專利名稱：一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的fret效率定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測方法，特別是涉及一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法。
背景技術(shù)：
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是一個(gè)依賴于距離的光物理進(jìn)程，處于激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)通過偶極子間的相互作用將能量以非輻射的方式轉(zhuǎn)移給鄰近的受體分子。FRET效率(E) 是因發(fā)生FRET效應(yīng)而使供體轉(zhuǎn)移給受體的能量百分比，因E與供受體間距離的六次方成反t匕，對(duì)距離的變化非常敏感，測量尺度在納米范圍，F(xiàn)RET技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)問題如蛋白質(zhì)間相互作用和構(gòu)象的變化。目前應(yīng)用最為廣泛的是熒光壽命測量法(FLIM)和敏化受體發(fā)射法(E-FRET)。熒光壽命測量法是目前較為精確的方法，其他E的計(jì)算方法一般都以熒光壽命法作為對(duì)照，然而熒光壽命測量法所用儀器比較貴重，對(duì)激光器和人員技能要求較高，而且測量時(shí)間比較長，容易對(duì)樣品進(jìn)行光漂白。此外，E-FRET方法能夠較為精確的測量E，但受光漂白程度、系統(tǒng)參數(shù)、供體激發(fā)光串?dāng)_和受體發(fā)射光串?dāng)_的影響，不僅需要多個(gè)輔助樣品而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中需保證系統(tǒng)參數(shù)不變。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種操作簡單的、適用于活樣品快速定量檢測的FRET效率定量檢測方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，包括先檢測供體再檢測受體方法或先檢測受體再檢測供體方法的處理步驟，其中先檢測供體再檢測受體方法處理步驟包括A :選用供體激發(fā)光激發(fā)供體受體對(duì)，用供體通道采集供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度，記為
V；B :選用受體激發(fā)光僅激發(fā)受體，用受體通道采集受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度，記為
V；C :利用最大強(qiáng)度的受體激發(fā)光漂白部分受體；D :選用供體激發(fā)光激發(fā)漂白后的供體受體對(duì)，用供體通道采集供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度，記為;E :選用受體激發(fā)光僅激發(fā)漂白后的受體，用受體通道采集受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度，記為F :計(jì)算部分受體光漂白前后供體通道熒光強(qiáng)度的增加量AId/及受體通道熒光強(qiáng)度的減少量AIa/ AIdd'=IZ'-Idd'；
權(quán)利要求
1.一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，其特征在于包括先檢測供體再檢測受體方法或先檢測受體再檢測供體方法的處理步驟，其中先檢測供體再檢測受體方法處理步驟包括 A :選用供體激發(fā)光激發(fā)供體受體對(duì)，用供體通道采集供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度，記為V； B :選用受體激發(fā)光僅激發(fā)受體，用受體通道采集受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度，記為Ia/ ； C :利用最大強(qiáng)度的受體激發(fā)光漂白部分受體； D :選用供體激發(fā)光激發(fā)漂白后的供體受體對(duì)，用供體通道采集供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度，記為 E :選用受體激發(fā)光僅激發(fā)漂白后的受體，用受體通道采集受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度，記為TpOSt' 1AA ， F :計(jì)算部分受體光漂白前后供體通道熒光強(qiáng)度的增加量AId/及受體通道熒光強(qiáng)度的減少量A Ia/
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，其特征在于在擴(kuò)散不可忽略的樣本中，把先檢測供體再檢測受體方法與先檢測受體再檢測供體方法分別測量的E'和E"值取平均值作為FRET效率的測量值E。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，其特征在于激發(fā)光源是激光、汞燈、氙燈、LED中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，其特征在于部分受體光漂白后做時(shí)間序列，步驟C或Cl完成之后，每隔一個(gè)任意時(shí)間間隔，重復(fù)執(zhí)行步驟D或DI、E或EI，得到數(shù)據(jù)，If2或
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，其特征在于重復(fù)執(zhí)行完步驟D或Dl、E或El后，根據(jù)步驟F或Fl所述的公式
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，其特征在于根據(jù)G或Gl所述的公式
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，其涉及一種定量檢測方法，特別是涉及一種基于受體部分光漂白和供體受體交替激發(fā)的FRET效率定量檢測方法，本發(fā)明通過部分光漂白受體，用供體、受體兩種激發(fā)光交替激發(fā)樣品，采集受體部分光漂白前后供體通道和受體通道的熒光強(qiáng)度，即可定量獲得供體-受體對(duì)的FRET效率。該方法直接對(duì)待測樣品進(jìn)行檢測，不需要任何輔助樣品和額外的系統(tǒng)校正與補(bǔ)償，不僅可以定量檢測供體受體濃度比為1:1時(shí)FRET效率,而且還可以有效解決一個(gè)供體與多個(gè)受體存在時(shí)的FRET效率定量檢測。該方法操作簡單，對(duì)樣品光損傷小，可以對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行多次重復(fù)檢測，可應(yīng)用于樣品中供體受體對(duì)FRET效率的快速定量檢測中。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102636465SQ201110329899
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者于懷娜, 陳同生 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)