專利名稱：檢測氯霉素的試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測氯霉素的試劑盒，特別是檢測動物源性食品中氯霉素的試劑盒。
背景技術：
氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是一種高效廣譜抗生素,能夠抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，廣泛應用于各類家禽、家畜、水產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的傳染性疾病控制。但氯霉素在食品中的殘留會對人體健康構成潛在危害，能引起人的骨髓造血機能紊亂，造成再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥及新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病。動物源性食品中氯霉素殘留對人類健康構成潛在的危害已越來越被人們所認識，美國僅允許氯霉素用于非食用動物，規(guī)定在動物源性食品中不得檢出氯霉素；歐盟不允許氯霉素用于產(chǎn)奶母牛和產(chǎn)蛋雞，在其他動物的使用上也有限制，并嚴格規(guī)定肉中的氯霉素殘留量不得超過10μ g/kg ；我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文件也規(guī)定，氯霉素及其鹽、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品動物的所有可食組織中不得檢出。但由于氯霉素的抑菌效果好、價格低，仍有人將其用于家禽、畜類、水產(chǎn)品中。為了保障人民的身體健康以及擴大食品的貿(mào)易往來，建立靈敏度高、特異性強、快速、經(jīng)濟的氯霉素殘留檢測方法是很有必要的。目前，用來檢測氯霉素的最常用方法主要有微生物法、理化分析法及免疫分析法三大類。微生物法操作簡便、樣品用量少、檢測成本低，但易受組織中其它抗生素的影響，特異性低，靈敏度也不高；理化分析法包括液相色譜法、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術、氣相色譜法等，是目前檢測氯霉素的主要方法，具有靈敏度高、結果準確、重復性好、假陽性少等優(yōu)點，但其存在檢測成本高、所需設備復雜、對檢測人員的要求較高、檢測耗時長等缺點；目前常用的免疫分析法主要為酶聯(lián)免疫檢測法和放射免疫分析法，但需要的檢測費用還是較高，不適合企業(yè)低成本的檢測需要。因此，在實踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡單、成本低、檢測藥物種類多、適合大規(guī)模推廣的檢測方法。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種靈敏度高、成本低、操作簡單、檢測時間短的檢測氯
霉素的試劑盒。本實用新型的試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶包括微孔試劑條和8個試紙條，微孔試劑條有8個反應孔，反應孔上具有微孔塞，其中凍干有氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物。試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成，所述反應膜上具有包被有氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線印跡“ I ”。檢測線和質(zhì)控線平行，檢測線位于距離樣品吸收墊一側(cè)5-8mm處，質(zhì)控線位于距離檢測線4-7mm處，試紙條上貼有保護膜，保護膜覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測端，上面印有MAX標記線。[0006]本實用新型試劑盒中的試紙條底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；吸水墊為吸水紙；反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；保護膜為PE材質(zhì)保護膜；試劑盒盒體為硬紙盒；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質(zhì)支撐材料。本實用新型試劑盒具有如下有益效果I、靈敏度聞。氣霉素檢測試劑盒以I父體金標記聞未和力的單克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。其中的氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑條中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應，從而減少誤差，增加整個體系的反應靈敏度。因此，本實用新型試劑盒具有較高的特異性和靈敏度。本試劑盒對氯霉素的檢測靈敏度為O. I μ g/L。2、操作簡便快速。使用試劑盒檢測時無需任何其它試劑，只要將待檢樣品溶液滴加于微孔試劑中，混勻后，室溫(20-250C )孵育5min，將試紙標有MAX標記線的一端向下，插入鮮育后的微孔試劑后計時，IOmin后觀察結果。3、顯示檢測結果形象、直觀、準確。檢測試紙條以顯示紅色線“ I ”及“ Il ”印跡作為陽性和陰性標記，即在硝酸纖維素膜上顯示一條紅線“ I ”印跡表示被檢測樣本液中氯霉素的含量高于等于試劑盒對氯霉素的最低檢測限，兩條紅線“ Il ”印跡表示被檢測樣本中氯霉素的含量低于試劑盒對氯霉素的最低檢測限，結果判定形象、直觀、準確、簡單明了，不容易出現(xiàn)結果誤判。4、成本低，投資少。使用本實用新型試劑盒，不需另配儀器設備及其它試劑，使現(xiàn)場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。5、易于大范圍推廣應用。試劑盒操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要，如專業(yè)化驗、海關檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、食品企業(yè)等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。

圖I為本實用新型試紙條結構示意圖；圖2為本實用新型試紙條俯視圖；圖3為本實用新型微孔試劑圖；圖4為本實用新型試紙條檢測結果判定圖；圖5為本實用新型試劑桶結構示意圖；圖6為本實用新型固定用具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定用具的側(cè)視圖。
具體實施方式
一、氯霉素檢測試劑盒的組裝制備(I)試紙條樣品吸收墊I、反應膜2、吸水墊3和保護膜7依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊的末端與反應膜的始端相連，反應膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，試紙粘貼有保護膜，保護膜7覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測端，上面印有MAX標記線，檢測線4包被有氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線5包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護膜為PE材質(zhì)保護膜。(2)微孔試劑條微孔試劑條8具有膠塞9，板孔中凍干有氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物。(3)將(I)試紙條和(2)微孔試劑條裝入具有密封蓋的塑料試劑桶10，將塑料試劑桶放置于試劑盒盒體12內(nèi)的固定用具11中。二、試劑盒的使用(I)樣品前處理動物組織(豬肉、雞肉、魚、蝦)樣本稱取5g±0. 05g均質(zhì)過的組織樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩5min，3000g以上室溫(20_25°C )離心5min ;移取全部上層有機相至IOml干凈的玻璃試管中，于5(T60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動lmin，再加Iml O. 02mol/L PBS緩沖液，用渦旋儀渦動30s，3000g以上室溫(20-25°C)離心5min ;除去上層有機相，取下層無機相用于分析。牛奶樣本稱取4. Oml ±0. 05ml牛奶至50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯，2ml乙腈，上下振蕩5min，3000g以上室溫(20-25°C)離心5min ;移取6ml上層有機相至IOml干燥玻璃試管中，于5(T60°C水浴氮氣流下吹干，加入O. 5ml O. 02mol/L PBS緩沖液，渦動Imin溶解干燥的殘留物，待檢。蜂蜜樣本稱取4. 0g±0. 05g蜂蜜至50ml離心管中，加入4ml去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；加入4ml乙酸乙酯，4ml乙腈，上下振蕩5min，3000g以上室溫(20-25°C)離心5min ;移取6ml上層有機相至IOml干燥玻璃試管中，于5(T60°C水浴氮氣流下吹干，加入0.5ml O. 02mol/L PBS緩沖液，渦動Imin溶解干燥的殘留物，待檢。(2)用試劑盒檢測滴加待檢樣品溶液200μ I到微孔試劑中，混勻后，室溫(20_25°C)孵育5min，將試紙標有MAX標記線的一端向下，插入孵育后的微孔試劑后計時，IOmin后觀察結果。三、檢測結果分析氯霉素在樣本中的含量高于或等于試劑盒對其的最低檢測限時，氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物與氯霉素結合，金標抗體上的抗原結合位點被封閉，從而在檢測區(qū)內(nèi)因為競爭反應，不會與氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣本在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶。如圖4所示。陽性當質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，而檢測線(T)不顯色，試紙條以顯示紅色線“I”，判為陽性，如圖4. a圖所示。陰性當質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，檢測線(T)同時也顯示出一條紅色條帶，試紙條以顯示紅色線“ Il ”，判為陰性，如圖4. b所示。無效當質(zhì)控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙條均判為無效，如圖4. c、4. d所示。[0039]四、檢測試劑盒中用到的材料制備方法I、氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定氯霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。( I)氯霉素半抗原合成a.取I. Og氯霉素加30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加咪唑O. 44g、叔丁基二甲基氯硅烷O. 37g，室溫攪拌3h，加水乙酸乙酯萃取分離，有機相水洗，蒸干，上硅膠柱，石油醚乙酸乙酯=5:1洗脫，得到產(chǎn)物I. 20g;b. 1.2g洗脫產(chǎn)物用吡啶30ml溶解，加琥珀酸酐0.65g，70°C加熱攪拌12h。反應停止后，蒸干溶劑，石油醚乙酸乙酯=3:1洗脫，得到產(chǎn)物I. 33g ；c. I. 3g洗脫產(chǎn)物加甲醇溶解，加對甲苯磺酸O. 2g，室溫攪拌3h，加水乙酸乙酯萃取分離，蒸干，上硅膠柱。石油醚乙酸乙酯=1:1洗脫，得到氯霉素半抗原產(chǎn)物O. 46g。(2)免疫原的制備——氯霉素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成取20mg半抗原，溶解于I. 5ml DMF中，得溶液I ;取50mg碳化二亞胺(EDC)用
0.2ml水充分溶解后于加入I中，室溫下攪拌24h，得溶液II ;稱取牛血清白蛋白(BSA)60mg，使之充分溶解在4. 3ml PBS (pH 7. 2)中，將溶液II逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，用O. 01mol/L PBS 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質(zhì)；分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?3)包被原的制備——氯霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物合成取15mg半抗原,溶解于I. 5ml DMF中，得溶液I ;取36mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和18mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)用O. 2ml DMF充分溶解后于加入I中，室溫下攪拌24 h，得溶液II ;稱取卵清蛋白(0VA)45mg，使之充分溶解在4. 3ml PBS (pH 7. 2)中，將溶液II逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用O. O ImoI/L PBS 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?4)氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白、氯霉素半抗原、氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7. 4的PBS配成
O.5mg/ml的溶液，以O. 01mol/L ρΗ7· 4 PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長200_800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、氯霉素半抗原、氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明氯霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。2、氯霉素單克隆抗體的制備( I)動物免疫將步驟I得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)生
抗血清。(2)細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按8:1 (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌氯霉素單克隆抗體的氯霉素單克隆雜交瘤細胞株。(3)細胞凍存和復蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。[0059](4)單克隆抗體的制備與純化增量培養(yǎng)法將雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。所述細胞培養(yǎng)基為向RPMI1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為
O.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細胞培養(yǎng)基的pH為7. 4。3、羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物的制備(I)膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸(購于sigma公司，產(chǎn)品目錄號T09041)稀釋成O. 01%(質(zhì)量百分含量)，取IOOml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2. 5ml 1%檸檬酸三鈉(購于廣州化學試劑廠，產(chǎn)品目錄號BG11-AR-01KG)，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。(2)氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物的制備在磁力攪拌下,用O. 2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH至7. 2,按每毫升膠體金溶液中加入5(Γ 00μ g的標準向膠體金溶液中加入上述氯霉素單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置IOmin后，加入10%牛血清白蛋白(BSA)使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000r/min, 4°C離心40min，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。復溶緩沖液含牛血清白蛋白O. 19Γ0. 3% (體積百分含量)、吐溫-80 O. 059Γ0. 2%(質(zhì)量百分含量)、ΡΗ7. 2的O. 02mol/L磷酸鹽緩沖液。5、將氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物凍干到微孔試劑上向微孔試劑微孔板中加入100 μ I氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度-50°C條件下，預凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑，密封保存。6、樣品吸收墊的準備將樣品吸收墊置于含O. 5%牛血清白蛋白(體積百分含量)、pH7. 2,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37°C烘2h備用。7、反應膜的制備包被過程用磷酸緩沖液將氯霉素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/ml，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(T)，包被量為l.Oyg/cm2;用
O.01mol/L、pH7· 4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200 μ g/ml，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線(C)，包被量為l.Oyg/cm2。將包被好的反應膜置于37°C條件下干燥2h，備用。
權利要求1.一種檢測氯霉素的試劑盒，其特征在于試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和8個試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述反應膜上具有包被有氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線印跡“ I ”。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述檢測線和質(zhì)控線平行，均呈與試紙條的長相垂直的條帶狀。
4.如權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于所述檢測線位于距離樣品吸收墊一側(cè)5-8mm處，所述質(zhì)控線位于距離檢測線4_7mm處。
5.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試紙條上貼有保護膜，保護膜覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測端，上面印有MAX標記線。
6.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述底板可為PVC底板，樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙，吸水墊為吸水紙，反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，保護膜為PE材質(zhì)保護膜。
7.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述微孔試劑條有8個反應孔，反應孔上具有微孔塞。
8.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述微孔試劑中凍干有氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物。
9.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒盒體為硬紙盒，試劑桶為塑料試劑桶，固定用具是硬質(zhì)支撐材料。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測氯霉素的試劑盒，試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成，氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑中。反應膜上具有包被有氯霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“|”和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線印跡“|”。本實用新型試劑盒具有便攜性好、靈敏度高、檢測時間短等特點，可以在氯霉素殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/558GK202735343SQ201220227859
公開日2013年2月13日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權日2012年5月18日
發(fā)明者何方洋, 萬宇平, 羅曉琴, 陶光燦, 吳鵬, 馮靜, 趙正苗, 汪善良, 崔廷婷, 陳煒玲 申請人:北京勤邦生物技術有限公司