專利名稱：一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori),簡稱HP, 1983年由澳大利亞學(xué)者BarryMarshall和Robin Warren首次從胃粘膜組織分離得到。經(jīng)過各國學(xué)者多年的研究證實，Hp在慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等消化道疾病致病中起重要作用。HP的發(fā)現(xiàn)是胃腸病學(xué)史上一個革命性進(jìn)展,2005年Robin Warren和Barry Marshall因此獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。HP與胃十二指腸疾病的關(guān)系，一直是各國學(xué)者研究的主要課題。大量的流行病學(xué)調(diào)查證實，自然人群中HP感染率相當(dāng)高，HP在全球人群的感染率超過50%，而且隨著年齡的 增加有遞增趨勢，而且感染情況與致病性因地域不同有很大差異，不同國家和地區(qū)分離的HP菌株基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)人群或地區(qū)性差異，因此HP致病差異性已引起人們重視。較多的研究表明HP的致病性主要與菌型差異、感染的年齡及機體的反應(yīng)性、地域性、飲食習(xí)慣等有關(guān)。目前臨床上按照是否表達(dá)致病因子細(xì)胞毒素蛋白(CagA)和空泡毒素蛋白(VacA)將HP分為兩型1型為產(chǎn)細(xì)胞毒素的HP，CagA和VacA均表達(dá)或有任一表達(dá)，其致病力強，易引起胃部疾病型為不產(chǎn)細(xì)胞毒素的HP，CagA和VacA均不表達(dá)，其毒性較弱，感染后一般無明顯臨床癥狀。所以臨床上不能僅限于檢出HP，進(jìn)一步HP分型檢測對臨床消化道疾病的診斷和治療具有重要的參考價值。根據(jù)國際最新的Maastricht-Ill共識意見和我國幽門螺桿菌診治共識意見(2007)，檢測Hp感染的方法有侵入性和非侵入性兩類。侵入性方法依賴胃鏡活檢，包括快速尿素酶試驗(RUT)、胃黏膜直接涂片染色鏡檢、胃黏膜組織切片染色鏡檢(如WS銀染、改良Giemsa染色、甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化染色)、細(xì)菌培養(yǎng)、基因檢測方法、免疫快速尿素酶試驗(IRUT)。而非侵入性檢測方法不依賴內(nèi)鏡檢查，包括13C或14C-尿素呼氣試驗(UBT)、糞便Hp抗原(HpSA)檢測(依檢測抗體可分為單抗和多抗兩類)、血清和分泌物(唾液、尿液等)抗體檢測、基因芯片和蛋白芯片檢測等。由于侵入性方法采樣需借助胃鏡檢查，許多患者不愿接受，因而受限制，難以作為大樣本進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。而非侵入性方法，患者依從性較好，因而有其實際意義。然而以上的檢測方法僅限于檢出是否有HP感染，均不能對HP分型。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中檢測HP僅能檢出是否有HP感染而不能對HP分型進(jìn)行分型的缺陷，提供一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒，包括轉(zhuǎn)印有經(jīng)電泳分離的幽門螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜?；颊吒腥居拈T螺桿菌后血清中會產(chǎn)生相應(yīng)抗體，而且由于所感染的幽門螺桿菌類型不同，因此所產(chǎn)生的抗體類型也不同。本發(fā)明采用免疫印跡法，將待檢樣品與本發(fā)明所述轉(zhuǎn)印有經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的幽門螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜反應(yīng)，待檢樣品中的抗體就會與印跡膜中蛋白抗原結(jié)合，然后經(jīng)過酶聯(lián)免疫反應(yīng)出現(xiàn)顯色區(qū)帶，據(jù)此判斷出待檢樣品中所含HP抗體類型，進(jìn)而對患者所感染的HP進(jìn)行分型。其中，本發(fā)明所述印跡膜的制備方法為取HP全菌體蛋白用樣品緩沖液稀釋，利用SDS-聚丙稀酰胺凝膠梯度不連續(xù)電泳將各種蛋白組分按分子量大小分開，然后利用濕轉(zhuǎn)法將HP全菌體蛋白由凝膠層中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上即得。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還括酶標(biāo)記抗體和酶底物。在本發(fā)明中，所述酶標(biāo)記抗體為酶標(biāo)記的抗人IgG抗體。作為優(yōu)選，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還包括洗滌液、陽性對照、陰性對照、標(biāo)準(zhǔn)帶中的一種或幾種。在本發(fā)明中，所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液。在本發(fā)明中，所述陽性對照為HP細(xì)胞毒素蛋白抗體、HP空泡毒素蛋白抗體和尿素酶抗體的混合溶液。在本發(fā)明中，所述陰性對照為正常人HP抗體陰性血清。在本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)帶為標(biāo)示HP細(xì)胞毒、HP空泡毒和尿素酶蛋白距起始線的相對位置的條帶。從上述的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明所述幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒包括轉(zhuǎn)印有經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的幽門螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜。本發(fā)明采用免疫印跡法檢測幽門螺桿菌感染者血清中包括致病因子細(xì)胞毒(CagA)、空泡毒(VacA)和尿素酶亞單位A和B抗體等多種Hp抗體，依據(jù)HP抗體不同確定感染的HP是否產(chǎn)毒株，進(jìn)而判斷患者所感染Hp菌株血清學(xué)類型，確定感染的HP是否產(chǎn)毒株，進(jìn)而根據(jù)不同類型HP與慢性胃炎，消化性潰瘍和胃癌的關(guān)系，實施對HP更合理的根治方法，對臨床開展HP針對性治療有重要的指導(dǎo)意義。本發(fā)明所述試劑盒僅需要待檢者提供血清，屬于非侵入性檢查，患者依從性較好，而且檢測快速，整個時間僅需2小時，樣品需求量小，僅需10微升被檢血清，特異性強，敏感性高，適用范圍廣，便于在各級醫(yī)院、衛(wèi)生部門推廣使用。


圖I示本發(fā)明所述試劑盒標(biāo)準(zhǔn)帶示意圖；圖2示不同幽門螺桿菌感染型檢測結(jié)果示意圖；其中I號膜為無效實驗，2號膜為陰性對照，3號膜為II型HP感染，4號膜為I型HP感染。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒，包括轉(zhuǎn)印有經(jīng)電泳分離的幽門螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜?；颊吒腥居拈T螺桿菌后血清中會產(chǎn)生相應(yīng)抗體，而且由于所感染的幽門螺桿菌類型不同，因此所產(chǎn)生的抗體類型也不同。本發(fā)明采用免疫印跡法，將待檢樣品與本發(fā)明所述轉(zhuǎn)印有經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的幽門螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜反應(yīng)，待檢樣品中的抗體就會與印跡膜中蛋白抗原結(jié)合，然后經(jīng)過酶聯(lián)免疫反應(yīng)出現(xiàn)顯色區(qū)帶，據(jù)此判斷出待檢樣品中所含HP抗體類型，進(jìn)而對患者所感染的HP進(jìn)行分型。如CagA抗體僅見于I型HP感染，VacA抗體僅見于I型HP感染，UreA抗體I型HP感染和II型HP感染均可出現(xiàn)，UreB抗體I型HP感染和II型HP感染均可出現(xiàn)。因此只要觀察印跡膜上是否存在CagA抗體或 VacA抗體即可對患者所感染的HP進(jìn)行分型。本發(fā)明所述印跡膜是幽門螺桿菌全菌體蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)印到固相支持物上。本發(fā)明所述幽門螺桿菌全菌體蛋白可以為幽門螺桿菌全菌的粗提物，也可以為幽門螺桿菌全菌經(jīng)過一定的分離純化后的全菌蛋白。電泳分離通常是根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，如分子量、分子大小、電荷以及其等電點等采用不同的電泳方法進(jìn)行分離。其中為了提高轉(zhuǎn)移的效率優(yōu)選為SDS-聚丙稀酰胺凝膠梯度不連續(xù)電泳。不連續(xù)電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳。由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品(即使是稀樣品)在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度(或一定濃度梯度)的凝膠上進(jìn)行分離。由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續(xù)電泳的分辨率大大高于連續(xù)電泳。其中，所述樣品緩沖液是一種以溴酚藍(lán)為染料，5倍濃縮的蛋白上樣緩沖液，常用于常規(guī)的SDS-PAGE蛋白樣品的上樣。所述樣品緩沖液具體配置方法可參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》。經(jīng)電泳分離后的蛋白往往需要再利用電泳方法將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體載體上。常用的轉(zhuǎn)移方法有半干轉(zhuǎn)法和濕轉(zhuǎn)法。半干轉(zhuǎn)法是凝膠和固體載體被夾在用緩沖液浸濕的濾紙之間，通電時間為10分鐘 30分鐘。而濕轉(zhuǎn)法是凝膠和固體載體夾心浸放在轉(zhuǎn)移緩沖液中，轉(zhuǎn)移時間可從45分鐘延長到過夜進(jìn)行。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移方法為濕轉(zhuǎn)法。轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的固相支持物可以為硝酸纖維素膜、PVDF膜或尼龍膜。硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Blotting Membranes,NC)是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì),對蛋白有很強的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法。NC膜的使用也很簡便，不需要甲醛預(yù)處理，很容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間。PVDF膜(Polyvinylidene-Fluoride,聚偏二氟乙烯)在蛋白質(zhì)截留能力，機械強度和化學(xué)相容性上都更優(yōu)越的性能，而且PVDF膜更好的機械強度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為理想選擇；而且單個凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的。然而PVDF膜需要100%甲醇預(yù)處理(不超過15秒)再用緩沖液平衡。尼龍膜更多是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見于蛋白印跡。尼龍膜結(jié)合力強，特結(jié)實又柔軟且不易卷曲，機械強度大，便于操作，缺點是背景高、無法直接染色。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述固相支持物為硝酸纖維素膜。
因此在一個具體實施方式
中，所述印跡膜的制備方法為取HP全菌體蛋白用樣品緩沖液稀釋，利用SDS-聚丙稀酰胺凝膠梯度不連續(xù)電泳將各種蛋白組分按分子量大小分開，然后利用濕轉(zhuǎn)法將HP全菌體蛋白由凝膠層中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上即得。在進(jìn)行幽門螺桿菌分型檢測時，將待檢樣品與印跡膜反應(yīng)后，待檢樣品中的抗體就會與印跡膜中蛋白抗原結(jié)合。在本發(fā)明中，所述待檢樣品可以為血清或全血。為了識別待檢樣品中的抗體，需要能夠識別待檢樣品中抗體的第二抗體。該抗體往往是購買的成品，已經(jīng)被結(jié)合或標(biāo)記了特定的試劑，如酶標(biāo)記抗體。酶標(biāo)記抗體是酶與抗體在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。同時為了保證酶促反應(yīng)的發(fā)生還需要標(biāo)記抗體的酶底物，其與第二抗體標(biāo)記的酶反應(yīng)后有特定的顏色且固定在固體支持物上，通過對二抗的識別而識別一抗，進(jìn)而判斷出待檢樣品中的抗體的位置。因此，本發(fā)明所述試劑盒還包括酶標(biāo)記抗體和酶底物。其中，在本發(fā)明中，所述酶標(biāo)記抗體為酶標(biāo)記的抗人IgG抗體。其中，所述酶優(yōu)選 為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。在本發(fā)明中，所述酶底物為標(biāo)記抗人IgG抗體的酶的底物。不同的酶選用不同的底物。如堿性磷酸酶的底物為對硝基苯磷酸二鈉(PNPP-NA2);辣根過氧化物酶的底物為魯米諾或其衍生物，所述魯米諾衍生物包括但不限于異魯米諾、4一氨基已基-N —乙基異魯諾、及N-(6-氨基已基)-N-乙基異魯米諾(AHEI)和N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾(ABEI)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還可以包括洗滌液、陽性對照、陰性對照、標(biāo)準(zhǔn)帶中的一種或幾種。在本發(fā)明中，洗滌液為能夠去掉抗原抗體間非特異性結(jié)合的液體，例如磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液。作為優(yōu)選，所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液。進(jìn)一步的，為了更好的洗滌，所述洗滌液還可以同時還含有吐溫-20，吐溫-20的濃度優(yōu)選為0. 1-1%，更選為0. 5%。在本發(fā)明中，所述陽性對照為HP細(xì)胞毒素蛋白抗體、HP空泡毒素蛋白抗體和尿素酶抗體的混合溶液。在本發(fā)明中，所述陰性對照為正常人HP抗體陰性血清。在本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)帶為標(biāo)示HP細(xì)胞毒、HP空泡毒和尿素酶蛋白距起始線的相對位置的條帶。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)帶可以快速判斷印跡膜上顯色區(qū)帶，據(jù)此判斷出待檢樣品中所含HP抗體類型，進(jìn)而對患者所感染的HP進(jìn)行分型。標(biāo)準(zhǔn)帶的制備方法為根據(jù)幽門螺桿菌全菌體蛋白各陽性區(qū)帶、質(zhì)控帶距起始線的距離用電腦模擬出標(biāo)準(zhǔn)帶，用A6銅版紙彩色打印或印刷即得。如圖I所示。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例I :幽門螺桿菌(HP)印跡膜制備一、HP全菌體蛋白電泳分離I、配置樣品緩沖液用加樣槍吸取0.05M pH7. 4Tris-HCL 10mL，2_巰基乙醇0. 5mL,甘油2mL，0. 1%溴酚藍(lán)0. 5mL, 10%十二烷基硫酸鈉2mL，混合均勻即得。2、將HP全菌體蛋白用樣品緩沖液稀到0. 04±0. 005mg/mL，經(jīng)100°C、3分鐘處理后，置4°C冷卻備用。3、梯度不連續(xù)電泳3. I、制備分離膠量取40%丙烯酰胺4mL、40%甲叉一雙丙烯酰胺0. lmL、pH9. 20. 5MTris-HCL 5mL、Dff 5mL、TEMED (四甲基乙二胺)50 u L、1% 過硫酸銨 5mL、H2O 12. 5mL。3. 2灌膠用量筒量取30±0. 5mL,移液液器吸取ImL正丁醇，加到膠液上面密閉待凝固。3. 3待分離膠凝固后(20±2分鐘)，用純凈水沖去正丁醇加入濃縮膠。3. 4制備濃縮膠量取40%丙烯酰胺lmL、40%甲叉-雙丙烯酰胺0. lmLpH9. 20. 5MTris-HCL 2mL、DW 3mL、TEMED 20 y L、1% 過硫酸銨 0. 5mL 混合均勻。3. 5灌膠用移液器吸取4±0. ImL,吸取ImL正丁醇，加到膠液上面密閉待凝固。3. 6待濃縮膠凝固后(20±2分鐘)，用純凈水沖去正丁醇。3. 7電泳將濃縮膠置入垂直電泳槽，注入電泳緩沖液(pH9. 20. 5MTris_HCL)，用微量移液器加入用樣品緩沖液稀釋的HP抗原樣品液lmL，在4±0. ImA/cm的電流下電泳，時間為180 ±10分鐘。二、HP全菌體蛋白轉(zhuǎn)印I、硝酸纖維膜的處理將硝酸纖維膜放在蒸餾水中浸泡30±5分鐘，然后將硝酸纖維膜放在轉(zhuǎn)印緩沖液(PH8. 40. 2M Tris-甘氨酸)中浸泡，浸泡時間60±5分鐘。2、鋪膜先鋪陽極濾紙3± I層，然后將硝酸纖維膜與濾紙上沿對齊，保證誤差在±2mm，之后鋪分離膠，分離膠與硝酸纖維膜上沿距離5±lmm，最后再鋪陰極濾紙3±1層。3、轉(zhuǎn)印加入轉(zhuǎn)印緩沖液500± IOmL，在500±50mA的電流下，轉(zhuǎn)印60±5分鐘。4、印跡膜制備與貯存專用切膜機切割印跡膜長98±2mm，寬150±5mm，在2-8°C貯存。實施例2 :本發(fā)明所述試劑盒一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒，包括實施例I制得的印跡膜，每張長98 ± 2mm,寬 150 ± 5mm。實施例3 :本發(fā)明所述試劑盒一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒，包括實施例I制得的印跡膜、酶標(biāo)記抗體和酶底物，具體如表I所示。表I幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒
權(quán)利要求
1.一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒，其特征在于，包括轉(zhuǎn)印有經(jīng)電泳分離的幽門螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述試劑盒，其特征在于，所述印跡膜的制備方法為取HP全菌體蛋白用樣品緩沖液稀釋，利用SDS-聚丙稀酰胺凝膠梯度不連續(xù)電泳將各種蛋白組分按分子量大小分開，然后利用濕轉(zhuǎn)法將HP全菌體蛋白由凝膠層中轉(zhuǎn)移到固體支持物上即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述試劑盒，其特征在于，還包括酶標(biāo)記抗體和酶底物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)記抗體為酶標(biāo)記的抗人IgG抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，還包括洗滌液、陽性對照、陰性對照、標(biāo)準(zhǔn)帶中的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為HP細(xì)胞毒素蛋白抗體、HP空泡毒素蛋白抗體和尿素酶抗體的混合溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為正常人HP抗體陰性血清。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)帶為標(biāo)示HP細(xì)胞毒、HP空泡毒和尿素酶蛋白距起始線的相對位置的條帶。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種幽門螺桿菌分型檢測的試劑盒。本發(fā)明所述試劑盒包括轉(zhuǎn)印有經(jīng)電泳分離的幽門螺桿菌全菌體蛋白的印跡膜。本發(fā)明采用免疫印跡法檢測幽門螺桿菌感染者血清中包括致病因子細(xì)胞毒(CagA)、空泡毒(VacA)和尿素酶亞單位A和B抗體等多種Hp抗體，依據(jù)HP抗體不同確定感染的HP是否產(chǎn)毒株，進(jìn)而判斷患者所感染Hp菌株血清學(xué)類型。本發(fā)明所述試劑盒僅需要待檢者提供血清，屬于非侵入性檢查，患者依從性較好，而且檢測快速，整個時間僅需2小時，樣品需求量小，僅需10微升被檢血清，特異性強，敏感性高，適用范圍廣，便于在各級醫(yī)院、衛(wèi)生部門推廣使用。
文檔編號G01N33/569GK102967705SQ20121048656
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者馬偉民, 張永頂, 馬新民 申請人:深圳市伯勞特生物制品有限公司