專利名稱：一種時(shí)間分辨免疫熒光法定量測(cè)定新生兒17α-OHP的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種時(shí)間分辨免疫時(shí)間分辨免疫熒光法定量測(cè)定新生兒17 a-羥孕酮(1-a-hydoxy progesterone, 17 a -0ΗΡ)的試劑盒,特別涉及競(jìng)爭(zhēng)免疫時(shí)間分辨免疫突光法快速檢測(cè)新生兒體內(nèi)17 a-OHP濃度水平的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)新生兒足跟血干血片樣品中的17 a -OHP濃度水平進(jìn)行快速檢測(cè)，從而輔助新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia,CAH)的診斷。
背景技術(shù)：
新生兒篩查是指在新生兒群體中，用快速、敏感的實(shí)驗(yàn)室方法對(duì)新生兒的遺傳代謝病、先天性內(nèi)分 泌異常以及某些危害嚴(yán)重的遺傳性疾病進(jìn)行篩查的總稱，其目的是對(duì)那些患病的新生兒在臨床癥狀尚未表現(xiàn)之前或表現(xiàn)輕微時(shí)通過(guò)篩查，得以早期診斷、早期治療，防止機(jī)體組織器官發(fā)生不可逆的損傷。避免患兒發(fā)生智力低下、嚴(yán)重的疾病或死亡。新生兒篩查一般是在嬰兒出生后三天采取臍血或足跟血的紙片進(jìn)行。先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia, CAH)是一組常染色體隱性遺傳、內(nèi)分泌代謝失調(diào)病，分別由21-羥化酶、Ilb羥化酶、3b類固醇脫氫酶、17a羥化酶等缺陷所造成的，其中21-羥化酶缺乏癥是CAH中最為多見(jiàn)的一種(90% 95% )，其共同特點(diǎn)是皮質(zhì)醇合成障礙，引起促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)分泌增加導(dǎo)致腎上腺增生，出現(xiàn)脫水、失鹽、外生殖器性別不清、生長(zhǎng)加速、皮膚黏膜色素沉著、不同程度的男性化等各種不同臨床表現(xiàn)。但可通過(guò)檢測(cè)新生兒17 a -OHP濃度水平篩查出大部分CAH患兒，并經(jīng)過(guò)及時(shí)及早的治療，病情可以得到有效的控制。17 α -輕孕酮(l-α-hydoxy progesterone,17 α -0ΗΡ)是一種內(nèi)源性孕激素，由腎上腺皮質(zhì)及性腺產(chǎn)生，目前是最常用的篩查CAH的敏感指標(biāo)。CAH發(fā)病率在不同人群中差異很大。有學(xué)者對(duì)無(wú)錫地區(qū)新生兒CAH發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其結(jié)果為1/15321 (4/61284)(吳志君，朱云霞，陳道楨.無(wú)錫地區(qū)新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的發(fā)病情況探討[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14 (10):72)。孫亦駿等亦對(duì)南京地區(qū)新生兒CAH發(fā)病率進(jìn)行過(guò)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的CAH發(fā)病率為1/25000 (2/50000)(孫亦駿，張瑾，張汝帆.新生兒疾病篩查中先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的檢出[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2000，8 (I):74-80)。據(jù)新生兒篩查資料統(tǒng)計(jì)，經(jīng)典型(21-羥化酶缺乏癥)CAH 的發(fā)病率在歐洲為 I: 14000 I: 10000 (Therrell BL Jr, Berenbaum SA,Manter-Kapanke V，et al.Results of screeningl.9million Texas newborns for21-hydroxylase-deficient congenital adrenal hyperplasia[J].Pediatrics.1998Apr ；101 (4Pt I):583-90.)，日本為 I: 15000 (Tajima TiFujieda KiNakae J，et al.Molecularbasis of nonelassical steroid 21-hydroxylase deficiency detected by neonatalmassscreening in Japan[J].J Clin Endocrinol Metab.1997Jul ；82 (7):2350-6.)
近年由于環(huán)境污染、食品衛(wèi)生等問(wèn)題導(dǎo)致該病發(fā)病率呈一定上升趨勢(shì)。我國(guó)是世界上人口最多的國(guó)家，進(jìn)行新生兒篩查的人群基數(shù)很大，開發(fā)本項(xiàng)目具有較大的市場(chǎng)前景。目前常用的新生兒血片篩查主要是雷勃公司(Ani Labsystems)的新生兒17 a-OHP檢測(cè)試劑盒(熒光酶免疫分析法)，但酶標(biāo)記物不穩(wěn)定、反應(yīng)本底較高，另外實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，約需18-20小時(shí)，且價(jià)格昂貴，購(gòu)買周期長(zhǎng)，不利于大規(guī)模的新生兒篩查工作的進(jìn)行。本發(fā)明人利用時(shí)間分辨免疫時(shí)間分辨免疫突光法(Time-resolved fluorescenceimmunoassay, TRFIA)技術(shù)發(fā)明一種定量測(cè)定新生兒17 a -OHP的試劑盒,應(yīng)用于新生兒體內(nèi)17 a-OHP含量的檢測(cè)，輔助新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(CAH)的診斷。TRFIA具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、示蹤物穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、多標(biāo)記、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，靈敏度超過(guò)放射免疫(RIA)2 3個(gè)數(shù)量級(jí)?，F(xiàn)已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)最有發(fā)展前景的分析手段。有利于疾病篩查工作的大規(guī)模順利開展。本發(fā)明的試劑盒作為國(guó)內(nèi)首個(gè)新生兒17 a-OHP定量測(cè)定的試劑盒，選用新生兒足跟血濾紙干血片為檢測(cè)樣本,并利用時(shí)間分辨免疫熒光法,其性能已達(dá)到并超過(guò)對(duì)照同類雷勃公司(Ani Labsystems)和PE公司的進(jìn)口新生兒篩查17 a -OHP定量測(cè)定試劑盒，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便及成本低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用時(shí)間分辨免疫熒光分析技術(shù)進(jìn)行新生兒17 a -OHP定量測(cè)定的試劑盒。時(shí)間分辨免疫熒光法(TRFIA)定量測(cè)定17 a -OHP (17 a -hydoxy progesterone)試劑盒是應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)免疫時(shí)間分辨免疫熒光法，采用羊抗兔IgG的多克隆抗體包被反應(yīng)板，捕獲定量加入的抗17 a -OHP的抗體，檢測(cè)時(shí)加入?yún)⒖紭?biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品和17 a -OHP-BSA-Eu，標(biāo)本中的17 a -OHP和17 a -OHP-BSA-Eu競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合被羊抗兔IgG捕獲的抗17 a -OHP抗體，形成二抗-抗17 a -OHP-17 a -0HP-BSA-DTTA-Eu復(fù)合物。當(dāng)銪在增強(qiáng)液中從復(fù)合物上解離后發(fā)出強(qiáng)的熒光，熒光強(qiáng)度與樣品中的17 a -OHP濃度成反比。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，從而`對(duì)新生兒體內(nèi)17 a-OHP含量進(jìn)行定量測(cè)定。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案:I)根據(jù)和對(duì)照同類進(jìn)口試劑盒進(jìn)行臨床測(cè)值比較:為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，需要對(duì)試劑盒所使用的原料進(jìn)行篩選，從而確定最佳的原料，這一篩選過(guò)程包括校準(zhǔn)品配制原料純度、校準(zhǔn)品配制基質(zhì)、抗體的稀釋比例、銪標(biāo)記物的稀釋比例以及包被反應(yīng)板的本底及變異大小等。2)確定試劑盒的組分及配方，包括:分析緩沖液配方等，并公開了濃縮洗液配方。本發(fā)明提供的一種時(shí)間分辨免疫熒光法定量測(cè)定新生兒17 a -OHP試劑盒，包括:I)校準(zhǔn)品濾紙干血片2)質(zhì)控品濾紙干血片3)抗體4)銪標(biāo)記物5)分析緩沖液6)濃縮洗液
7)包被反應(yīng)板，和分隔并集中包裝這些試劑瓶、板、片的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，校準(zhǔn)品濾紙干血片和質(zhì)控品濾紙干血片由17 a -OHP溶解在校準(zhǔn)品和質(zhì)控品基質(zhì)中，并滴在市售濾紙上。校準(zhǔn)品和質(zhì)控品濾紙干血片根據(jù)17 a-OHP濃度不同分別編號(hào)A-F和Cl、C2、C3，其中17 a-OHP可使用市售產(chǎn)品，市售濾紙優(yōu)選Whatman903#濾紙。編號(hào)A-F的校準(zhǔn)品濾紙干血片和C1-C3的質(zhì)控品干血片加入17 a -OHP如表I所示:
權(quán)利要求
1.一種時(shí)間分辨免疫突光法定量測(cè)定新生兒17 α -輕孕酮(1- a -hydoxyprogesterone, 17 a -OHP,)的試劑盒,試劑盒包括:分別裝有分析緩沖液、抗體、銪標(biāo)記物、濃縮洗液、增強(qiáng)液等多個(gè)試劑瓶，96孔包被反應(yīng)板、校準(zhǔn)品濾紙干血片、質(zhì)控品濾紙干血片，和分隔并集中包裝這些試劑瓶、板、片的包裝盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于分析緩沖液由Tris-HCl(50mmol/L),NaCl (0.9% ), BSA (0.1% )與 Danazol (I μ g/ml)，pH 7.8 組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于抗體為兔抗-17a -OHP,為液態(tài)，分析緩沖液的主要組分為 Tris-HCl (50mmol/L)，NaCl (0.9% ), BSA(0.1% )與 Danazol (I μ g/ml)，pH 7.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于銪標(biāo)記物由17a -OHP-BSA-Eu組成，為液態(tài),稀釋比例為 I: 1000，稀釋液組分為:Tris-HCl(50mmol/L)、Procline-300 (0.05% )與BSA(0.02% )，pH = 7.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于濃縮洗液25X為Tris-base(7.5% )，NaCl (21% ), Tween-20 (1.5% )，pH = 7.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于校準(zhǔn)品濾紙干血片制備方法為:脫纖維綿羊全血，使用無(wú)菌生理鹽水洗滌5-6次后調(diào)整紅細(xì)胞壓積至0.55，加入17 a -OHP原料，配制不同濃度的校準(zhǔn)品，60 μ I/滴滴到Whatman903#濾紙上，濾紙平放室溫自然晾干，2_8°C保存，各點(diǎn)校準(zhǔn)品濃度如下:
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于質(zhì)控品濾紙干血片制備方法為:脫纖維綿羊全血，使用無(wú)菌生理鹽水洗滌5-6次后調(diào)整紅細(xì)胞壓積至0.55，加入17 a -OHP原料，配制不同濃度的質(zhì)控品，60 μ I/滴滴到Whatman903#濾紙上，濾紙平放室溫自然晾干，2_8°C保存，各點(diǎn)質(zhì)控品濃度如下:
8.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于采用樣本類型為新生兒足跟血濾紙干血片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種時(shí)間分辨免疫熒光分析法定量測(cè)定新生兒17α-羥孕酮(1-α-hydoxyprogesterone，17α-OHP)的試劑盒，特別涉及競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨免疫熒光分析法快速檢測(cè)新生兒體內(nèi)17α-OHP濃度水平的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)新生兒足跟血干血片樣品中的17α-OHP濃度水平進(jìn)行快速檢測(cè)，從而輔助新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia，CAH)的診斷。
文檔編號(hào)G01N33/74GK103235143SQ201210589808
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者吳英松, 李明, 鄧傳歡, 董志寧, 江劍輝, 何蘊(yùn)韶 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司