絲氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾解析用標(biāo)記劑的制作方法
【專利摘要】將作為被檢測物質(zhì)的糖蛋白和/或糖肽與吡唑啉酮衍生物、異噁唑酮衍生物、乙內(nèi)酰脲衍生物、羅丹寧衍生物、馬來酰亞胺衍生物等一起在堿性溶液條件下進(jìn)行加熱，將翻譯后修飾基切斷，并且標(biāo)記、進(jìn)行分析，由此解析絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基的翻譯后修飾變得可能。
【專利說明】絲氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾解析用標(biāo)記劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)、藥物研發(fā)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中有用的絲氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾基的新型的解析方法。特別是，本發(fā)明涉及一種標(biāo)記劑，其從接受了翻譯后修飾的糖蛋白和/或糖肽的絲氨酸、蘇氨酸選擇性切斷翻譯后修飾的O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002]生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出各種各樣的生理活性，可以認(rèn)為是由基因翻譯出的蛋白質(zhì)發(fā)生了磷酸化、硫酸化或者糖鏈修飾等多樣的翻譯后修飾的結(jié)果。其中，磷酸化、硫酸化為一般的翻譯后修飾，對(duì)于多數(shù)的蛋白質(zhì)，通過該修飾具有生物學(xué)的活性、機(jī)能。其中，糖基化(Glycosylation)為最近開始被關(guān)注的領(lǐng)域,修飾后的糖鏈對(duì)蛋白質(zhì)賦予各種各樣的機(jī)能。例如:一些蛋白質(zhì)最初不被糖基化就不能正確地折疊。另外，已知低聚糖通過結(jié)合于天冬酰胺而對(duì)蛋白質(zhì)賦予穩(wěn)定性、控制糖蛋白的體內(nèi)動(dòng)態(tài)的例子。進(jìn)一步，糖基化承擔(dān)著細(xì)胞間的粘附這樣的作用。修飾蛋白質(zhì)的糖鏈大體上分為N-聚糖、O-聚糖、糖胺聚糖(GAG)三類。另外，關(guān)于構(gòu)成該糖鏈的單糖的種類，在高等生物的情況下，有:甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、葡萄糖醛酸(GlcA)、N_乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N_乙酰半乳糖胺(GalNAc)、巖藻糖(Fuc)、唾液酸(SA)。N-聚糖由糖鏈以N-連接型被轉(zhuǎn)移至具有-天冬酰胺-X-蘇氨酸或者-天冬酰胺-X-絲氨酸(X為除了脯氨酸(Pro)以外的氨基酸殘基)序列的肽的天冬酰胺(Asn)上而成。O-聚糖由最初的糖以O(shè)-連接被轉(zhuǎn)移至蘇氨酸(Thr)或絲氨酸(Ser)殘基上而成。O-聚糖的最初的糖為N-乙酰半乳糖胺的情況居多,其他的也有甘露糖、巖藻糖、N-乙酰葡糖胺等。在最初的糖的后面，屢屢有糖一個(gè)接一個(gè)地被轉(zhuǎn)移而來，O-聚糖糖鏈不斷延伸。蛋白多糖形成為在蛋白質(zhì)上連接有多條極長的糖鏈的形狀。將具有該氨基糖(N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺)的糖鏈部分稱為糖胺聚糖(GAG)。糖胺聚糖的特征可列舉出如下點(diǎn) :以二糖為I個(gè)單位，由該重復(fù)結(jié)構(gòu)形成極長的糖鏈。
[0003]其中，絲氨酸和蘇氨酸為接受了磷酸化或硫酸化、糖鏈修飾(O-GalNAc型、O-GlcNAc型、O-Fuc型、O-Man型、O-Xyl型、O-Gal型、O-Glc型)等多樣的翻譯后修飾的氨基酸殘基，這些翻譯后修飾在信號(hào)傳導(dǎo)、分化控制等各種生命的高級(jí)機(jī)能調(diào)節(jié)中承擔(dān)著重要的作用。例如:擔(dān)負(fù)著特定的蛋白質(zhì)的磷酸化的激酶，其抑制劑全部作為醫(yī)藥品上市，另外，O-連接型糖鏈的定性、定量的變動(dòng)應(yīng)用于各種疾病的診斷。已知，在絲氨酸和蘇氨酸的翻譯后修飾中，O-磷酸化、O-硫酸化、O-GIcNAc化分別為磷酸基、硫酸基、O-GIcNAc基單獨(dú)地結(jié)合；通常，O-GalNAc化、O-Fuc化、O-Man化、O-Xyl化等O-連接型糖鏈修飾進(jìn)一步延伸而成為多樣的結(jié)構(gòu)。
[0004]此處，作為磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸的磷酸化結(jié)合位點(diǎn)的切斷、標(biāo)記方法之一，可列舉出消除?邁克爾加成(BEMA)法。該方法應(yīng)用的是:在堿性條件下磷酸基β -消除、不飽和羰基生成而成為邁克爾反應(yīng)受體(參照專利文獻(xiàn)1、2，非專利文獻(xiàn)I)。例如:通過使二硫蘇糖醇之類具有硫醇基的化合物作用，磷酸化位點(diǎn)被標(biāo)記，利用于肽的純化和玻珠(on beads)、芯片(on-chip)上的突光標(biāo)記化等(參照專利文獻(xiàn)3)。BEMA法對(duì)于涉及蛋白質(zhì)的磷酸化的研究有貢獻(xiàn)，而成為廣泛使用的方法，然而包含O-GlcNAc化的其他的絲氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾基也通過BEMA而被切斷，所以存在不能區(qū)分何種修飾基以何種狀態(tài)存在的問題。另外，作為BEMA中的邁克爾供體，通常為具有硫醇基的化合物，其他的邁克爾供體的應(yīng)用例幾乎沒有，應(yīng)用范圍狹窄。另外，作為接受Ο-GlcNAc化的蛋白質(zhì)的解析方法，公開有通過2位上具有疊氮基的非天然型的GIcNAc衍生物進(jìn)行代謝標(biāo)記的方法(非專利文獻(xiàn)2)。進(jìn)一步，解析O-GalNAc型(粘蛋白型)的糖鏈部分的多樣的結(jié)構(gòu)時(shí)，由于尚未發(fā)現(xiàn)從蛋白質(zhì)將糖鏈切出的有效的酶，因此為了切出糖鏈，強(qiáng)堿下的β_消除被廣泛應(yīng)用。該情況下，由于游離的糖鏈也能夠從還原末端側(cè)依次接受消除而引起分解(剝離反應(yīng)(peeling reaction)),因此加入高濃度的還原劑,與β-消除同時(shí)地,將還原末端還原為糖醇。該方法于1968年由Carlson公開，至今還是O-GalNAc型糖鏈的游離的標(biāo)準(zhǔn)的方法(非專利文獻(xiàn)3)。然而，本法中存在以下問題點(diǎn):(I)還原劑存在下的β_消除引起肽部分的分解，所以難以進(jìn)行蛋白質(zhì)部分的解析；(2)通過還原，糖鏈的還原末端喪失，所以用于糖鏈的分離和高靈敏度分析的衍生物化變困難，等。因此，一直以來強(qiáng)烈需要開發(fā)一種用于使O-連接型糖鏈不分解且以更高的收率從肽、蛋白質(zhì)游離、分離、為高靈敏度化而衍生物化的方法。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:日本特表2007-515625號(hào)公報(bào)
[0008]專利文獻(xiàn)2:美國 專利第7803751號(hào)
[0009]專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-19002號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)4:美國專利公開公報(bào)2006-0099604Α1
[0011]專利文獻(xiàn)5:美國專利公開公報(bào)2005-0176093Α1
[0012]專利文獻(xiàn)6:美國專利公開公報(bào)2005-0095725Α1
[0013]專利文獻(xiàn)7:美國專利公開公報(bào)2005-0014197Α1
[0014]專利文獻(xiàn)8:美國專利公開公報(bào)2004-0038306Α1
[0015]專利文獻(xiàn)9:美國專利公開公報(bào)2003-0219838Α1
[0016]非專利文獻(xiàn)
[0017]非專利文獻(xiàn)1:Nature Biotechnology、19 (4)，379-382 (2001)
[0018]非專利文獻(xiàn)2 !Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnitedStates of America, 100(16), 9116-9121(2003)
[0019]非專利文獻(xiàn)3:J.Biol.Chem.，243，616-626 (1968)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]發(fā)明要解決的問題
[0021]蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)進(jìn)步，分析各種翻譯后修飾基的機(jī)會(huì)增加，但現(xiàn)有技術(shù)中，只有絲氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾的O-磷酸基通過上述的BEMA法而被解析。其他的O-硫酸基、O-聚糖等翻譯后修飾的解析即便能夠用該BEMA法分別切斷，也不能進(jìn)行其后的標(biāo)記化，例如:對(duì)于O-聚糖與何種位置的氨基酸殘基結(jié)合、進(jìn)一步該O-聚糖的結(jié)構(gòu)均不能解析。本發(fā)明的目的在于解決這樣的問題，提供利用能夠?qū)⒔邮芰朔g后修飾的糖蛋白和/或糖肽的絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基的翻譯后修飾的O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等共通地標(biāo)記的標(biāo)記劑，將上述翻譯后修飾選擇性切斷，效率良好地進(jìn)行解析的方法。進(jìn)一步，本發(fā)明的目的在于，提供能夠得到修飾的種類和肽上的修飾位置的相關(guān)信息的方法；提供將翻譯后修飾位點(diǎn)化學(xué)地進(jìn)行修飾的同時(shí)，游離的糖鏈也不發(fā)生剝離反應(yīng)，作為對(duì)于分離、檢測有利的任意的衍生物而回收的方法；以及提供新的化合物群，其用于通過BEMA法進(jìn)行的肽部分的標(biāo)記。
[0022]用于解決問題的方案
[0023]本發(fā)明人等，為了解決上述問題，在從各種角度討論的基礎(chǔ)上進(jìn)行了研究開發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于在堿性條件下絲氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾的O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等，加入特定的標(biāo)記劑進(jìn)行加熱，由此翻譯后修飾基被選擇性切斷，能夠效率良好地標(biāo)記被切斷的翻譯后修飾基。本發(fā)明基于所述見解而完成。本發(fā)明的分析方法在簡便性、選擇性方面超過了現(xiàn)有方法；能夠從各種接受了翻譯后修飾的糖蛋白和/或糖肽的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基，將翻譯后修飾基選擇性由該氨基酸殘基切斷，而進(jìn)行解析。進(jìn)一步，本發(fā)明也能夠進(jìn)行作為切斷源的糖蛋白和/或糖肽的解析。
[0024]S卩，本發(fā)明目的在于提供一種標(biāo)記劑，其在堿性條件下，從接受了翻譯后修飾的糖蛋白和/或糖肽的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基選擇性切斷翻譯后修飾基，對(duì)絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基和該從氨基酸殘基選擇性切斷的翻譯后修飾基中的至少一種進(jìn)行標(biāo)記。另外，本發(fā)明目的在于提供一種翻譯后修飾基的切斷方法，使被檢測物質(zhì)的糖蛋白和/或糖肽與標(biāo)記劑溶解或分散于溶劑中，在堿性條件下進(jìn)行加熱，由此從被檢測物質(zhì)的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基將翻譯后修飾基選擇性切斷。進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種方法，其利用該翻譯后修飾基切斷方法，解析糖蛋白和/或糖肽的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基的翻譯后修飾基?？梢哉J(rèn)為，本發(fā)明為:現(xiàn)有技術(shù)中困難的能夠?qū)⒔z氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾的O-磷酸基、
O-硫酸基、O-聚糖等綜合地進(jìn)行解析的方法，是基于世界上獨(dú)一無二的新想法的極其重要的發(fā)明。
[0025]發(fā)明的效果
[0026]根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠通過簡單的操作、在溫和穩(wěn)定的條件下，不使用有害的試劑而使O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等從糖蛋白游離，同時(shí)將游離的糖鏈和肽兩者分別用相同的或者不同的試劑進(jìn)行標(biāo)記。通過這樣的標(biāo)記，有助于其后分離的容易性和/或檢測中的高靈敏度化等，能夠?qū)⒈粯?biāo)記的糖鏈和肽容易地純化。另外，能夠?qū)⒈粯?biāo)記的糖鏈和肽通過液相色譜、質(zhì)譜分析裝置高靈敏度地進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析、定量分析，能夠?qū)⒔z氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾綜合地進(jìn)行解析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為表示實(shí)施例1中將具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽模型(glycopeptidemodel)在堿性條件下與PMP、DP、MTP分別加熱時(shí)得到的MALD1-T0F譜的結(jié)果的圖。
[0028]圖2為表示實(shí)施例1中推定的反應(yīng)路徑的圖。
[0029]圖3為表示實(shí)施例2中從具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽模型在各種條件下切出的
O-連接型糖鏈的分布(profile)的圖。A:還原性β_消除(Carlson法)、Β: β -EliminationKit (Sigma)，4°C、24 小時(shí)，C: β -Elimination Kit (Sigma)，室溫、24 小時(shí)，D: 二甲基胺、50°C >16小時(shí)，E:二甲基胺、70°C、16小時(shí)，F(xiàn):堿性條件下PMP、70°C、16小時(shí)
[0030]圖4為表示實(shí)施例3的、實(shí)施例1中得到的被DP分別標(biāo)記的肽的TOF / TOF譜的圖。
[0031]圖5為表示實(shí)施例3的、實(shí)施例1中得到的被PMP分別標(biāo)記的肽的TOF / TOF譜的圖。
[0032]圖6為表示實(shí)施例3的、實(shí)施例1中得到的被MTP分別標(biāo)記的肽的TOF / TOF譜的圖。
[0033]圖7為表示實(shí)施例4的、將具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽模型在堿性條件下與DTT、DP、DTT / DP —起加熱時(shí)的生成物的MALD1-T0F譜的圖。
[0034]圖8為表示實(shí)施例4的、將具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽模型在堿性條件下與DTT/DP 一起加熱時(shí)所推定的反應(yīng)路徑的圖。
[0035]圖9為表示實(shí)施例5的、將牛胎球蛋白、豬胃粘蛋白在堿性條件下與DP加熱時(shí)得到的O-連接型糖鏈分布的圖。圖中的〇標(biāo)志表示半乳糖，淺色的□標(biāo)志表示N-乙酰半乳糖胺，深色的□標(biāo)志(涂黑的□標(biāo)志)表示N-乙酰葡糖胺，Λ標(biāo)志表示巖藻糖，?標(biāo)志表示N-乙?；窠?jīng)氨酸。
[0036]圖10為表示實(shí)施例6的、將磷酸化模式肽(左圖)和O-GlcNAc化模式肽(右圖)在堿性條件下分別與PMP、DP加熱時(shí)的生成物的MALD1-T0F譜的圖(各圖中，上圖表示原料，下圖表示生成物。)。
[0037]圖11為表示實(shí)施例7的、將具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽模型在堿性條件下與DTT、DP、DTT和DP分別加熱時(shí)的反應(yīng)生成物的MALD1-T0F譜的圖。
[0038]圖12為表示實(shí)施例7的、向具有O-GlcNAc型糖鏈的糖肽中在堿性條件下加入吡唑啉酮衍生物(DP)和二硫蘇糖醇(DTT)，在70°C下加熱16小時(shí)時(shí)的質(zhì)譜的圖。
[0039]圖13為表示將牛胎球蛋白、豬顎下腺粘蛋白在堿性條件下與DP加熱時(shí)得到的
O-連接型糖鏈分布的圖。圖中的〇標(biāo)志表示半乳糖，淺色的□標(biāo)志表示N-乙酰半乳糖胺，深色的□標(biāo)志(涂黑的□標(biāo)志)表示N-乙酰葡糖胺，Λ標(biāo)志表示巖藻糖，?標(biāo)志表示N-乙?；窠?jīng)氨酸。
[0040]圖14為表示通過新型吡唑啉酮試劑的糖鏈標(biāo)記后的MALD1-T0F譜的圖(上段用化合物5標(biāo)記、中段用化合物10標(biāo)記、下段用化合物14標(biāo)記)。
[0041]圖15為表示精氨酸附加批唑啉酮(arginine-added pyrazolone)試劑的合成路徑的反應(yīng)概略圖。
[0042]圖16為表示精氨酸附加批唑啉酮(arginine-added pyrazolone)試劑的合成路徑的其他的反應(yīng)方案圖。
[0043]圖17為表示生物素附加批唑啉酮(biotin-added pyrazolone)試劑的合成路徑的反應(yīng)方案圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044]本發(fā)明涉及一種技術(shù)，用于對(duì)接受了翻譯后修飾的糖蛋白和/或糖肽中的、絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基的相關(guān)的翻譯后修飾實(shí)施解析。對(duì)于作為其對(duì)象的糖蛋白和/或糖肽的來源，完全沒有限制，可列舉出例如:人、大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、貓、羊、豬、黑猩猩或它們的免疫缺陷動(dòng)物等動(dòng)物、或者植物；但將本發(fā)明的成果用于人類的治療時(shí)，優(yōu)選使用人、豬、黑猩猩來源的細(xì)胞。如上所述，本發(fā)明提供一種方法，用于解析作為接受了翻譯后修飾的糖蛋白和/或糖肽中的氨基酸中的、具有羥基的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基的被修飾的翻譯后修飾基。對(duì)于這樣的翻譯后修飾基也沒有特別的限定，可列舉出例如:介由氨基酸側(cè)的O原子連接的磷酸基、硫酸基、聚糖等，本發(fā)明中可以使用它們的任一種，也可以使用兩種以上。尤其是，介由氨基酸側(cè)的O原子結(jié)合的聚糖(以后，有時(shí)將介由氨基酸側(cè)的O原子結(jié)合的聚糖稱為O-聚糖。同樣地，有時(shí)將介由氨基酸側(cè)的O原子結(jié)合的磷酸基、硫酸基分別稱為O-磷酸基、O-硫酸基。)可以為:由N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖、N-乙酰葡糖胺、木糖、葡萄糖中的任一者作為與O原子結(jié)合的糖而起始的聚糖；以及由N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖、木糖、葡萄糖中的任一者作為與O原子結(jié)合的糖而起始并進(jìn)一步結(jié)合糖而延伸的聚糖。
[0045]本發(fā)明中，需要將這樣的對(duì)絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基進(jìn)行修飾的翻譯后修飾基從絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基切斷。該切斷反應(yīng)可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行消除反應(yīng)，對(duì)于其條件，沒有特別的限定，可以列舉出例如:將發(fā)生了翻譯后修飾的糖蛋白和/或糖肽溶解或分散于溶劑中，在堿性條件下進(jìn)行加熱的方法。作為消除條件，例如:在IOmM?IM的氫氧化鋰或氫氧化鈉或氫氧化鋇中，以4°C?60°C左右靜置10分鐘?24小時(shí)左右。
[0046]本發(fā)明對(duì)于將該絲氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾用β -消除進(jìn)行游離時(shí)生成的雙鍵通過邁克爾加成進(jìn)行標(biāo)記。本邁克爾加成通常一鍋(one-pot)進(jìn)行，消除時(shí)例如通過添加20mM?IM左右的吡唑啉酮衍生物等邁克爾加成反應(yīng)供體而進(jìn)行。另外，可以對(duì)游離的翻譯后修飾基側(cè)也進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明中，可以只標(biāo)記絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基側(cè)，也可以標(biāo)記兩者，進(jìn)一步也可以將絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基側(cè)和翻譯后修飾基側(cè)用不同的試劑進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于這樣的邁克爾加成反應(yīng)時(shí)使用的試劑，沒有特別的限定，可列舉出例如:硫醇化合物、吡唑啉酮衍生物、異噁唑酮衍生物、乙內(nèi)酰脲衍生物、羅丹寧衍生物、馬來酰亞胺衍生物等；本發(fā)明中可以使用它們的任一種也可以組合使用兩種以上。其中，對(duì)于吡唑啉酮衍生物、異噁唑酮衍生物、乙內(nèi)酰脲衍生物、羅丹寧衍生物、馬來酰亞胺衍生物等，由于能夠在邁克爾加成反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記化，所以是本發(fā)明中優(yōu)選的。本發(fā)明的標(biāo)記劑是指包含這樣的試劑的制劑。本發(fā)明中，進(jìn)一步吡唑啉酮衍生物作為本發(fā)明的標(biāo)記劑是有用的，它們只要是具有吡唑啉酮基的化合物就沒有特別的限制，可以列舉出例如:3_甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)、1，3- 二甲基-吡唑啉酮(DP)、3_甲基-1-對(duì)甲苯基-5-吡唑啉酮(MTP)、3_甲基-1-(喹啉-8-基)-1H-吡唑-5 (4H)-酮等。作為異噁唑酮衍生物，可以列舉出例如:3 (2H)-異噁唑酮、5-甲基-3 (2H)-異噁唑酮、2，5- 二甲基3 (2H)-異噁唑酮等。作為乙內(nèi)酰脲衍生物，可以列舉出例如:2，4-咪唑啉二酮、3-甲基-2，4-咪唑啉二酮、3-(2-丙炔-1-基)-2，4-咪唑啉二酮等。作為羅丹寧衍生物，可列舉出:2_硫代-4-噻唑啉二酮、
3-甲基-2-硫代-4-噻唑啉二酮等。
[0047]本發(fā)明中，可以與上述的標(biāo)記劑一起組合使用硫醇化合物。此時(shí)使用的硫醇化合物只要是具有硫醇基的化合物就沒有特別的限制，可以列舉出例如:二硫蘇糖醇(DTT)、2-氨基乙烷硫醇、硫代膽堿、2-(吡啶-4-基)乙烷硫醇等。通過該組合，產(chǎn)生如上所述的只標(biāo)記絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基側(cè)的情況、標(biāo)記兩者的情況，可以結(jié)合目的而適宜選擇。作為標(biāo)記劑，可以以上述的1，3_ 二甲基-吡唑啉酮(DP)和二硫蘇糖醇(DTT)為例，對(duì)此進(jìn)行具體的說明。翻譯后修飾基為糖鏈時(shí)，加入DP時(shí)被標(biāo)記而加入DTT時(shí)沒有被標(biāo)記；加入DP和DTT兩者的情況下，只有DP標(biāo)記體被檢測出。另外，蛋白質(zhì)或者肽的情況下，添加DTT時(shí)DTT標(biāo)記體被檢測出，添加DP時(shí)作為DP標(biāo)記體被檢測出。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可知，將DTT與DP組合使用時(shí)，只有DTT標(biāo)記體與肽反應(yīng)，DP不與蛋白質(zhì)或者肽反應(yīng)。
[0048]對(duì)于從本發(fā)明中的被檢測物質(zhì)的糖蛋白和/或糖肽將翻譯后修飾基切斷時(shí)的反應(yīng)液的狀態(tài)，沒有特別的限制，可以為溶解于溶劑中的狀態(tài)，也可以為使之分散的狀態(tài)。在本發(fā)明中，使糖蛋白和/或糖肽與標(biāo)記劑在水中溶解的條件下進(jìn)行的方法，能效率良好地進(jìn)行反應(yīng)而優(yōu)選。另外，為了進(jìn)一步效率良好地進(jìn)行反應(yīng)，也可以攪拌反應(yīng)液。
[0049]本發(fā)明中，對(duì)于從這樣得到的被檢測物質(zhì)的絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基將翻譯后修飾基切斷并標(biāo)記的該翻譯后修飾基或者從被檢測物質(zhì)的絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基將翻譯后修飾基切斷并標(biāo)記的被檢測物質(zhì)中的任一者或者兩者，可以使用液相色譜、高效液相色譜進(jìn)行分析。進(jìn)一步，可以根據(jù)目標(biāo)分子的種類使用適宜的方法，可以使用例如:質(zhì)譜分析(MS)、核磁共振(NMR)，除此以外，還可以使用紫外分光光度計(jì)(UV)、蒸發(fā)光散射檢測器(ELS)、電化學(xué)檢測器等。本發(fā)明中，可以使用它們中的任一種方法進(jìn)行分析，也可以組合兩種以上的方法進(jìn)行分析。
[0050]根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)Ρ粰z測物質(zhì)的糖蛋白和/或糖肽的翻譯后修飾基進(jìn)行高靈敏度結(jié)構(gòu)解析、定量分析，能夠?qū)z氨酸和蘇氨酸的翻譯后修飾綜合地進(jìn)行解析。
[0051]實(shí)施例
[0052]以下，基于實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。
[0053][實(shí)施例1]
[0054](實(shí)驗(yàn)詳細(xì)內(nèi)容I)
[0055]按照已有的報(bào)道合成具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽。向糖肽的水溶液(4 μ g/mL、5 μ L)中加入45 μ L的水、50 μ L的0.6Μ NaOHUOO μ L的0.5Μ3-甲基-1-苯基~5~吡唑啉酮(PMP)的甲醇溶液或0.5Μ1, 3- 二甲基5-吡唑啉酮(DP)的水溶液或0.5Μ3-甲基-1-對(duì)甲苯基-5-吡唑啉酮(MTP)的甲醇溶液，70°C下靜置16小時(shí)。反應(yīng)后，用0.3M鹽酸中和，將反應(yīng)液直接與2，5-二氫苯甲酸(10mg/mL)混合，通過MALD1-TOF(/TOF) (UltraFlex I1、Bruker Corporation)進(jìn)行解析。
[0056](實(shí)驗(yàn)詳細(xì)內(nèi)容2)
[0057]接著，向該具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽中，在堿性條件下加入3種不同的吡唑啉酮衍生物，70°C下加熱16小時(shí)，進(jìn)行分解。具體而言，向具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽的水溶液(4 μ g/mL、5 μ L)中添加 10μ L 的 lMNaBH4(100mM NaOH 溶液)、水 5 μ L，50°C 下靜置15小時(shí)(A)。向糖肽的水溶液(4μ g/mL、5l.! L)中加入12 μ L的水和3.4 μ L的β —消除試劑混合物(β — elimination reagent mix) (Sigma-Aldrich Japan K.K.), 4°C或室溫下靜置24小時(shí)(B、C)。在糖肽的水溶液Gyg/mUSyL)中，加入18 μ L的二甲基胺，50°C或70°C下靜置16小時(shí)(D、E)。向糖肽的水溶液(4μ g/mL、5l.! L)中加入45 μ L的水、50 μ L的
0.6Μ NaOHUOOy L的0.5Μ3- 甲基-1-苯基~5~吡唑啉酮(PMP)的甲醇溶液，70°C下靜置16小時(shí)(F)。分別在反應(yīng)后進(jìn)行中和，A中重復(fù)加入1%醋酸甲醇溶液，干固。A-E分別通過Dowex50x8和ZipTipC18將糖鏈部分純化,將2，5-二氫苯甲酸(10mg/mL)作為基質(zhì)通過MALD1-TOF(/TOF) (UltraFlex I1、Bruker Corporation)進(jìn)行解析。F米用實(shí)驗(yàn)詳細(xì)內(nèi)容 I中所述的方法進(jìn)行糖鏈的分析。將得到的質(zhì)譜的結(jié)果示于圖1。作為原料的糖肽的信號(hào)均顯著降低，出現(xiàn)了被新添加的吡唑啉酮衍生物標(biāo)記的肽和糖鏈的信號(hào)。將推定的反應(yīng)示于圖2。
[0058][實(shí)施例2]
[0059]對(duì)通過現(xiàn)有的各種方法使糖鏈從具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽游離而得到的糖鏈的分布進(jìn)行比較。將得到的質(zhì)譜的結(jié)果示于圖3?？芍褂玫奶请闹饕哂斜环Q為唾液酸化T (siaryl-T)的三糖結(jié)構(gòu)(Neu5Ac a 2_3Gal β l_3GalNAc)，包含微量的被稱為T抗原(Gal β l-3GalNAc)的二糖結(jié)構(gòu)。將通過為了防止糖鏈的分解而在還原劑(NaBH4)存在下、在消除的同時(shí)將糖鏈的還原末端還原為糖醇的Carlson法而得到的糖鏈分布示于圖3的A。確認(rèn)有唾液酸化T和T抗原的峰，與分解物相當(dāng)?shù)姆鍍H微量存在。將使用Sigma-Aldrich Japan K.K.市售的β消除試劑盒(elimination kit)在推薦的兩種條件下使糖鏈游離時(shí)的結(jié)果示于圖3的B、C。另外，使用二甲基胺的方法(Anal.Chem.,2010,82,2421-2425)也在兩種條件下進(jìn)行(圖3的D、E)。在任一情況下，通過剝離反應(yīng)生成的分解物占有非常大的比例，不實(shí)施還原的情況下，得到糖鏈分布顯著受損的結(jié)果。最近的人類蛋白質(zhì)組機(jī)構(gòu)的論文中也指出(Mol.Cel.Proteomics、2010、9、719-727)不實(shí)施還原的情況下，存在糖鏈分布受損的傾向。堿性條件下加入PMP時(shí)，唾液酸化T只有PMP標(biāo)記體被檢測出以及僅微量的T抗原的PMP標(biāo)記體被檢測出，分解物的峰完全沒有檢測出(圖3的F)。
[0060]由這些結(jié)果可知，即便在堿性條件下將O-連接型糖鏈通過β -消除而游離，只要存在吡唑啉酮衍生物，就能快速地與糖鏈反應(yīng)而得到穩(wěn)定的標(biāo)記體，幾乎不會(huì)得到分解產(chǎn)物。
[0061][實(shí)施例3]
[0062]將實(shí)施例1中得到的被DP、PMP、MTP分別標(biāo)記的肽的TOF / TOF譜分別示于圖4、圖5、圖6。所有的情況下，均良好地得到肽序列信息以及糖鏈的修飾位置信息。由這些結(jié)果可知，通過向消除反應(yīng)中添加吡唑啉酮衍生物，能夠很好地得到糖鏈、肽以及結(jié)構(gòu)、序列信息。
[0063][實(shí)施例4]
[0064]向具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽中，在堿性條件下加入吡唑啉酮衍生物(DP)和二硫蘇糖醇(DTT)，70°C下加熱16小時(shí)。具體而言，向具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽的水溶液(4 μ g/mL,5 μ L)中添加 5 μ L 的 0.6M NaOH。進(jìn)一步，加入 10 μ L 的 0.5Μ DTT 或 10 μ L 的
0.5Μ DP或5yL的0.5Μ DTT + 5 μ L的0.5M DP，70°C下靜置16小時(shí)。反應(yīng)后，分別稀釋反應(yīng)液，與 DHB 混合，通過 MALD1-TOF (/TOF) (UltraFlex I1、Bruker Corporation)進(jìn)行解析。將此時(shí)的質(zhì)譜的結(jié)果示于圖7。關(guān)于糖鏈，只在加入了 DP時(shí)被標(biāo)記(圖7左中圖)，在加入了 DTT時(shí)沒有被標(biāo)記(圖7左上圖)。加入DP和DTT兩者時(shí)，只有DP標(biāo)記體被檢測出(圖7左下圖、圖8)。關(guān)于肽，在添加了 DTT時(shí)DTT衍生物被檢測出，在添加了 DP時(shí)作為DP衍生物而被檢測出(圖7右上圖和中圖)。添加了 DTT和DP時(shí)，只有DTT與肽反應(yīng)的物質(zhì)被檢測出；DP直接與肽反應(yīng)的物質(zhì)沒有被檢測出(圖7右下圖、圖8)。該結(jié)果顯示，糖鏈和肽能夠分別被不同的試劑選擇性進(jìn)行標(biāo)記。[0065][實(shí)施例5]
[0066]對(duì)于已知具有O-連接型糖鏈的牛胎球蛋白、豬胃粘蛋白和人類IgA，使用本發(fā)明所示的技術(shù)，進(jìn)行O-連接型糖鏈的分布分析。將結(jié)果示于圖9。將牛胎球蛋白或豬胃粘蛋白或人類IgA分別秤取50 μ g,添加50 μ L的水、100 μ L的0.5Μ DP溶液、50 μ L的0.6ΜNa0H，70°C下靜置16小時(shí)。反應(yīng)后進(jìn)行中和，將反應(yīng)液的1/4量(50 μ L)通過Dowex50x8和ZipTipC18而將糖鏈部分純化，暫時(shí)干固后，溶解于DHB中，通過MALD1-TOF(/T0F)(UltraFlex I1、Bruker Corporation)進(jìn)行解析。所有的結(jié)果均為與過去所報(bào)告的結(jié)果定性、定量地相同的結(jié)果。由此可知，本發(fā)明對(duì)于糖蛋白的O-連接型糖鏈的解析是有用的。另夕卜，已知牛胎球蛋白具有O-連接型糖鏈和N-連接型糖鏈兩者，但本法中只檢測出O-連接型糖鏈，N-連接型糖鏈完全沒有檢測出。由該結(jié)果可知，本發(fā)明技術(shù)對(duì)于N-連接型糖鏈沒有作用，高選擇性作用于O-連接型糖鏈。
[0067][實(shí)施例6]
[0068]示出對(duì)于分別具有磷酸化修飾、Ο-GlcNAc型糖鏈修飾的兩種肽利用本發(fā)明技術(shù)時(shí)的結(jié)果的質(zhì)譜(圖10)。具體而言，來源于牛β -酪蛋白的磷酸化糖肽(FQpSEEQQQTEDELQDK)從 ANASPEC Inc.購得。O-GlcNAc 化肽(TAPT (O-GlcNAc) STIAPG)從 INVITR0GEN 公司購得。向磷酸化糖肽50 μ g (5 μ L)中加入10 μ L的0.5Μ ΡΜΡ、5μ L的0.6Μ NaOH，70°C下靜置16小時(shí)。向 O-GlcNAc 化肽 5.6μ g(10y L)中加入 20 μ L 的 0.5Μ DPUOy L 的 0.6Μ NaOH, 70°C下靜置16小時(shí)。將反應(yīng)液直接與DHB混合，通過MALD1-T0F進(jìn)行解析。結(jié)果，原料的修飾肽均在反應(yīng)后顯著地降低，肽分別以高收率轉(zhuǎn)化為所添加的吡唑啉酮衍生物。由該結(jié)果可知，與O-GalNAc型糖鏈同樣地，本法對(duì)于絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化、O-GlcNAc型糖鏈修飾也同樣地起作用。
[0069][實(shí)施例7]
[0070]向具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽的水溶液(4μ g/mL、5y L)中添加5μ L的0.6ΜNaOH。進(jìn)一步，加入 10 μ L 的 0.5Μ DTT 或 10 μ L 的 0.5Μ DP 或 5 μ L 的 0.5MDTT + 5 μ L 的
0.5Μ DP, 70°C下靜置16小時(shí)。反應(yīng)后，分別稀釋反應(yīng)液，與DHB混合，通過MALD1-TOF (/T0F)(UltraFlex I1、Bruker Corporation)進(jìn)行角軍析。
[0071]向具有O-GalNAc型糖鏈的糖肽的水溶液(4 μ g/mL、10 μ L)中添加20 μ L的0.45ΜNaOH0 進(jìn)一步，加入 20 μ L 的 0.5Μ PMP 或 20 μ L 的 0.5Μ DTT 或 10 μ L 的 1.0M DTT+10 μ L 的
1.0M DPPMP，85°C下靜置16小時(shí)。反應(yīng)后，分別稀釋反應(yīng)液，與DHB混合，通過MALD1-T0F (/TOF) (UltraFlex I1、Bruker Corporation)進(jìn)行解析。將結(jié)果不于圖 11 和圖 12。
[0072]圖12為向具有O-GlcNAc型糖鏈的糖肽中在堿性條件下加入吡唑啉酮衍生物(DP)和二硫蘇糖醇(DTT)且70°C下加熱16小時(shí)時(shí)的質(zhì)譜。糖鏈只在加入了 DP時(shí)被標(biāo)記，在加入了 DTT時(shí)沒有被標(biāo)記。加入DP和DTT兩者時(shí)，只有DP標(biāo)記體被檢測出。肽在添加了 DTT時(shí)DTT衍生物被檢測出，在添加了 DP時(shí)作為DP衍生物而被檢測出(圖11，上段和中段)。添加了 DTT和DP時(shí)，只有DTT與肽反應(yīng)的物質(zhì)被檢測出；DP直接與肽反應(yīng)的物質(zhì)沒有被檢測出(圖11，下段)。該結(jié)果顯示，糖鏈和肽能夠分別被不同的試劑選擇性標(biāo)記。
[0073][實(shí)施例8]
[0074]將牛胎球蛋白或豬顎下腺粘蛋白分別秤取50 μ g，添加50 μ L的水、100 μ L的0.5ΜDP溶液、50yL的0.6Μ NaOH，70°C下靜置16小時(shí)。反應(yīng)后進(jìn)行中和，將反應(yīng)液的1/4量(50 μ L)通過Dowex50x8和ZipTipC18而將糖鏈部分純化，暫時(shí)干固后，溶解于DHB中，通過MALD1-TOF (/TOF) (UltraFlex I1、Bruker Corporation)進(jìn)行解析。將結(jié)果不于圖 13。
[0075]圖13為對(duì)于已知具有O-連接型糖鏈的牛胎球蛋白和豬顎下腺粘蛋白，使用本法進(jìn)行O-連接型糖鏈的分布分析的結(jié)果。均能夠得到與過去文獻(xiàn)等報(bào)告的結(jié)果定性、定量地相同的結(jié)果，所以可知本法對(duì)于糖蛋白的O-連接型糖鏈的解析是有用的。另外，已知牛胎球蛋白具有O-連接型糖鏈和N-連接型糖鏈兩者，但本法中只檢測出O-連接型糖鏈，N-連接型糖鏈完全沒有檢測出。由該結(jié)果可知，本法對(duì)于N-連接型糖鏈沒有作用，高選擇性作用于O-連接型糖鏈。
[0076][合成例]
[0077]圖14為被新型吡唑啉酮試劑標(biāo)記的糖鏈的質(zhì)譜?？梢源_認(rèn)，使用具有吡唑啉酮骨架的試劑時(shí)，被單衍生物化或者雙衍生物化。圖15、圖16和圖17為新型吡唑啉酮試劑的合成方案圖。
[0078](合成例I)
[0079]向ImM的葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰乳糖胺和殼四糖(Chitotetraose)的混合物10 μ L中添加20 μ L的0.45Μ NaOH。進(jìn)一步，加入20 μ L的0.5Μ合成吡唑啉酮試劑(化合物5或10或14)，85°C下靜置2小時(shí)。反應(yīng)后，分別稀釋反應(yīng)液，與DHB混合,通過MALD1-TOF (/TOF) (UltraFlex II > Bruker Corporation)進(jìn)行解析。
[0080](合成例2)
[0081]將3-肼基苯甲酸(592mg、3.9mmol)溶解于二甲基甲酰胺IOmL中，加入二碳酸二叔丁酯(854mg、3.9mmol)，室溫下反應(yīng)16小時(shí)。將反應(yīng)液用乙酸乙酯提取，用IOmM鹽酸和水進(jìn)行洗滌。將提取液濃縮，得到作為目標(biāo)產(chǎn)物的Boc-3-肼基苯甲酸(980mg、100%)。
[0082]將Boc_3_餅基苯甲酸(491mg、l.95mmol)溶解于甲醇5mL中，加入WSC(560mg>2.93mmol)(溶液I)。在溶液I中加入溶液2)、即將精氨酸甲酯二鹽酸鹽(509mg、l.95mmol)溶解于水2mL中并加入了三乙基胺(395mg、3.9mmol)而成的溶液，室溫下反應(yīng)16小時(shí)。將反應(yīng)液濃縮，用硅膠柱色譜(氯仿:甲醇、9:1 — 5:1)進(jìn)行分離，得到作為目標(biāo)產(chǎn)物的Boc-3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(406mg、49%)。通過MALD1-TOF-MS進(jìn)行解析，在m/z:423.4處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + H]+離子。
[0083]向Boc-3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(386mg、0.91mmol)中加入三氟乙酸4mL,室溫下反應(yīng)I小時(shí)后，將溶劑濃縮，定量地得到作為目標(biāo)產(chǎn)物的3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯。通過MALD1-TOF-MS進(jìn)行解析，在m/z:323.2處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + H]+離子。
[0084]將3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(29mg、0.09mmol)溶解于乙醇ImL,加入IM乙酰乙酸乙酯的乙醇溶液(80yL、0.08mmol)，再加入醋酸200yL，65°C下反應(yīng)30分鐘。將反應(yīng)液濃縮，用硅膠柱色譜(氯仿:甲醇、9:1-5:1)進(jìn)行分離，得到作為最終目標(biāo)產(chǎn)物的3-精氨酸附加吡唑啉酮(21.7mg、70%)。通過MALD1-T0F-MS進(jìn)行解析，在m/z:389.2處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + H]+離子。
[0085](合成例3)
[0086]將4-肼基苯甲酸(1.52g、IOmmol)溶解于二甲基甲酰胺IOmL中，加入二碳酸二叔丁酯(2.18g、IOmmol)，65°C下反應(yīng)I小時(shí)。將反應(yīng)液用乙酸乙酯提取，用IOmM鹽酸和水進(jìn)行洗滌。將提取液濃縮，得到作為目標(biāo)產(chǎn)物的Boc-4-肼基苯甲酸。[0087]將Boc-4-肼基苯甲酸(252mg、1.0Ommol)溶解于甲醇IOmL中，加入4_ (4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉氯化物(295mg、1.0Ommol)(溶液I)。在溶液I中加入溶液2)、即將精氨酸甲酯二鹽酸鹽(261mg、1.0Ommol)溶解于水2mL中并加入了三乙基胺(100 μ L、l.0Ommol)而成的溶液,室溫下反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)液濃縮,用硅膠柱色譜(氯仿:甲醇、9:1 — 5:1)進(jìn)行分離，得到作為目標(biāo)產(chǎn)物的Boc-3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(417mg、99%)。通過MALD1-TOF-MS進(jìn)行解析，在m/z:423.3處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + H] +離子。
[0088]向Boc-4-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(417mg、0.99mmol)中加入三氟乙酸4mL,室溫下反應(yīng)30分鐘后，將溶劑濃縮，定量地得到作為目標(biāo)產(chǎn)物的4-肼基苯甲酰精氨酸甲酯。通過MALD1-TOF-MS進(jìn)行解析，在m/z:323.2處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + H]+離子。
[0089]將4-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(159mg、0.49mmol)溶解于乙醇5mL中，加入IM乙酰乙酸乙酯的乙醇溶液(450yL、0.45mmol)，再加入醋酸1000yL，65°C下反應(yīng)30分鐘。將反應(yīng)液濃縮，用硅膠柱色譜(氯仿:甲醇、9:1 — 5:1)進(jìn)行分離，得到作為最終目標(biāo)產(chǎn)物的
4-精氨酸附加吡唑啉酮(175mg、92%)。通過MALD1-TOF-MS進(jìn)行解析，在m/z:389.2處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + H]+離子。
[0090](合成例4)
[0091]將Boc-4-餅基苯甲酸(117mg、0.46mmol)溶解于甲醇5mL中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉氯化物(137mg、0.47mmol)。加入溶解于二甲基亞砜5mL中的生物素酰肼(I) (100mg、0.39mmol)，室溫下反應(yīng)16小時(shí)。將反應(yīng)液濃縮，用硅膠柱色譜(氯仿:甲醇、9:1-5:1)進(jìn)行分離，得到作為目標(biāo)產(chǎn)物的N-(Boc-4-肼基苯甲?；?-生物素酰肼(2) (120mg、63%)。通過MALD1-TOF-MS進(jìn)行解析，在m/z:515.4處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + Na] +離子。
[0092]向N-(Boc-4-肼基苯甲酰基)-生物素酰肼⑵(120mg、0.24mmol)中加入三氟乙酸4mL，室溫下反應(yīng)30分鐘后，將溶劑濃縮，定量地得到作為目標(biāo)產(chǎn)物的N- (4-肼基苯甲?；?-生物素酰肼(3)。通過MALD1-TOF-MS進(jìn)行解析，在m/z:415.2處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + Na] + 離子。
[0093]將N- (4-肼基苯甲?；?-生物素酰肼(3) (39mg、0.1mmoI)溶解于乙醇ImL中，加入IM乙酰乙酸乙酯的乙醇溶液(90μ L、0.09mmol)，再加入醋酸200 μ L，65°C下反應(yīng)30分鐘。將反應(yīng)液濃縮，用硅膠柱色譜(氯仿:甲醇、9:1 — 5:1)分離，得到作為最終目標(biāo)產(chǎn)物的生物素附加吡唑啉酮(4) (38mg、92%)。通過MALD1-TOF-MS進(jìn)行解析，在m/z:459.4處觀測到目標(biāo)產(chǎn)物的[M + H]+離子。
[0094]產(chǎn)業(yè)h的可利用件
[0095]本發(fā)明成為方法論方面長期以來期望開發(fā)的、對(duì)于O-連接型糖鏈的解析極為有效的方法。另外，對(duì)于現(xiàn)有的、磷酸修飾的解析中一直應(yīng)用的BEMA法，也帶來新的選項(xiàng)。通過本發(fā)明，絲氨酸、蘇氨酸的翻譯后修飾的綜合的解析變得可能，期待對(duì)于生物化學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)、藥物研發(fā)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域做出更大的貢獻(xiàn)。
【權(quán)利要求】
1.一種標(biāo)記劑，其在堿性條件下，從接受了翻譯后修飾的糖蛋白和/或糖肽的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基選擇性切斷翻譯后修飾基，對(duì)絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基和該從氨基酸殘基切斷的翻譯后修飾基中的至少一種進(jìn)行標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記劑，其中，標(biāo)記劑包含吡唑啉酮衍生物、異噁唑酮衍生物、乙內(nèi)酰脲衍生物、羅丹寧衍生物、馬來酰亞胺衍生物中的至少一種作為有效成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2的任一項(xiàng)所述的標(biāo)記劑，其中，吡唑啉酮衍生物為3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮、1，3- 二甲基-吡唑啉酮、3-甲基-1-對(duì)甲苯基-5-吡唑啉酮中的任一種或兩種以上的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3的任一項(xiàng)所述的標(biāo)記劑，其中，翻譯后修飾基為O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖的任一種或兩種以上的修飾基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4的任一項(xiàng)所述的標(biāo)記劑，其中，O-聚糖是由N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖、N-乙酰葡糖胺、木糖、葡萄糖中的任一者作為與O原子結(jié)合的糖而起始的聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5的任一項(xiàng)所述的標(biāo)記劑，其中，O-聚糖是由N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖、木糖、葡萄糖中的任一者作為與O原子結(jié)合的糖而起始并進(jìn)一步結(jié)合糖而延伸的聚糖。
7.一種翻譯后修飾基的切斷方法，其中，將被檢測物質(zhì)的糖蛋白和/或糖肽與權(quán)利要求I?6的任一項(xiàng)所述的標(biāo)記劑溶解或分散于溶劑中，在堿性條件下進(jìn)行加熱，由此從被檢測物質(zhì)的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基選擇性切斷翻譯后修飾基并將其標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的翻譯后修飾基的切斷方法，其中，在切斷的同時(shí)，翻譯后修飾基被標(biāo)記。
9.根據(jù)權(quán)利要求7、8的任一項(xiàng)所述的翻譯后修飾基的切斷方法，其中，在分離的同時(shí)，絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基被標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求7?9的任一項(xiàng)所述的翻譯后修飾基的切斷方法，其中，在使糖蛋白和/或糖肽與標(biāo)記劑溶解在水中的條件下進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求7?10的任一項(xiàng)所述的翻譯后修飾基的切斷方法，其中，與標(biāo)記劑一起利用硫醇化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的翻譯后修飾基的切斷方法，其中，硫醇化合物為二硫蘇糖醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求7?12的任一項(xiàng)所述的翻譯后修飾基的切斷方法，其中，標(biāo)記劑為吡唑啉酮衍生物。
14.一種翻譯后修飾基的解析方法，其特征在于，對(duì)于用權(quán)利要求7?13的任一項(xiàng)所述的方法從被檢測物質(zhì)的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基將翻譯后修飾基切斷并標(biāo)記的該翻譯后修飾基，進(jìn)行液相色譜分析和/或質(zhì)譜分析。
15.一種翻譯后修飾基的解析方法，其特征在于，對(duì)于用權(quán)利要求7?13的任一項(xiàng)所述的方法從被檢測物質(zhì)的絲氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基將翻譯后修飾基切斷并標(biāo)記的被檢測物質(zhì)，進(jìn)行液相色譜分析和/或質(zhì)譜分析。
16.一種翻譯后修飾基的解析方法，其特征在于，同時(shí)進(jìn)行權(quán)利要求14、15的解析。
【文檔編號(hào)】G01N33/66GK103502818SQ201280009068
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月16日
【發(fā)明者】篠原康郎, 武川泰啟, 藤谷直樹, 古川潤一, 坂井秀昭 申請(qǐng)人:創(chuàng)革醫(yī)療科技有限公司, 國立大學(xué)法人北海道大學(xué)