專利名稱：肺炎支原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體檢測試劑盒及其制備方法，具體涉及一種肺炎支原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae, MP)是引起原發(fā)性非典型肺炎及其他呼吸道感染性疾病的常見病原微生物。除呼吸道外，MP尚可引起其他系統(tǒng)嚴(yán)重的并發(fā)癥。肺炎支原體抗體檢查方法包括冷凝聚試驗、間接血凝抑制試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、 肺炎支原體的培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。支原體肺炎的診斷有病原體培養(yǎng)、多種特異性血清學(xué)檢查，近年又有基因探針及DNA、PCR方法。而冷凝聚試驗、間接血凝抑制試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗及肺炎支原體的培養(yǎng)由于特異性差、敏感性低等問題在臨床應(yīng)用價值受限。冷凝聚試驗、支原體抗體測定時兩者的高峰出現(xiàn)晚，多在2 4周，并與患者年齡、免疫功能、感染輕重、病程的長短有密切關(guān)系。肺炎支原體感染后血清冷凝聚抗體陽性者，僅僅占45% 75%。嬰幼兒由于免疫系統(tǒng)發(fā)育未完善，部分免疫功能低下，在肺炎支原體感染時抗體產(chǎn)生不足，從而影響檢出率，咽拭培養(yǎng)分離肺炎支原體，對于一些血清學(xué)不能診斷肺炎支原體的患兒，可提高檢出陽性率。ELISA方法測定特異性MP2IgA，其陽性率達(dá)56. 01%;用顆粒凝聚法測定的MP2IgM，其陽性率達(dá)60. 81%。目前國內(nèi)外一致認(rèn)為MP2IgM、MP2IgG等特異性抗體測定是臨床診斷肺炎支原體感染較為可靠的指標(biāo)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種可以快速定性檢測血清樣本中肺炎支原體IgM抗體的肺炎支原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為肺炎支原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒，包括硝酸纖維素膜檢測線包被的重組抗原MP-Ag、質(zhì)控線上包被的羊抗鼠IgG抗體和金標(biāo)墊上包被的由膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗，
所述重組肺炎支原體抗原為無色透明液體，濃度大于ang/ml，用SDS-PAGE測定； 所述羊抗鼠IgG抗體為無色透明液體，濃度大于％ig/ml ；
所述鼠抗人IgM單抗為無色透明液體，濃度大于ang/ml，用SDS-PAGE測定，上樣量在 10 μ 1條件下為兩條帶。本發(fā)明的另一個目的是提供肺炎支原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟
(1)反應(yīng)膜的制備用磷酸鹽緩沖液將重組ΜΡ-iVg稀釋到包被濃度為1.0mg/ml，將羊抗鼠IgG抗體稀釋成包被濃度為2. Omg/ml，用點膜機(jī)將兩種包被液分別劃到硝酸纖維素膜上，將已包被的硝酸纖維素膜干燥后保存；
(2)鼠抗人IgM單抗金結(jié)合物墊的制備將標(biāo)記濃度為10-18μ g/ml的鼠抗人IgM 單抗與膠體金進(jìn)行偶聯(lián)制得膠體金標(biāo)記鼠抗人IgM單抗溶液，以轉(zhuǎn)速為12000r/min離心40min,棄上清，加入膠體金結(jié)合物稀釋液至原體積的1/2，然后用混合液浸泡金標(biāo)墊，制備成MP-IgM金結(jié)合物墊，將MP-IgM金結(jié)合物墊干燥后保存；
(3)切割裝配在反應(yīng)膜所在膠板的上部揭去1. 5cm寬的不干膠紙，粘貼上粗纖維濾紙，使紙的下部壓住反應(yīng)膜，揭去反應(yīng)膜下部的0. 9cm的不干膠紙，貼上MP-IgM金結(jié)合物墊，并且MP-IgM金結(jié)合物墊的上部壓住反應(yīng)膜1mm，再揭去MP-IgM金結(jié)合物墊下部的的不干膠紙，貼上樣品墊，樣品墊的上部壓住MP-IgM金結(jié)合物墊的下部1mm，制成反應(yīng)板，再用切條機(jī)切成4mm試紙條，進(jìn)行裝卡后，裝入鋁箔袋內(nèi)制成產(chǎn)品。上述制備方法中，所述步驟(1)和(2)的干燥條件為37°C干燥3小時。上述制備方法中，所述步驟(2)的鼠抗人IgM單抗的標(biāo)記濃度為15 μ g/ml。本發(fā)明的有益效果為肺炎支原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒具有快速、簡便、 準(zhǔn)確和靈敏度高的特點，整個操作時間僅需20分鐘就可以判讀結(jié)果。膠體金快速檢測試紙條，以多表位的重組抗原為原料，具有操作更加簡便，成本低廉，特異性好，靈敏度高的特點，可單份檢測，易于普及，對于肺炎支原體IgM抗體的檢測和控制效果明顯。
具體實施例方式一、生產(chǎn)工藝條件的確定 1、反應(yīng)膜包被條件的優(yōu)化
1. 1檢測線包被濃度和膠體金標(biāo)記鼠抗人IgM稀釋比例的選擇 按照上述確定好的標(biāo)記條件進(jìn)行標(biāo)記，將其體積濃縮至原體積(原體積以膠體金體積計算)的1/10，再以不同的稀釋比例稀釋濃縮液，用稀釋液浸泡金標(biāo)墊，1.5ml/條，干燥后與以不同檢測線包被濃度，0. μ /mm的包被量包被好的MP-IgM反應(yīng)膜進(jìn)行配對，檢測內(nèi)控血清。實驗方案如表1，實驗結(jié)果如表2、3
權(quán)利要求
1.肺炎支原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒，包括硝酸纖維素膜檢測線包被的重組抗原MP-Ag、質(zhì)控線上包被的羊抗鼠IgG抗體和金標(biāo)墊上包被的由膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗，其特征在于所述重組肺炎支原體抗原為無色透明液體，濃度大于2mg/ml，用SDS-PAGE測定；所述羊抗鼠IgG抗體為無色透明液體，濃度大于％ig/ml ；所述鼠抗人IgM單抗為無色透明液體，濃度大于ang/ml，用SDS-PAGE測定，上樣量在 10 μ 1條件下為兩條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MP-IgM抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)反應(yīng)膜的制備用磷酸鹽緩沖液將重組ΜΡ-iVg稀釋到包被濃度為1.0mg/ml，將羊抗鼠IgG抗體稀釋成包被濃度為2. Omg/ml，用點膜機(jī)將兩種包被液分別劃到硝酸纖維素膜上，將已包被的硝酸纖維素膜干燥后保存；(2)鼠抗人IgM單抗金結(jié)合物墊的制備將標(biāo)記濃度為10-18yg/ml的鼠抗人IgM 單抗與膠體金進(jìn)行偶聯(lián)制得膠體金標(biāo)記鼠抗人IgM單抗溶液，以轉(zhuǎn)速為12000r/min離心 40min,棄上清，加入膠體金結(jié)合物稀釋液至原體積的1/2，然后用混合液浸泡金標(biāo)墊，制備成MP-IgM金結(jié)合物墊，將MP-IgM金結(jié)合物墊放入干燥保存；(3)切割裝配在反應(yīng)膜所在膠板的上部揭去1.5cm寬的不干膠紙，粘貼上粗纖維濾紙，使紙的下部壓住反應(yīng)膜，揭去反應(yīng)膜下部的0. 9cm的不干膠紙，貼上MP-IgM金結(jié)合物墊，并且MP-IgM金結(jié)合物墊的上部壓住反應(yīng)膜1mm，再揭去MP-IgM金結(jié)合物墊下部的的不干膠紙，貼上樣品墊，樣品墊的上部壓住MP-IgM金結(jié)合物墊的下部1mm，制成反應(yīng)板，再用切條機(jī)切成4mm試紙條，進(jìn)行裝卡后，裝入鋁箔袋內(nèi)制成產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺炎支原體IgM抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟(1)和(2)的干燥條件為37°C干燥3小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺炎支原體IgM抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的鼠抗人IgM單抗的標(biāo)記濃度為15μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了肺炎支原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒，包括硝酸纖維素膜檢測線包被的重組抗原MP-Ag、質(zhì)控線上包被的羊抗鼠IgG抗體和金標(biāo)墊上包被的由膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗，所述重組肺炎支原體抗原為無色透明液體，濃度大于2mg/ml，用SDS-PAGE測定；所述羊抗鼠IgG抗體為無色透明液體，濃度大于4mg/ml；所述鼠抗人IgM單抗為無色透明液體，濃度大于2mg/ml，用SDS-PAGE測定，上樣量在10μl條件下為兩條帶。本發(fā)明的有益效果為肺炎支原體IgM抗體膠體金快速檢測試紙條，以多表位的重組抗原為原料，具有操作更加簡便，成本低廉，特異性好，靈敏度高的特點，可單份檢測，易于普及，對于肺炎支原體IgM抗體的檢測和控制效果明顯。
文檔編號G01N33/531GK102305856SQ201110215899
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者李習(xí)榮 申請人:北京中檢安泰診斷科技有限公司