專利名稱：用于測定生物流體和植物流體的抗氧化力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定生物流體例如唾液、血清、血漿、尿液、汗液、眼淚，和來自植物例如水果和蔬菜的流體，和來源于其的飲料的抗氧化力的方法。所述方法已經(jīng)被證明是在評(píng)價(jià)唾液的抗氧化力時(shí)特別地合適的，評(píng)價(jià)唾液的抗氧化力從分析觀點(diǎn)呈現(xiàn)特別的復(fù)雜性。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施所述方法的試劑盒。
現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)消耗食品、飲料或揮發(fā)性物質(zhì)時(shí)，唾液是第一個(gè)與外部環(huán)境接觸的生物流體。其外觀是澄清的、略微地酸性的粘液漿液性類型的流體，其由主要的腺(腮腺、下頜下腺和舌下腺)的分泌物與齦溝液組合形成。
在24小時(shí)時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生的唾液的量從I至I. 5升變化。在睡眠期間的唾液流量是實(shí)質(zhì)上可忽略的，并且在醒著的時(shí)間在休息時(shí)其是平均O. 3ml/min，而在刺激下其可以達(dá)到高至 7ml/min。唾液流量經(jīng)受許多變化，并且實(shí)際上不僅觀察到晝夜節(jié)律而且觀察到季節(jié)性節(jié)律，其在夏季較低并且在冬季較高。流量還根據(jù)水合狀態(tài)、年齡、性別(女性具有低于男性的基線分泌和被刺激的分泌二者[I])、光強(qiáng)度(在黑暗中具有30-40%的減少[2])和某些習(xí)慣例如吸煙(吸煙根據(jù)局部刺激增加分泌[2])和口香糖使用變化。在休息時(shí)(因此不被食品和/或咀嚼刺激)各種唾液腺對(duì)總分泌的貢獻(xiàn)是20%腮腺、65%下頜下腺和7-8%舌下腺。然而在刺激期間，最主要的分泌清楚地是腮腺并且貢獻(xiàn)分泌的約50%。通常，唾液pH從6至7變化，然而，在減少的流量的條件下，pH被減少至5. 3，而在增加的流量下其上升至7. 8 [I]。作為一般的規(guī)律，腮腺唾液具有淀粉酶、富含脯氨酸的蛋白質(zhì)和凝集素的較高的含量，以及溶菌酶和糖蛋白的少的量。舌下腺和下頜下腺代替地特別地產(chǎn)生粘蛋白(MGl和MG2)和溶菌酶。唾液主要地具有五個(gè)主要的功能，即潤滑和保護(hù)、緩沖和清除、牙齒完整性的保持、抗菌作用以及最終地香味的識(shí)別和消化。明顯地，所有的這些功能不能夠被分離地考慮而是形成一體的體系的一部分[3]，即唾液本身，其中這些功能中的一個(gè)是其抗氧化性作用。后者的功能取決于唾液流量和某些唾液組分的類型二者。對(duì)于不同類型的分泌物，對(duì)水溶性的抗氧化劑的最大的貢獻(xiàn)是來自腮腺，而其他的例如親脂性的抗氧化劑大多數(shù)地來源于下頜下腺和舌下腺?？傮w地，大多數(shù)分泌的抗氧化劑是在本質(zhì)上親水的，而其他的類型貢獻(xiàn)總抗氧化能力的小于10% [5]。因此，在抗氧化劑的方面，唾液分泌物包含各種化合物和酶，其中最重要的是尿酸(UA)和過氧化物酶(POX)，二者都是水溶性的。UA代表唾液抗氧化能力的約70%，而唾液中含有的另一水溶性的抗氧化劑，即抗壞血酸，表現(xiàn)為具有與UA相比的次要的或輔助性的重要性[5]。然而，抗壞血酸的在齦溝液中的濃度表現(xiàn)為達(dá)到血漿中的那些濃度的3倍[6]。在血漿和唾液UA之間具有相關(guān)性，預(yù)檢(prevailing)血衆(zhòng)來源。關(guān)于酶，最重要的是Ρ0Χ。然而，其他的酶也已經(jīng)被分離，例如谷胱甘肽過氧化物酶(glu POx)和超氧化物歧化酶(SOD) [7]。這些后者是支持還原型谷胱甘肽(GSH)的產(chǎn)生、消耗和再生的酶，其是身體中最重要的抗氧化劑體系之一；其在實(shí)際上所有的流體中存在的所有的細(xì)胞中運(yùn)行并且因此也在唾液中運(yùn)行，雖然以有限的量。在重量方面，POX代表總唾液蛋白質(zhì)的僅O. 01%，實(shí)質(zhì)上具有兩種過氧化物酶實(shí)際的唾液過氧化物酶(POX)和髓過氧化物酶。該后者相似于在口腔的發(fā)炎區(qū)域中的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的乳過氧化物酶[8，9]。POX具有雙重的作用a)被細(xì)菌和白細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2水平的控制； b)對(duì)于某些細(xì)菌特異性的抗菌作用。H2O2是強(qiáng)有力的氧化劑(具有穿過任何細(xì)胞膜的能力)并且是在局部和在胃腸系統(tǒng)中都有毒的。實(shí)際上，其能夠根據(jù)以下的反應(yīng)氧化硫氰酸根離子(SCN—，即被唾液腺分泌的氰化物[CNl的解毒產(chǎn)物)SCN^H2O2 — H0SCN+H20次硫氰酸HOSCN和其共軛物0SCN_具有很大的細(xì)胞毒性能力[9]，因?yàn)樗鼈兪蔷哂锌咕饔玫膹?qiáng)有力的氧化劑[10];它們通過氧化細(xì)菌的巰基基團(tuán)抑制細(xì)菌的糖酵解?？傮w上，Ρ0Χ、乳過氧化物酶和H2O2、和SCN_的組合比單獨(dú)的H2O2更強(qiáng)有力[9]，因?yàn)槠淇梢栽谳^寬的pH范圍內(nèi)起作用。實(shí)際上，在酸性的環(huán)境中，被質(zhì)子化的形式HOSCN是更活躍的(成為更親脂性的)，而H2O2是在中性pH更活躍的[10]。不應(yīng)被忽視的是以下事實(shí)，即在H2O2和0SCN_之間的反應(yīng)中，Σ O2(單線態(tài)氧)也被部分地產(chǎn)生，其也具有很大的氧化能力[11]。另一個(gè)涉及H2O2的反應(yīng)是與氯形成HC10(次氯酸)；該反應(yīng)在中性粒細(xì)胞中在髓過氧化物酶的作用下發(fā)生并且是可以抵抗細(xì)菌群的殺菌機(jī)理中的一個(gè)。然而，氧化過程可以是保護(hù)性的或有害的，并且因此必須被控制以最好地利用其保護(hù)性潛力。從上文描述的，得出，唾液的抗氧化力來源于難以被評(píng)價(jià)的各種復(fù)雜的組分。但是，對(duì)它們的組合的活性的綜合分析是在測定唾液防御能力上的重要的指標(biāo)。以下的表格I示出了在休息條件和刺激條件下的顯著的唾液參數(shù)中的某些參數(shù)[7]，以與抗氧化劑保護(hù)相關(guān)。表格I.休息時(shí)的和在刺激之后的唾液流量和與抗氧化力相關(guān)的某些唾液變量的值(平均值土 SD)
權(quán)利要求
1.用于測定生物流體和植物流體的抗氧化力的試劑，包含至少一種無機(jī)鋯鹽和至少一種合適的溶劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑，其中所述無機(jī)鋯鹽選自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、碳酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽和其混合物組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其中所述無機(jī)鋯鹽選自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物和其混合物組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其中所述無機(jī)鋯鹽是ZrCl4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的試劑，其中所述至少一種合適的溶劑是水-醇混合物。
6.用于測定生物流體和植物流體的抗氧化力的方法，包括以下步驟 a)提供硫氰酸根醇溶液； b)加入至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的試劑； c)加入鐵鹽水溶液； d)測量由此獲得的溶液的吸光度； e)加入生物流體或植物流體的樣品； f)測量含有所述樣品的所述溶液的吸光度； g)從在步驟f)的吸光度減去在步驟d)的吸光度；以及 h)將由此獲得的吸光度值在維生素C的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線上作圖，并且根據(jù)朗伯-比爾定律獲得作為維生素C當(dāng)量的檢測的所述流體的抗氧化力的值。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述鐵鹽選自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、碳酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述鐵鹽是硝酸鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中試劑b)的無機(jī)鋯鹽和所述鐵鹽是以20 : I至5 : I的摩爾比率。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物流體或植物流體樣品和在步驟c)之后獲得的溶液是以I : 250至I : 50的體積比率。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物流體或植物流體是唾液、血清、血漿、尿液、眼淚、汗液、來源于水果、蔬菜、食品、白酒、啤酒、飲料、咖啡或茶的流體。
12.一種用于實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法的試劑盒，包括 i)至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的試劑； )至少一種硫氰酸根醇溶液； iii)至少一種鐵鹽水溶液；以及 iv)圖示性活頁，包括用于實(shí)施抗氧化力的測定的說明書。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中所述i)至少一種試劑和所述ii)至少一種硫氰酸根醇溶液是一個(gè)單一的溶液(I)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述圖示性活頁還包括用于收集所述生物流體或植物流體樣品的說明書。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中當(dāng)所述生物流體是唾液時(shí)，用于樣品收集的所述另外的說明書陳述了所述收集在O. 70至I. 50ml/min的唾液流量的條件下進(jìn)行。
全文摘要
描述了用于測定生物流體例如唾液、血清、血漿、尿液、汗液、眼淚，和植物流體例如水果、蔬菜、來源于它們的飲料的抗氧化力的方法。所述方法被證明是在評(píng)價(jià)唾液的抗氧化力時(shí)特別地合適的，評(píng)價(jià)唾液的抗氧化力從分析觀點(diǎn)呈現(xiàn)特別的復(fù)雜性。此外，本發(fā)明涉及具體的用于實(shí)施所述方法的試劑和試劑盒，試劑盒包括所述試劑。試劑含有無機(jī)鋯鹽和至少一種合適的溶劑，例如水-醇混合物，以對(duì)抗由磷酸鹽的存在造成的干擾。
文檔編號(hào)G01N33/84GK102792165SQ201180011001
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月25日
發(fā)明者翁貝托·康納利 申請(qǐng)人:科康國際有限責(zé)任公司