG-HRP的制備:將12 mgHRP溶于含5 mg抗IgG的I mLPBS (0.lmol/L ρΗ6.8)中，緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4 mL，置室溫2h?3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱，避免反復凍融，或冷凍干燥保存。
[0012]6、洗滌液的制備:
十二水磷酸氫鈉68.8 g加磷酸二氫鈉6.9 g,氯化鈉45 g, Tween-20 0.5 mL,加雙蒸水至1L,調(diào)節(jié)pH至7.4。
[0013]7、顯色液的制備:
顯色液A:無水乙酸鈉8.2 g，β-糊精2.5 g，過氧化氫脲428.6 g，加雙蒸水至I L，調(diào)節(jié)pH至5.0，4°C保存，使用時達室溫。顯色液B:100 mgTMB溶于10 mLDMSO中，棕色瓶保存。使用時將14.6 mL顯色液A與0.45 mL顯色液B混合15分鐘。
[0014]8、終止液制備:
2M硫酸:0.11 L 18M的濃硫酸加水稀釋到I L。
[0015]實施例3測定步驟:
1、將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡30min，每種液體使用前均須搖勻。注意標準液均需做2個平行試驗；
2、加標準品:加標準品/樣本50μ L到對應(yīng)的微孔中，再加入酶標記物50 μ L/孔，然后再加入50μ L/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30 min ；
3、洗板:小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液2501117孔，每次浸泡15?30 s,充分洗滌4飛次，用吸水紙拍干；
4、顯色:加入顯色液IOOyL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境反應(yīng) 15 min ；
5、測定:每孔各加50μ L終止液，設(shè)定酶標儀在450 nm處，測定OD值(建議用450/630nm雙波長檢測,在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))； 6、結(jié)果分析:
所測得的標準液或樣品吸光度的平均值(B)除以第一個標準液(O標準液)的吸光度(B。)值再乘以100%，得到百分吸光度值，
百分吸光度值(％) = B/B0X100%
以標準品濃度的10為底的對數(shù)為X軸，百分吸光值為Y軸，繪制標準曲線。將樣本的百分吸光值代入標準曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中所含雜色曲霉毒素的量。
【權(quán)利要求】
1.雜色曲霉毒素試劑盒的制備，包括洗滌液，顯色液，終止液；其特征在于:包有雜曲霉毒素固相抗原的包被板、雜色曲霉毒素(ST)標準品，雜色曲霉毒素單克隆抗體、雜色曲霉毒素酶標抗體。
2.雜色曲霉毒素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作、封閉液的配置、以及孵育；包被原的偶聯(lián):根據(jù)雜色曲霉的結(jié)構(gòu)特征偶聯(lián)載體蛋白BSA方法如下: 碳二亞胺(EDC)法偶聯(lián)雜色曲霉毒素半抗原與蛋白載體； 取5 mg雜色曲霉毒素半抗原和2.5 mg cBSA溶解在250 μ?ΤΕ buffer (pH 8.0)中，充分震蕩使其溶解，再取EDOHCl 79 mg充分溶解于250 μ? TE buffer (pH 8.0)中；將雜色曲霉毒素半抗原和cBSA的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC溶液，在37°C搖床中反應(yīng)2 h以上；先用S^hadex柱分離偶聯(lián)產(chǎn)物和未結(jié)合的雜色曲霉毒素半抗原小分子；再透析純化，將0.5 mL溶液在PBS中透析3 d，每天換液兩次，每次換液200 mL ;制得的雜色曲霉毒素偶聯(lián)物透析產(chǎn)物小劑量分裝，于-20°C保存，備用；包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作；包被液:1.6 g碳酸鈉加上2.9 g碳酸氫鈉，加雙蒸水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至9.6 ;封閉液:1 g BSA，100 mL PBS ；包板時每孔100 PL包板液，37°C下孵育2 h，后取出洗板兩次，加封閉液，每孔180 μ?,37°0下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥劑疒8°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求書第一條所述，雜色曲霉毒素單克隆抗體制備方法 I材料和方法 (1)試劑 人工抗原:雜色曲霉毒素-牛血清白蛋白復合物，弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑，L-谷氨酰胺，牛血清白蛋白第五部分，聚乙二醇-1000，2，6，10，14-四甲基十五烷(Pristane ),鄰苯二胺,二甲基亞砜，Tris, Hepes pH緩沖劑,免疫球蛋白，辣根過氧化氫酶，鼠抗IgG等，其它常規(guī)化學試劑均為優(yōu)級純、分析純試劑； (2)免疫動物 8周齡BALB/c雄性小鼠用人工抗原雜色曲霉毒素-BSA進行二次免疫；每只小鼠基礎(chǔ)免疫劑量為100 Pg腹腔注射；24 d后加強免疫，劑量為每只小鼠100 Pg，尾靜脈注射，4 d后取脾融合； (3)細胞融合 免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp-2/O以10:1混合； 用50%分子量為1000的聚乙二醇作融合劑，融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，接種于類似 小鼠腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于50% C02，37°C條件下培養(yǎng)7 d后，每培養(yǎng)孔更換2/3HT培養(yǎng)液；9 d后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養(yǎng)孔，取上清液進行篩選，對檢測結(jié)果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆化； (4)腹水抗體純化 用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體； (5)雜交瘤篩選及抗體檢測 雜交瘤篩選用固相抗原間接競爭性ELISA法進行:包被抗原雜色曲霉毒素-BSA的濃度為15 Pg/mL，每孔加量120 PL ;每孔所含抗體抗原反應(yīng)物由80 PL培養(yǎng)上清液+2 μ?經(jīng)紫外分光光度計標定濃度的雜色曲霉毒素(10 Pg/mL)組成；檢測對照中的抗原部分則用20KL毒素稀釋液(20%Me0H-PBS)代替；酶底物用鄰苯二胺(OPD);其它按標準方法進行；(6)抗體的特性 ①抗體滴度: 用固相抗原間接非競爭性ELISA測定，測試條件為:包被抗原為雜色曲霉毒素-BSA，濃度15 Pg/mL，每孔加量150 PL ;抗體從100倍開始對倍稀釋，每孔加量130 PL ;抗體稀釋液為0.1%的BSA-PBS ;陰性對照孔用SP-2/0骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液；封閉液為1% BSA-PBS,每孔加量250 μ? ;酶底物用OPD，其它按標準方法進行； ②檢測標準毒素靈敏度: 先用棋盤滴定法篩選出包被抗原濃度和抗體工作稀釋度的優(yōu)化組合，以此為測試條件，用固相抗原間接競爭性ELISA法做出雜色曲霉毒素的標準抑制曲線，并對結(jié)果進行數(shù)理統(tǒng)計分析；其中ELISA測試條件為:包被抗原雜色曲霉毒素-BSA的濃度為5 Pg/mL,每孔加量150 μ? ;抗體工作稀釋度1:25600 ;抗體稀釋液為0.1% BSA-PBS ;抗體抗原反應(yīng)液為每孔65 PL抗體+65 PL相應(yīng)濃度雜色曲霉毒素；封閉液為1% BSA-PBS，每孔加量250 μ? ;酶底物為OPD ;陰性對照用Sp-2/O骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液，其它按標準方法進行； ③抗體的特異性: 用固相抗原間接競爭性ELISA法測定，參試毒素為雜色曲霉毒素，構(gòu)巢曲霉，黃曲霉，寄生曲霉，黃曲霉毒素馬；其它測試條件同②； ④抗體亞類分析: 用免疫雙擴散法進行； ⑤抗體的親和力: Friguet法，對應(yīng)小鼠IgG標準曲線滴定出抗體IgG含量，再對應(yīng)抗體滴度曲線求出平衡態(tài)下，抗體使抗原達到半飽和時的游離抗體克分子濃度[Ab]，代入下式求出抗體的親和常數(shù) K (L/moL),
Ka = I /[Ab] (7)樣品中雜色曲霉毒素提取與純化 II結(jié)果與討論 (I)細胞融合與雜交瘤細胞的篩選細胞融合后，約57.6%的孔中長出雜交瘤克隆，其中抗體檢測陽性率約為88% ;從中選擇對抗原有強抑制作用的孔，經(jīng)多次亞克隆，建立了 5個穩(wěn)定分泌抗雜色曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株，各細胞株經(jīng)兩次亞克隆以后，陽性率已達到100% ;第3次克隆化時有反復(疑為假明性)，所以進行了 4次亞克隆；將上述抗體純化，即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求書第一條所述，雜色曲霉毒素的標準品由高標稀釋而成，稀釋液為PBS ；0.1M PBS:1000 mL 蒸餾水中加 NaCl 9 g, Na2HP04.12H20 6 g, NaH2P04.2H20 0.4g，pH:7.2o
5.根據(jù)權(quán)利要求書第一條所述，雜色曲霉毒素的酶標抗體的酶由辣根過氧化酶標記；該酶標抗體用交聯(lián)法制作，交聯(lián)劑是25%的戊二醛水溶液，原理是利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基，分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結(jié)合而進行標記；標記時應(yīng)盡量采用新鮮純品，當戌二醛的0D235nm/0D28(lnm < 3時，即為好的交聯(lián)劑；該發(fā)明采用一步法制作，即把辣根過氧化 酶、戊二醛和雜色曲霉抗體一起加入進行交聯(lián)；然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結(jié)合物；由于抗體分子量大(16)，酶分子量小(4萬)，抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多，結(jié)果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標物的活性?。灰徊椒ú僮?①抗IgG-雜色曲霉毒素的制備:將10mg雜色曲霉毒素溶于含有5 mg抗IgG的I mLPBS (0.01 moL/L pH7.0)中，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產(chǎn)生，完全溶解后，緩緩滴加1%戊二醛溶液4 mL，使戊二醛的最終濃度為0.2%，移至室溫中靜置2 h~3 h后，以0.01 moL/L pH 7.0 PBS液4°C充分透析或以S印hadexG25柱除去過量的戊二醛，4°C保存?zhèn)溆?也可保存于50%甘油中置低溫冰箱)抗 IgG-HRP 的制備:將 12 mg HRP 溶于含 5 mg 抗 IgG 的 I mLPBS (0.1 moL/L pH 6.8)中，緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4 mL,置室溫2tT3h，充分透析或以S^hadexG25除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱，避免反復凍融或冷凍干燥保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求書所述，雜色曲霉毒素的檢測步驟如下:取包被板，加入標準品/樣本50 μ L到對應(yīng)的微孔中，再加入酶標記物50 μ L/孔，然后再加入50 μ L /孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30 min ;小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液250 μL/孔，每次浸泡15~30 S，充分洗滌4飛次，用吸水紙拍干；加入顯色液100μ L /孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境反應(yīng)15 min;每孔各加50 μ L終止液，設(shè)定酶標儀在450 nm處，測定OD值(建議用450/630 nm雙波長檢測，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；從標準曲線中計算樣品中ST的含量
【文檔編號】G01N33/577GK103792360SQ201210435692
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月5日
【發(fā)明者】杜道林, 祝文珍 申請人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司