專利名稱：檢測化妝品中氯霉素的試劑板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測化妝品中氯霉素殘留的試劑板，具體涉及一種檢測氯霉 素的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術(shù)：
近年來，消費(fèi)者因?yàn)槭褂渺疃换瘖y品而造成嚴(yán)重不良反應(yīng)的案件屢有發(fā)生，為此， 衛(wèi)生部重點(diǎn)開展了針對化妝品違禁添加抗菌素情況的專項(xiàng)抽檢工作。在2004年的專項(xiàng)抽 檢中，衛(wèi)生部對50種化妝品進(jìn)行了抗菌素項(xiàng)目的檢測，這些化妝品都宣稱具有“祛痘”或 “除螨”等功能，而檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有13種化妝品違禁添加了抗菌素，被認(rèn)定為不合格產(chǎn) 品，不合格率高達(dá)26%。2005年，衛(wèi)生部同樣開展了化妝品中抗菌素的專項(xiàng)抽檢。結(jié)果在 M種“祛痘”、“除螨”類化妝品中，發(fā)現(xiàn)有12種產(chǎn)品違禁添加了包括氯霉素在內(nèi)的各類抗菌 素，不合格率達(dá)到22. 2%?；瘖y品中添加的抗菌素主要以氯霉素為主，同時(shí)還包括土霉素、四環(huán)素等其他抗 菌素。因?yàn)檫@些抗菌素具有抗菌和消炎的作用，對一些皮膚炎癥有一定的療效。所以，主要 被違禁添加在宣稱具有“祛痘”或“除螨”等功能的化妝品中。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種高效廣譜抗生素，因?yàn)槁让顾厥褂煤蟮母?作用比較多，長期微量攝入能引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，還會誘發(fā) 致病菌的耐藥性、引起機(jī)體正常菌群失調(diào)。即使在外用藥中使用的含量都有嚴(yán)格的限定，并 且要在醫(yī)生的指導(dǎo)下使用。而消費(fèi)者如果長期使用含有氯霉素的化妝品，由于臉部皮膚比 較柔嫩，黏膜血管豐富，對藥物吸收非?？?，即使化妝品中添加的氯霉素含量很低，也會被 迅速吸收，從而破壞皮膚表面的正常菌群，容易導(dǎo)致皮疹、速發(fā)性過敏等不良反應(yīng)。為了避免因?yàn)槭褂煤新让顾氐幕瘖y品而出現(xiàn)不良反應(yīng)，2002年，衛(wèi)生部頒布的 《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》就明確規(guī)定，禁止在化妝品中使用包括氯霉素在內(nèi)的各種抗菌素原料。 同時(shí)，根據(jù)衛(wèi)生部《2005年國家健康相關(guān)產(chǎn)品衛(wèi)生監(jiān)督抽檢工作手冊》要求，對“迪豆痘速 消”這類化妝品在氯霉素項(xiàng)目的檢驗(yàn)要求是“不得檢出”。對于化妝品中氯霉素的檢測，國家雖然加大了監(jiān)督力度，但是形勢依然不容樂觀。 目前，對于化妝品中的氯霉素的檢測方法有國標(biāo)的是儀器法(SN/T 2289-2009《進(jìn)出口化妝 品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》)，該法特異性好、準(zhǔn)確 率高，但存在對設(shè)備、環(huán)境、操作技能等要求，所需費(fèi)用高，不利于大規(guī)模樣本篩選。

實(shí)用新型內(nèi)容連著幾年抽查的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槌椴榈漠a(chǎn)品在品牌上基本是每年很少重復(fù)的，但 是不合格的比例差別不大，說明違禁添加抗菌素這個(gè)現(xiàn)象都比較普遍。本實(shí)用新型針對檢 測需求，研制開發(fā)一種檢測限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測時(shí)間短，適合現(xiàn)場快速檢測，技術(shù)產(chǎn) 品或儀器設(shè)備成本較低，運(yùn)行費(fèi)用低的快速檢測試劑。本實(shí)用新型應(yīng)用免疫膠體金層析原理，通過抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)顯色，特異性檢測化妝品樣品中的氯霉素殘留水平。檢測樣品包括洗面奶、面霜、爽膚水等各類具有除痘、 除螨功效的化妝品。如果樣品溶液含有氯霉素殘留，氯霉素藥物先和膠體金顆粒上的抗體 反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至檢測線時(shí)，膠體金顆粒上抗體的活性位點(diǎn)因被 樣品溶液中的氯霉素藥物占據(jù)而無法與檢測線上氯霉素特異性抗原結(jié)合；當(dāng)樣品中的氯霉 素含量超過試劑板檢出限時(shí)，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性。 反之，當(dāng)樣品中氯霉素含量在試劑板檢出限以下或無殘留時(shí)，試劑板上的檢測線顯色與控 制線相近或偏深，判定為陰性。本實(shí)用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品 墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有l(wèi)_2mm的重疊以保證層析作用從 樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。膠體金結(jié)合墊上包被有抗氯霉素單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維素膜上 從樣品墊到吸水墊方向依次包被有氯霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測 線和質(zhì)控線。偶聯(lián)氯霉素的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血藍(lán)蛋白 (KLH)等。本實(shí)用新型試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標(biāo)示各功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部 分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠金結(jié)合墊，由聚酯膜制成，其上有抗氯霉素單克隆抗體與膠體金顆粒的結(jié)合物， 為樣品溶液中有效成分和金標(biāo)抗體反應(yīng)提供場所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和質(zhì)控線，將反應(yīng)結(jié)果 以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊，由濾紙制成，將反應(yīng)過程中多余的溶液吸收。本實(shí)用新型試劑板具有如下有益效果(1)特異性好。本實(shí)用新型試劑板對氯霉素的交叉反應(yīng)率為100%，對如甲砜霉 素、氟甲砜霉素、棕櫚氯霉素等抗生素的交叉反應(yīng)率均低于1 %。可見，本實(shí)用新型試劑板對 氯霉素反應(yīng)具有高度專一性。(2)靈敏度高。本實(shí)用新型試劑板對原蜜、濃縮蜜中氯霉素的檢出限為500ppb，在 化妝品檢測領(lǐng)域內(nèi)達(dá)到了較優(yōu)水平。(3)操作簡單快捷。本實(shí)用新型試劑板將反應(yīng)所需的大部分原料整合到PVC背襯 中，滴樣后，抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，大大縮短檢樣時(shí)間，且樣品無需特殊處理， 滴樣后5-10分鐘即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線的顏色深淺讀取 結(jié)果。檢測實(shí)施過程不依賴任何實(shí)驗(yàn)設(shè)備，普通人員均可操作，不需專業(yè)培訓(xùn)。(4)成本低，易推廣。本實(shí)用新型試劑板生產(chǎn)工藝簡單，流程成熟。生產(chǎn)成本低廉， 投資少，收效快。

圖1為氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板背襯結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣品墊，2為膠金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為質(zhì)控線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC 底板。圖2為氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制 區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3為氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T為 檢測區(qū)。具體實(shí)施方法本實(shí)用新型試劑板的制備包括氯霉素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備，抗氯霉素單克隆 抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體的制備和氯霉素免疫膠 體金快速檢測試劑板的組裝。1.氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)采用碳二亞胺(EDC-HCl)法將氯霉素與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫抗原及包被抗原。 稱取20mg牛血清蛋白(BSA)，加入ImL蒸餾水。另外用ImL蒸餾水溶解20mg EDC · HCl和 20mg氯霉素，加入到上述溶液中。將溶液混勻后，置于4°C下避光反應(yīng)12小時(shí)(期間可顛 倒混勻)。之后用PBS緩沖液透析4天，期間每間隔8小時(shí)換液1次。再將溶液離心，收集 上清液，-20°C下凍存?zhèn)溆?。卵清蛋?OVA)替代BSA，同同樣方法制備氯霉素-OVA偶聯(lián)物。2.氯霉素單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的氯霉素-BSA偶聯(lián)物與等體積的 弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫1次，用不完全佐 劑替代完全佐劑進(jìn)行腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合 按常規(guī)方法進(jìn)行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1 10的比例混合，在50% PEG作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初 篩選擇10mg/L氯霉素-OVA偶聯(lián)物包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗 鼠IgG-HRPd 1000)，OPD顯色。篩選出的陽性孔再用氯霉素-OVA偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板 進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X10_3mol/L氯霉素溶液等量混合，37°C感作lh， 加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH 7.4)替代氯霉素溶液作對照，其余步 驟同上。若氯霉素阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經(jīng)2 3次檢測 都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X IO5Hir1時(shí)停止換液，細(xì)胞 全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆 化細(xì)胞株IO7個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1% 檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用0. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8. O。邊攪 拌邊加入1. 5mg抗氯霉素單抗，攪拌20min，再逐滴加入2mL25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，攪拌15min。20，OOOrpm離心15min，棄上清液，加入IOmL pH 7. 4PBS緩沖液(含 0. 4mol/LPEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶解，用0. 22 μ m 無菌過濾器過濾后，4 0C保存?zhèn)溆谩?.氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝參照圖1，用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的氯霉素-BSA偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維 素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱干燥他。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記氯霉 素單克隆抗體包被在膠金結(jié)合墊上。檢測試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素 膜和吸水墊。用切割機(jī)將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板， 再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實(shí)施操作方法6. 1樣品制備取化妝品樣品ImL加入IOmL的氯霉素專用PBST緩沖液中，充分混勻后吸取混合 液待檢。6. 2檢測步驟從包裝袋中取出試劑板，用滴管吸取待檢溶液，在加樣孔中滴入3滴(約100 μ L)， 加樣后開始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在3 5min讀取，其他時(shí)間判讀無效。6. 3結(jié)果判讀讀取結(jié)果時(shí)，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。陰性(-):T線顯色比C線深或一樣深，表明樣品中氯霉素濃度低于500ppb或無氯 霉素殘留。如圖3. a所示。陽性⑴T線顯色比C線淺，或T線無顯色，表明樣品中氯霉素濃度高于500ppb ； T線比C線越淺，表明樣品中氯霉素濃度越高。如圖3. b所示。無效未出現(xiàn)C線，可能操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說明書，并用新試 劑板重新測試。如圖3. c所示。
權(quán)利要求1.一種檢測氯霉素的試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試 劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有 l-2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所說的試劑板，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊 方向上依次噴有檢測線和質(zhì)控線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
3.如權(quán)利要求1所說的試劑板，其特征在于膠體金顆粒的平均大小為30nm。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測氯霉素的免疫膠體金試劑板，可用于檢測化妝品中的氯霉素。本實(shí)用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和質(zhì)控線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進(jìn)行半定量直觀檢測，整個(gè)操作過程僅需20～30min，且無需任何昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合工商部門、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)對化妝品，尤其是祛痘、除螨類化妝品中非法添加的氯霉素進(jìn)行大規(guī)?？焖贆z測。
文檔編號G01N33/543GK201845014SQ20102019893
公開日2011年5月25日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者張少恩, 桑麗雅, 邵偉 申請人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司