專利名稱：化妝品中氯霉素的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化妝品檢測領(lǐng)域，涉及化妝品中氯霉素的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
氯霉素是一種高效廣譜抗生素，能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的形成，同時對人類具有毒害作用，它對骨髓造血機能有抑制作用，可引起粒細(xì)胞缺乏病、再生障礙性貧血和溶血性貧血，對人產(chǎn)生致死效應(yīng)。氯霉素化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，在動物體內(nèi)易于殘留，從而對動物和人造成直接危害，更嚴(yán)重的是一定濃度的藥物殘留會誘發(fā)致病菌的耐藥性。此外，長期微量攝入氯霉素不僅使大腸桿菌、沙門氏菌等產(chǎn)生耐藥性，而且會引起機體正常菌群失調(diào)，使人們易感染各種疾病，如再生障礙性貧血癥和原嬰綜合癥可引起粒細(xì)胞及血小板減少，新生兒、 早產(chǎn)兒灰色綜合癥等。我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》、歐盟化妝品規(guī)程(Coucil DirectiVe76/768/EEC)規(guī)定抗生素類物質(zhì)禁止在化妝品中使用。對化妝品中氯霉素的檢測，國家雖然加大了監(jiān)督力度，但現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重落后于監(jiān)管需要，需要研發(fā)與實際監(jiān)管需求相結(jié)合的快速篩查檢測方法以彌補質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的空白和滯后，滿足基層打假和監(jiān)管的需求。目前，在氯霉素檢測中應(yīng)用的主要有微生物法、液相色譜法、氣相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、放射性免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)等。微生物法簡單、費用低，可用于大量樣品的篩選，但靈敏度低、特異性差，一般抗生素類藥物都有此類反應(yīng)；酶聯(lián)免疫法是目前使用較普遍的方法，該法操作簡便、靈敏度高、 特異性強、樣品預(yù)處理簡單，可以批量檢測，分析成本低，是目前最理想的殘留篩選分析方法之一。酶聯(lián)免疫法的缺點在于影響因素較多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，抗體批次不同，測定結(jié)果也會出現(xiàn)差異等。氣相色譜法的特點是分離效能高，選擇性強，靈敏度高，檢出限低，常用于抗生素藥物殘留的檢測，但一般需要進行衍生化。高效液相色譜法是一種靈敏度較高、可靠性較強的一種方法，此法重復(fù)性好、假陽性少，可以進行定量鑒定，但檢出限較高。目前， 免疫膠體金技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為一項重要的免疫標(biāo)記技術(shù)，其是將膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原一抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個重要發(fā)展方向，是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)。氯霉素膠體金試紙條目前有報道，一般直接將待測樣品加于試紙條檢測，但樣品前處理方式較為復(fù)雜，需要配備50ml的離心管，樣品提取液需要用離心機4000rpm離心，離心后上清液還需要電吹風(fēng)或者在65°C下氮氣吹干。實驗所需50ml離心管、離心機、電吹風(fēng)或氮氣等不利于裝配成小巧便攜的試劑盒用于現(xiàn)場快速檢測，且傳統(tǒng)膠體金方法整個檢測過程需要30分鐘左右，而本發(fā)明因前處理方法簡單快捷可裝配成一個小巧便攜的試劑盒用于現(xiàn)場快速檢測
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供化妝品中氯霉素的快速檢測方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
化妝品中氯霉素的快速檢測方法，包括如下步驟
1)將待檢樣品加入含有提取液的提取管中，振搖，靜置分層；
2)取提取管的底層溶液，加入含有緩沖液的樣品檢測管中，混勻；
3)吸取樣品檢測管中的溶液，滴加于氯霉素膠體金試紙條的加樣孔中；
4)加樣后開始計時，3 IOmin后即可根據(jù)膠體金試紙條的檢測線(T)和控制線(C) 顯色深淺對比，判斷待檢樣品為陽性或者陰性。優(yōu)選的，步驟1)提取液含有乙醇，正己烷。優(yōu)選的，步驟2)底層溶液與緩沖液的體積比為1 :4 12。優(yōu)選的，緩沖液為0.01M PBS。優(yōu)選的，待檢樣品的質(zhì)量、乙醇的體積和正己烷的體積比為1 :4 8 :8 16。優(yōu)選的，乙醇的體積濃度為70%。優(yōu)選的，氯霉素膠體金試紙條的制備方法，包括以下步驟
1)制備膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體，將其包被在膠體金結(jié)合墊上；
2)制備氯霉素與BSA的偶聯(lián)物，將其及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，干燥；
3)氯霉素膠體金試紙條組裝氯霉素膠體金試紙條由PVC模板和PVC背板組成，在PVC 背板上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明使用乙醇可將氯霉素從化妝品中充分提取出，同時加入正己烷除去化妝品基質(zhì)中的脂溶性物質(zhì)，沉淀蛋白，增加膜的流動性，提取效率高，檢測靈敏度提高，排除了干擾因
ο本發(fā)明操作步驟簡單，所需樣品量少，僅需提取、稀釋兩步即可完成樣品前處理， 而且樣品提取液和稀釋液均已預(yù)先置于提取管中，現(xiàn)場可直接將化妝品加入提取管，5 10分鐘即可完成樣品的快速檢測。本發(fā)明的氯霉素快速檢測方法，專屬性強、靈敏度高，準(zhǔn)確度高，不需要專門設(shè)備， 避免了使用毒性較大或強腐蝕性的試劑，適合于現(xiàn)場操作，操作人員沒有專業(yè)知識也可快速掌握，非常適合監(jiān)督執(zhí)法部門日常監(jiān)督中使用，能夠滿足基層的監(jiān)督檢驗需求。


圖1是氯霉素膠體金試紙條操作示意圖； 圖2是氯霉素膠體金試紙條結(jié)果判定圖3是陰性樣品與氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果對比圖； 圖4是陰性樣品和陽性樣品檢測結(jié)果對比圖。
具體實施例方式為便于對本發(fā)明進一步理解，現(xiàn)結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)描述。氯霉素膠體金試紙條的制備1.制備膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體
膠體金顆粒的大小平均為30nm，在IOOml去離子水中加入1%檸檬酸三鈉1ml，煮沸后迅速加入1%氯金酸1ml，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，得膠體金溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩Ｈ∫阎苽浜玫哪z體金溶液1001111，用0.111101/1碳酸鉀溶液調(diào)？!1到8.0。邊攪拌邊加入抗氯霉素單克隆抗體1. 5mg,攪拌20min，再逐滴加入^iil 25mg/ml聚乙二醇 20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20000r/min 離心 15min，棄上清液，加入 10mlpH7. 4 PBS 緩沖液(含0. 4mg/mlPEG)清洗2次。將沉淀用5ml含2%BSA的PBS緩沖液(ρΗ7· 4)溶解，用 0. 2 μ m無菌過濾器過濾后，得膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體，4°C保存?zhèn)溆谩?.制備氯霉素與BSA的偶聯(lián)物
先將20mg氯霉素琥珀酸鹽、15mgEDC及30mgBSA混合溶于ImlTris緩沖液中，O 4°C 下避光攪拌lh，再加入5mgEDC，在0°C下攪拌反應(yīng)12h，靜置過夜后，用Tris緩沖液透析3d， 得氯霉素與BSA的偶聯(lián)物。3.包被抗體及偶聯(lián)物
用BioJetXYBOOO型點膜儀將氯霉素與BSA的偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜 (NC膜)上，分別作為檢測線(T)和控制線(C)，在37°C烘箱干燥他。以同樣方法，將制備好的膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。4.氯霉素膠體金試紙條組裝
氯霉素膠體金試紙條由一個PVC背板和一個PVC模板組成。在PVC背板上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，各部分間有1 2mm的重疊。硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次噴有檢測線、控制線。用帶MARK膠帶繞背板覆蓋在樣品墊、 膠體金結(jié)合墊及吸水墊上。用切割機將貼好的板切割成3mm寬的條。PVC模板包括加樣孔 (S)、檢測區(qū)、控制區(qū)，其蓋于PVC背板上，加樣孔(S)對應(yīng)于樣品墊，檢測區(qū)能顯示硝酸纖維素膜的檢測線(T)，控制區(qū)能顯示控制線(C)。將制成的試紙條放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。化妝品中氯霉素的快速檢測方法，包括如下步驟
1)將待檢樣品加入含有提取液的提取管中，振搖，靜置分層；
2)取提取管的底層溶液，加入含有緩沖液的樣品檢測管中，混勻；
3)吸取樣品檢測管中的溶液，滴加于氯霉素膠體金試紙條的加樣孔中，如圖1所示；
4)加樣后開始計時，3 IOmin后即可根據(jù)膠體金試紙條的檢測線(T)和控制線(C) 顯色深淺對比，判斷待檢樣品為陽性或者陰性。優(yōu)選的，步驟1)提取液含有乙醇，正己烷。優(yōu)選的，步驟2)底層溶液與緩沖液的體積比為1 :4 12。優(yōu)選的，乙醇的體積濃度為70%。優(yōu)選的，緩沖液為O. OlM PBS0優(yōu)選的，待檢樣品的質(zhì)量、乙醇的體積和正己烷的體積比為1 :4 8 :8 16。上述化妝品中氯霉素的快速檢測方法的結(jié)果分析
1)陰性(-):τ線(測試線，靠近加樣孔)比C線(對照線)深或一樣深，表示樣品中氯霉素濃度低于檢出限，或不含氯霉素；
2)陽性(+) :Τ線比C線淺，或T線無顯色，則表示樣品中氯霉素濃度高于檢出限；T線
5比C線越淺表示樣品中氯霉素濃度越高；
3)無效未出現(xiàn)質(zhì)控C線，表明操作過程不正確或檢測卡已失效。可參照圖2進行結(jié)果判定。實施例1
提取管中的提取液為70% (體積)乙醇:3ml，正己烷6ml ； 樣品檢測管的緩沖液為0. OlM PBS緩沖液細(xì)1 ； 化妝品中氯霉素的快速檢測方法，包括如下步驟
1)取0.5g待檢化妝品，加入提取管中，充分振搖30秒，靜置aiiin使分層，分層后的底層溶液為提取溶液；
2)取提取溶液0.5ml，加入樣品檢測管中，混合均勻，得待檢樣品溶液；
3)用滴管吸取待檢樣品溶液，垂直滴加3滴于上述氯霉素膠體金試紙條的加樣孔(S)
中；
4)加樣后開始計時，3 IOmin后即可根據(jù)膠體金試紙條的檢測線(T)和控制線(C) 顯色深淺對比，判斷待檢樣品為陽性或者陰性。實施例2
提取管中的提取液為70% (體積)乙醇anl，正己烷細(xì)1 ； 樣品檢測管的緩沖液為0. OlM PBS緩沖液2ml ； 化妝品中氯霉素的快速檢測方法，步驟同實施例1。實施例3
提取管中的提取液為70% (體積)乙醇細(xì)1，正己烷8ml ； 樣品檢測管的緩沖液為0. OlM PBS緩沖液6ml ； 化妝品中氯霉素的快速檢測方法，步驟同實施例1。用實施例1的方法檢測兩種濃度的樣品1)陰性樣品無氯霉素的化妝品；2)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品氯霉素濃度為8ng/ml的化妝品。檢測結(jié)果如圖3所示，左邊的氯霉素膠體金試紙條檢測的是陰性樣品，右邊的氯霉素膠體金試紙條檢測的是氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，如圖可知， 左邊結(jié)果顯示為陰性，右邊顯示為陽性，結(jié)果一致，可見本發(fā)明的檢測方法能檢測到8ng/ml 的氯霉素。用實施例1的方法檢測兩種濃度的樣品1)陰性樣品無氯霉素的化妝品；2)陽性樣品在1)陰性樣品中添加氯霉素至濃度為lOOng/g。檢測結(jié)果如圖4所示，左邊的氯霉素膠體金試紙條檢測的是陰性樣品，右邊的氯霉素膠體金試紙條檢測的是陽性樣品，如圖可知，左邊結(jié)果顯示為陰性，右邊顯示為陽性，結(jié)果一致。可見，本發(fā)明方法快速準(zhǔn)確。用實施例1的方法分別檢測濃度均為100 μ g/ml的β -內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等藥物，結(jié)果均顯示陰性，可見，待測物氯霉素與類似物無交叉反應(yīng)，本發(fā)明方法具有較高的靈敏度及特異性。2011年，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法共檢測了 150批從市場上隨機抽檢的化妝品，確證13批為陽性樣品，再用上述氯霉素膠體金試紙條對這150批化妝品樣品全部進行檢測，結(jié)果如表1所示，由表1可知，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)假陽性樣品和假陰性樣品，試紙條檢測正確率為100%，誤檢率為0，漏檢率為0，靈敏度和特異度均為100%。
權(quán)利要求
1.化妝品中氯霉素的快速檢測方法，包括如下步驟1)將待檢樣品加入含有提取液的提取管中，振搖，靜置分層；2)取提取管的底層溶液，加入含有緩沖液的樣品檢測管中，混勻；3)吸取樣品檢測管中的溶液，滴加于氯霉素膠體金試紙條的加樣孔中；4)加樣后開始計時，3 IOmin后即可根據(jù)膠體金試紙條的檢測線(T)和控制線(C) 顯色深淺對比，判斷待檢樣品為陽性或者陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化妝品中氯霉素的快速檢測方法，其特征在于步驟1)提取液含有乙醇，正己烷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化妝品中氯霉素的快速檢測方法，其特征在于步驟2)底層溶液與緩沖液的體積比為1 :4 12。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化妝品中氯霉素的快速檢測方法，其特征在于緩沖液為 0.OlM PBS0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化妝品中氯霉素的快速檢測方法，其特征在于待檢樣品的質(zhì)量、乙醇的體積和正己烷的體積比為1 :4 8 :8 16。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的化妝品中氯霉素的快速檢測方法，其特征在于乙醇的體積濃度為70%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化妝品中氯霉素的快速檢測方法，其特征在于氯霉素膠體金試紙條的制備方法，包括以下步驟1)制備膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體，將其包被在膠體金結(jié)合墊上；2)制備氯霉素與BSA的偶聯(lián)物，將其及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，干燥；3)氯霉素膠體金試紙條組裝氯霉素膠體金試紙條由PVC模板和PVC背板組成，在PVC 背板上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。
全文摘要
本發(fā)明公開了化妝品中氯霉素的快速檢測方法，將待檢樣品加入提取管中，振搖，靜置分層；取底層溶液，加入樣品檢測管中，混勻；吸取樣品檢測管中的溶液，滴加于氯霉素膠體金試紙條的加樣孔中；加樣后開始計時，3～10min后即可進行結(jié)果判斷。本發(fā)明提取效率高，檢測靈敏度提高，排除了干擾因素，操作步驟簡單，所需樣品量少，5～10分鐘即可完成樣品的快速檢測，操作人員沒有專業(yè)知識也可快速掌握，非常適合監(jiān)督執(zhí)法部門日常監(jiān)督中使用。
文檔編號G01N33/577GK102507940SQ20111032755
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者李延志, 李楊杰, 歐國燈, 肖樹雄 申請人:廣東省藥品檢驗所