專(zhuān)利名稱(chēng)：熒光團(tuán)化合物的制作方法
熒光團(tuán)化合物相關(guān)在先申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2008年4月3日提交的序列號(hào)為61/041923的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的 優(yōu)先權(quán)。就美國(guó)專(zhuān)利實(shí)踐而言，通過(guò)引用將該臨時(shí)申請(qǐng)整體并入本文。領(lǐng)域本文提供熒光團(tuán)化合物。具體地，本文提供包括對(duì)甲氨基酚和若丹明、可用作熒光 標(biāo)記(fluorescent label)和/或熒光探針(fluorogenic probe)的熒光團(tuán)化合物。本文 還提供制備本文所公開(kāi)的熒光團(tuán)化合物的新穎而通用的方法。本文還提供示蹤、測(cè)量、檢測(cè) 或篩選生物物質(zhì)(biological species)的方法。背景在包括化學(xué)和生物學(xué)的許多領(lǐng)域，熒光技術(shù)受到的關(guān)注日益增多。在某些情況中， 熒光分子可用于檢測(cè)食品和環(huán)境樣品中是否存在分析物或化學(xué)品。在離體生化分析(如 DNA測(cè)序和血糖定量)中，需要一些靈敏的熒光定量檢測(cè)設(shè)備。在一些情況中，具有合適的 光化學(xué)性質(zhì)的熒光探針可用于示蹤活細(xì)胞中的分子和生理學(xué)事件，以及用于高通量篩選。 一般地，熒光技術(shù)比其他類(lèi)型的光學(xué)測(cè)量更簡(jiǎn)單，并可提供更高的靈敏度和更多的分子信 息。熒光測(cè)量一般是高度靈敏的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)化學(xué)和生物樣品中發(fā)現(xiàn)的熒光背景一般處于 低水平。隨著熒光儀器(如共焦和多光子熒光顯微鏡)領(lǐng)域最近取得的進(jìn)展，細(xì)胞事件的 實(shí)時(shí)三維成像和生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)研究已經(jīng)變得可能。盡管有以上提及的優(yōu)點(diǎn)，但將熒光技術(shù)用于特定應(yīng)用的可行性往往可受到適當(dāng)熒 光分子的可利用性的限制。熒光分子一般包括熒光標(biāo)記(或熒光示蹤劑)分子和熒光探針 (或熒光傳感器(fluorogenic sensor))分子，二者在其熒光性質(zhì)上有所不同。一般地，熒 光標(biāo)記分子的熒光總是處于“開(kāi)啟”狀態(tài)。熒光標(biāo)記分子可用于示蹤生物物質(zhì)。相反，可通 過(guò)與某些分析物或化學(xué)品鍵合或反應(yīng)來(lái)改變熒光探針?lè)肿拥臒晒庑再|(zhì)。因此，熒光探針?lè)?子可用于示蹤、測(cè)量、檢測(cè)或篩選與熒光探針?lè)肿渔I合或反應(yīng)的各種分析物或化學(xué)品。當(dāng)用作熒光標(biāo)記或熒光染料時(shí)，熒光標(biāo)記分子需要與生物活性靶標(biāo)(如蛋白質(zhì)、 DNA、酶、抗體、細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、藥物、激素、核苷酸、核酸、多糖、脂質(zhì)或其他生物分子) 反應(yīng)，得到所述靶標(biāo)的熒光衍生物?？膳c生物活性靶標(biāo)反應(yīng)的可利用熒光標(biāo)記分子的數(shù)目 一般是有限的?；钚詿晒馑睾腿舻っ餮苌锸瞧駷橹棺顝V泛使用的熒光標(biāo)記分子，因?yàn)?可通過(guò)常用光源(如氬激光(488nm和514nm線)和汞弧光燈(546nm線))將它們適當(dāng)激 發(fā)。然而，它們具有一些可能使它們無(wú)法用于一些有用應(yīng)用的不利性質(zhì)。例如，熒光素衍生 物可相對(duì)快速地被光漂白，而且可顯示依賴(lài)于PH的吸收性，這在等于或小于7的生理pH值 下導(dǎo)致熒光顯著減弱。另一方面，雖然相比于熒光素衍生物，若丹明衍生物對(duì)光相對(duì)穩(wěn)定， 且表現(xiàn)出發(fā)熒光對(duì)PH不敏感，但它們?cè)谒芤褐械牧孔赢a(chǎn)率低得多，而且與蛋白質(zhì)綴合時(shí) 進(jìn)一步降低量子產(chǎn)率。此外，若丹明衍生物及其綴合物(conjugates)的低水溶性對(duì)包含若 丹明衍生物的熒光標(biāo)記分子的制備和使用帶來(lái)困難。鑒于以上提及的熒光素和若丹明衍生物的不利性質(zhì)，對(duì)新的熒光標(biāo)記分子存在需 求，所述新的熒光標(biāo)記分子相對(duì)于熒光素和若丹明衍生物具有改進(jìn)的性質(zhì)。一些對(duì)甲氨
9基酚或熒光素衍生物(如 Ioffe 等，J. Org. Chem. USSR 1965，1，326-336 ；Reynolds G. Α.， 美國(guó)專(zhuān)利第 3932415 號(hào)；Lee 等，Cytometry 1989，10，151-164 ；Haugland 等，美國(guó)專(zhuān)利第 5227487 號(hào)；Whitaker 等，Anal. Biochem. 1992，207，267-279 中所描述的那些)可用作另選 的(alternative)熒光標(biāo)記分子，因?yàn)樗鼈円话憔哂袩晒馑睾腿舻っ鞯暮弦庑再|(zhì)。例如，它 們具有合意的吸收性質(zhì)，其熒光對(duì)生理范圍內(nèi)的PH和溶劑極性的敏感度低，具有高消光系 數(shù)、高量子產(chǎn)率、高光穩(wěn)定性，在各種溶劑中具有高溶解性。雖然對(duì)甲氨基酚熒光染料具有合意的性質(zhì)，但文獻(xiàn)很少報(bào)道它們作為熒光標(biāo)記或 熒光探針的應(yīng)用，這可能是因?yàn)閷?duì)甲氨基酚化合物難以合成。一般地，制備對(duì)甲氨基酚熒光 團(tuán)的關(guān)鍵合成步驟是在路易斯酸催化劑(如氯化鋅)或脫水酸的存在下，使取代或未取代 的間苯二酚與取代或未取代的6-酰基-3-氨基苯酚縮合?；蛘?，可通過(guò)以下方式制備對(duì)甲 氨基酚熒光團(tuán)在路易斯酸催化劑的存在下，使取代或未取代的氨基苯酚與取代或未取代 的4-?；?間苯二酚縮合。以上提及的一般合成方法一般具有產(chǎn)率低、純化工作繁瑣的缺 點(diǎn)。因此，需要開(kāi)發(fā)更有效的合成方法，用于制備熒光團(tuán)化合物，如對(duì)甲氨基酚熒光團(tuán)。最近，用于不同靶標(biāo)的熒光探針的開(kāi)發(fā)遭遇瓶頸。這可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)目前可利 用的熒光探針是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而不是理性地開(kāi)發(fā)，這可妨礙新的熒光探針的設(shè)計(jì)。盡管已經(jīng)報(bào) 道了 一些將理論方法應(yīng)用于熒光探針設(shè)計(jì)的方法，但這些還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。另一種有效的方法 涉及熒光探針?lè)肿訋?kù)的組合合成。對(duì)甲氨基酚熒光團(tuán)適合用作熒光探針庫(kù)，因?yàn)樗鼈兙哂?以上所述的有利的光物理性質(zhì)。因此，還需要包括對(duì)甲氨基酚熒光團(tuán)在內(nèi)的熒光團(tuán)化合物 庫(kù)，它可通過(guò)新的有效合成方法容易地開(kāi)發(fā)出來(lái)，用于制備本文所公開(kāi)的熒光團(tuán)化合物。概述本文提供熒光團(tuán)化合物(如對(duì)甲氨基酚和若丹明熒光團(tuán))及其制備方法，所述熒 光團(tuán)化合物可用作熒光標(biāo)記和/或熒光探針，用于示蹤、測(cè)量、檢測(cè)或篩選生物物質(zhì)。一方面，本文提供制備式(III)或(VI)的熒光團(tuán)化合物或其鹽的方法
(ΠΙ)或所述方法包含以下步驟(a)使式(I)或(IV)的化合物 分別與式B-X
的羥基活化劑反應(yīng)，分別得到中間體(II)或(V)
權(quán)利要求
制備式(III)或(VI)的熒光團(tuán)化合物或其鹽的方法所述方法包含以下步驟(a)使式(I)或(IV)的化合物分別與式B X’的羥基活化劑反應(yīng)，分別得到中間體(II)或(V)以及(b)在鈀催化劑的存在下，使中間體(II)或(V)與式HXR1的親核試劑偶聯(lián)，分別形成式(III)或(VI)的熒光團(tuán)化合物，其中OB是羥基活化基團(tuán)；W1是O或S；W2是O A、S A或NR3R4；X是NR2、O或S；Y是O、S、Se、NR5或CR6R7；Z1是CR8或N；Z2是CR9R10或NR11；A是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、雜環(huán)基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、羧基烷基、烷氧基羰基、?；?、氨基羰基、羥基保護(hù)基或反應(yīng)性官能團(tuán)；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R9、R10和R11各自獨(dú)立地為H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、雜環(huán)基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺?；蓟?、?；蚍磻?yīng)性官能團(tuán)；或者CR9R10是式(VII)或(VUIa)的取代2 羧基苯基 C基團(tuán)R8是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、雜環(huán)基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺酰基芳基、?；蚍磻?yīng)性官能團(tuán)，或者具有式(VIIb)或(VIIc)K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和K10各自獨(dú)立地為H、鹵素、烷基、鹵代烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、烷芳基、雜環(huán)基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、羥基烷基、氨基烷基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、?；被⒘u基、硫代、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰氧基、氰基、硝基、巰基、氨基甲?；⑷谆?、苯氧基、芐氧基、磺?；㈧Ⅴ；?、磺酸酯、磷酸酯、 C(＝O) P1或 C(＝O) Q P2；P1和P2各自獨(dú)立地為氫、鹵素、烷氧基、羥基、硫代、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、氨基甲酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、烷硫基、雜烷基或具有3 7個(gè)環(huán)原子的雜環(huán)基；以及Q是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基、亞芳烷基或亞烷芳基。FPA00001234536400011.tif,FPA00001234536400012.tif,FPA00001234536400013.tif,FPA00001234536400021.tif,FPA00001234536400022.tif
2.權(quán)利要求1所述方法，其中所述熒光團(tuán)化合物具有式(VIII)
3.權(quán)利要求1所述方法，其中所述熒光團(tuán)化合物具有式(IX)
4.權(quán)利要求1所述方法，其中所述熒光團(tuán)化合物具有式(XIII)
5.權(quán)利要求1所述方法，其中R1與R3相同，且R2與R4相同。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述方法，其中K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和K10各自獨(dú)立 地為H。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述方法，其中KH4HH和K10各自獨(dú)立地為H； 且K2和K5各自獨(dú)立地為氯或氟。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法，其中R1和R2是烷基。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法，其中R1和R2各自獨(dú)立地為甲基、乙基、丙基或丁基。
10.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法，其中R1是氫，R2是烷基。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述方法，其中所述羥基活化基團(tuán)是甲磺酰氧基、對(duì)甲苯 磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基、九氟丁磺酰氧基、對(duì)硝基苯甲酰氧基或膦酰氧基。
12.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述方法，其中所述羥基活化劑是甲磺酰鹵、三氟甲磺酰 鹵、甲苯磺酰鹵、九氟丁磺酰鹵、甲磺酸酐、三氟甲磺酸酐、甲苯磺酸酐、九氟丁磺酸酐或其 組合。
13.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述方法，其中B是磺?；?、羧基或膦?；?。
14.權(quán)利要求13所述方法，其中B是磺?；?，其選自甲磺酰基、三氟甲磺?；⒓妆交酋?基或九氟丁磺?；?。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述方法，其中所述親核試劑中的X是NR2，其中R1和R2各 自獨(dú)立地是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、雜環(huán)基、氨基 烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺?；蓟?、酰 基或反應(yīng)性官能團(tuán)。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述方法，其中所述鈀催化劑包含至少一種鈀源。
17.權(quán)利要求16所述方法，其中所述鈀源是乙酸鈀、三(二亞芐基丙酮)二鈀或其組口 O
18.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述方法，其中所述鈀催化劑包含至少一種膦配體或卡賓 配體。
19.權(quán)利要求18所述方法，其中所述膦配體是外消旋_2，2’-雙(二苯基膦基)-1， 1，-聯(lián)二萘(BINAP)、1，1，_雙(二苯基膦基)二茂鐵((1 0、2-(二環(huán)己基膦基)聯(lián)苯、三 環(huán)己基膦、三苯基膦、三-叔丁基膦、9，9-二甲基-4，5-雙(二苯基膦基)咕噸(Xantphos)、 2- ( 二-叔丁基膦基)聯(lián)苯或外消旋-2- ( 二叔丁基膦基)-1，1’ _聯(lián)萘。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述方法，其中所述羥基保護(hù)基是芐氧基羰基、4-硝基芐氧基羰基、4-溴芐氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、異丙氧 基羰基、二苯基甲氧基羰基、2，2，2_三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、 2-糠基氧基羰基、烯丙氧基羰基、乙?；?、甲?；?、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙?；?、芐 氧基乙?；?、苯甲?；?、甲基、叔丁基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1，1-二甲 基-2-丙烯基、3-甲基-3- 丁烯基、烯丙基、芐基、對(duì)甲氧基芐基二苯基甲基、三苯基甲基 (三苯甲基)、四氫呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、芐氧基甲基、2，2，2_三氯乙氧基甲 基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺?；?、對(duì)甲苯磺?；⑷谆坠柰榛?、三乙基 甲硅烷基或三異丙基甲硅烷基。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述方法，其中所述反應(yīng)性官能團(tuán)衍生自丙烯酰胺、酰疊 氮、酰鹵、腈、醛、酮、烷基鹵、烷基磺酸酯、酸酐、芳基鹵、炔、醇、胺、羧酸、碳二亞胺、重氮烷、 環(huán)氧化物、鹵代乙酰胺、羥胺、胼、亞氨酸酯、異硫氰酸酯、馬來(lái)酰亞胺、磺酸酯或磺酰鹵。
22.式(VIII)的熒光團(tuán)化合物或其鹽
23.式(XIII)的熒光團(tuán)化合物或其鹽
24.權(quán)利要求23所述熒光團(tuán)化合物，其中R1與R3相同，且R2與R4相同。
25.權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物，其中K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和 Kltl各自獨(dú)立地為H。
26.權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物，其中K1、K3、K4、K6、K7、K8、K9和Kltl各 自獨(dú)立地為H ；K2和K5各自獨(dú)立地為氯或氟。
27.權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物，其中R1和R2各自為烷基。
28.權(quán)利要求22-27中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物，其中R1和R2各自獨(dú)立地為甲基、乙基、丙基或丁基。
29.權(quán)利要求22-28中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物，其中R1是氫，R2是烷基。
30.權(quán)利要求22-29中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物，其中所述反應(yīng)性官能團(tuán)衍生自丙烯 酰胺、酰疊氮、酰鹵、腈、醛、酮、烷基鹵、烷基磺酸酯、酸酐、芳基鹵、炔、醇、胺、羧酸、碳二亞 胺、重氮烷、環(huán)氧化物、商代乙酰胺、羥胺、胼、亞氨酸酯、異硫氰酸酯、馬來(lái)酰亞胺、磺酸酯或 磺酰鹵。
31.權(quán)利要求22-30中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物，其中所述羥基保護(hù)基是芐氧基羰基、 4-硝基芐氧基羰基、4-溴芐氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、 異丙氧基羰基、二苯基甲氧基羰基、2，2，2_三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基 羰基、2-糠基氧基羰基、烯丙氧基羰基、乙?；?、甲?；⒙纫阴；⑷阴；⒓籽趸阴?基、芐氧基乙?；⒈郊柞；?、甲基、叔丁基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1， 1- 二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3- 丁烯基、烯丙基、芐基、對(duì)甲氧基芐基二苯基甲基、三苯基甲基(三苯甲基)、四氫呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、芐氧基甲基、2，2，2-三氯乙氧 基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、對(duì)甲苯磺?；⑷谆坠柰榛?、三 乙基甲硅烷基或三異丙基甲硅烷基。
32.示蹤、檢測(cè)、測(cè)量或篩選生物物質(zhì)的方法，其中所述方法包含以下步驟a)使權(quán)利要求22-31中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物與所述生物物質(zhì)接觸，以形成熒光化 合物；以及b)測(cè)量所述熒光化合物的熒光性質(zhì)。
33.如權(quán)利要求32所述方法，其中所述生物物質(zhì)包括來(lái)自動(dòng)物的蛋白質(zhì)、DNA、酶、抗 體、細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、藥物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂質(zhì)。
34.權(quán)利要求32所述方法，其中所述動(dòng)物是人。
35.示蹤或檢測(cè)樣品中的生物物質(zhì)的高通量熒光篩選方法，其中所述高通量方法包含 以下步驟a)使權(quán)利要求22-31中任一項(xiàng)所述熒光團(tuán)化合物與所述樣品接觸，以形成一種或多種 熒光化合物；以及b)測(cè)量所述熒光化合物的熒光性質(zhì)，以確定所述樣品中生物物質(zhì)的量。
36.權(quán)利要求35所述方法，其中所述生物物質(zhì)包括來(lái)自動(dòng)物的蛋白質(zhì)、DNA、酶、抗體、 細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、藥物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂質(zhì)。
37.權(quán)利要求36所述方法，其中所述動(dòng)物是人。
全文摘要
本文提供包括對(duì)甲氨基酚和若丹明化合物的可用作熒光標(biāo)記和/或熒光探針的熒光團(tuán)化合物及其制備方法。本文還提供可用來(lái)示蹤、測(cè)量、檢測(cè)或篩選生物物質(zhì)的方法，所述生物物質(zhì)如或有機(jī)體中的蛋白質(zhì)、DNA、酶、抗體、細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、藥物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂質(zhì)。具體而言，所述方法包括以下步驟使本文所公開(kāi)的熒光團(tuán)化合物、對(duì)甲氨基酚化合物和若丹明化合物中的任何種與生物物質(zhì)接觸，以形成一種或多種熒光化合物，以及測(cè)量熒光化合物的熒光性質(zhì)。本文還提供用于檢測(cè)或篩選生物物質(zhì)的高通量熒光篩選方法。
文檔編號(hào)G01N21/77GK101983194SQ200980112496
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者彭濤, 楊丹 申請(qǐng)人:港大科橋有限公司;晨興創(chuàng)投有限公司