二氧化硅球狀體及親和載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種即使在流通溶液的線流速快的情況下壓力損失也小、結(jié)合容量大的親和載體。一種二氧化硅球狀體，其特征在于，(a)利用激光式光散射法的測定方法中，平均粒徑為30μm～40μm；(b)利用庫爾特計(jì)數(shù)法的測定方法中，粒徑分布的體積換算的累積量從較小側(cè)開始為10％的粒徑(D10)與90％的粒子徑(D90)之比(D10/D90)在1.50以下；(c)利用水銀壓入法的測定方法中，平均細(xì)孔徑在85nm～115nm的范圍內(nèi)，細(xì)孔容積在1.5mL/g以上。
【專利說明】二氧化硅球狀體及親和載體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種二氧化硅球狀體及親和載體。
【背景技術(shù)】
[0002]近年，高精度地純化或除去特定的蛋白質(zhì)在醫(yī)藥領(lǐng)域以及醫(yī)療領(lǐng)域中得到了重視。例如，在純化具有特定功能的藥物的情況下，需要高精度地純化特定的蛋白質(zhì)。
[0003]親和色譜法廣泛使用作為配體有特異結(jié)合性的A蛋白。A蛋白是來源于作為革蘭氏陽性球菌的真細(xì)菌葡萄球菌(Staphylococcus)的蛋白質(zhì),具有與來源于各種動(dòng)物的IgG的Fe區(qū)域特異結(jié)合的性質(zhì)，廣泛使用于IgG的純化。眾所周知將A蛋白固定于不溶性載體上，通過使用該不溶性載體的親和色譜法特異地分離純化IgG的方法。
[0004]在親和色譜法中使用的親和載體中，通常，使稱為連接物(日文d >力一)的結(jié)構(gòu)介于不溶性載體和配體之間，使連接物的一端與載體結(jié)合，并且使連接物的另一端與配體結(jié)合，以此將配體固定在不溶性載體上(專利文獻(xiàn)I)。
[0005]專利文獻(xiàn)2中，提出了通過含有具有大于630A小于1000A的細(xì)孔徑以及大于55 μ m小于70 μ m的平均粒徑的二氧化硅粒子的、適于親和色譜法的實(shí)施的固相載體，提供一種具有改善了的動(dòng)態(tài)容量、在更短的滯留時(shí)間下的大流量的色譜法。然而，在專利文獻(xiàn)2中，如果為了增多二氧化硅粒子的填充量而減小平均二氧化硅粒徑則存在壓力損失上升的問題，如果壓力損失高則線流速的上限受到限制。 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)1:日本專利特開2011-1336號(hào)公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)2:日本專利特開2009-31277號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明所要解決的技術(shù)問題
[0011]本發(fā)明的目的是提供一種即使在流通溶液的線流速快的情況下壓力損失也小、結(jié)合容量大的親和載體。
[0012]解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案
[0013]本發(fā)明的一個(gè)方面為一種二氧化娃球狀體，其特征在于，(a)利用激光式光散射法的測定方法中，平均粒徑為30 μ m~40 μ m ; (b)利用庫爾特計(jì)數(shù)法的測定方法中，粒徑分布的體積換算的累積量從較小側(cè)開始10%的粒徑(DlO)與90%的粒子徑(D90)之比(D10/D90)在1.50以下；(c)利用水銀壓入法的測定方法中，平均細(xì)孔徑在85nm~115nm的范圍內(nèi)，細(xì)孔容積在1.5mL/g以上。
[0014]本發(fā)明的另一方面為一種親和載體，其特征在于，含有所述的二氧化硅球狀體，配體固定于所述的二氧化硅球狀體上。
[0015]發(fā)明的效果[0016]如果采用本發(fā)明，可提供一種即使在流通溶液的線流速快的情況下壓力損失也小、結(jié)合容量大的親和載體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明的一實(shí)施方式的乳化裝置的簡要剖視圖。
[0018]圖2是表示實(shí)施例以及比較例的柱的線流速和壓力損失的關(guān)系的圖。
[0019]圖3是表示實(shí)施例以及比較例的柱的滯留時(shí)間和動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的關(guān)系的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明，但本發(fā)明不受本實(shí)施方式中例示的限定。
[0021]本發(fā)明的一實(shí)施方式的二氧化硅球狀體的特征在于，(a)利用激光式光散射法的測定方法中，平均粒徑為30 μ m~40 μ m ; (b)利用庫爾特計(jì)數(shù)法的測定方法中，粒徑分布的體積換算的累積量從較小側(cè)開始10%的粒徑(DlO)與90%的粒子徑(D90)之比(D10/D90)在1.50以下；(c)利用水銀壓入法的測定方法中，平均細(xì)孔徑在85nm~115nm的范圍內(nèi)，細(xì)孔容積在1.5mL/g以上。如果采用這樣的二氧化硅球狀體，可提供一種即使在流通溶液的線流速快的情況下壓力損失也小、結(jié)合容量大的親和載體。
[0022]如果是相同體積的 柱，雖然認(rèn)為使用平均粒徑更小的二氧化硅球狀體的一方由于單位二氧化硅球狀體的有效容積增加，因而單位載體的作為抗體分子(蛋白質(zhì)等)結(jié)合能力的結(jié)合容量增大，但另一方面也有壓力損失變高的問題。如果采用本發(fā)明，通過使用具備特定的小平均粒徑，并且上述(D10/D90)的比例小的二氧化硅球狀體、即粒徑分布尖銳(日文:? 一彳)的二氧化硅球狀體，可提供低壓力損失且高容量的親和載體。
[0023]另一方面，作為親和載體的基材，如果使用瓊脂糖或聚甲基丙烯酸酯等樹脂類填充劑，由于其柔軟性，壓力損失容易變高，特別是高線流速下壓力損失容易變高。此外，作為親和載體的基材，如果使用粉碎狀的玻璃或陶瓷，由于其形狀的原因，壓力損失容易變高。
[0024]進(jìn)一步，如果采用本實(shí)施方式的二氧化硅球狀體，由于平均粒徑以及(D10/D90)的比例小，平均細(xì)孔徑在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，細(xì)孔容積大，因此可提供結(jié)合容量大的親和載體。通常，認(rèn)為線流速越高則結(jié)合容量降低，但如果采用本實(shí)施方式的二氧化硅球狀體，在高線流速下也可得到大的結(jié)合容量。即，本實(shí)施方式的二氧化硅球狀體在動(dòng)態(tài)結(jié)合容量方面優(yōu)良。進(jìn)一步，由于本實(shí)施方式的二氧化娃球狀體在高線流速壓力損失也低，可進(jìn)一步增大動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。
[0025]這里，結(jié)合容量指靜態(tài)結(jié)合容量(Static Binding Capacity, SBC)和動(dòng)態(tài)結(jié)合容量(Dynamic Binding Capacity, DBC)。靜態(tài)結(jié)合容量表示載體可吸附抗體分子的上限的量，動(dòng)態(tài)結(jié)合容量表示在柱中流動(dòng)著含有抗體分子的溶液的狀態(tài)下，抗體分子可以回收的程度。動(dòng)態(tài)結(jié)合容量大的載體，在高線流速下也可有效地吸附抗體分子，可在短時(shí)間內(nèi)純化抗體分子。
[0026]理想地，如果采用本實(shí)施方式的二氧化硅球狀體，可提供在滯留時(shí)間為I分鐘的高流速區(qū)域(在20cm柱中相當(dāng)于1200cm/小時(shí))下，抗體分子的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量在50mg/mL-柱床以上,更優(yōu)選在60mg/mL-柱床以上,并且,壓力損失在5巴(bar)以下,更優(yōu)選在3巴以下的親和載體。[0027]作為二氧化硅球狀體形狀，如果是球狀則沒有特別的限定，可以是包括正球體以及橢圓體的球狀，從對(duì)柱的填充性、抑制使用時(shí)的壓力損失的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選近似于正球體的形狀。
[0028]作為二氧化硅球狀體的平均粒徑，為30 μ m~40 μ m，優(yōu)選32 μ m~38 μ m，進(jìn)一步優(yōu)選33 μ m~37 μ m。通過使平均粒徑在30 μ m以上，可在將結(jié)合容量保持在較大值的同時(shí)防止壓力損失的上升。此外，通過使平均粒徑在40 μ m以下，可增加各粒子的單位有效容積，增大結(jié)合容量。這里，二氧化硅球狀體的平均粒徑為使用激光式光散射法的測定方法下的體積換算的平均粒徑。具體而言，作為二氧化硅球狀體的平均粒徑，可使用堀場制作所株式會(huì)社(堀場製作所)制“LA-950V2”等進(jìn)行測定。
[0029]在庫爾特計(jì)數(shù)法中，作為粒徑分布的體積換算的累積量從較小側(cè)開始的10%的粒徑(DlO)和粒徑分布的體積換算的累積量從較小側(cè)開始的粒徑90%的粒徑(D90)的比值(D10/D90)(以下，有時(shí)稱為“均勻系數(shù)”)，為1.50以下，優(yōu)選1.40以下，進(jìn)一步優(yōu)選1.35以下。通過使均勻系數(shù)在1.50以下，即使是平均粒徑小的二氧化硅球狀體也可防止壓力損失的增大。此外，均勻系數(shù)越接近I左右粒徑分布越均勻，因而優(yōu)選。
[0030]此處，二氧化硅球狀體的均勻系數(shù)通過利用庫爾特計(jì)數(shù)法的測定方法測定。DlO為在利用庫爾特計(jì)數(shù)法的粒徑分布中，從粒徑小的一側(cè)開始累計(jì)粒徑的體積的情況下，達(dá)到合計(jì)體積的10%時(shí)的粒徑；D90為同樣地累計(jì)體積達(dá)到90%時(shí)的粒徑。由于均勻系數(shù)(D10/D90)是這些粒徑的比值，可由貝克曼庫爾特有限公司O * -一>夕一社)制“Multisizer III”等對(duì)二氧化硅球狀體測定所得的DlO以及D90求得。
[0031]作為二氧化硅球狀體的平均細(xì)孔徑，在水銀壓入法中，為85nm~115nm，優(yōu)選90nm~IlOnm,更優(yōu)選95nm~ 105nm。通過使平均細(xì)孔徑在85nm以上，可提高吸附抗體分子的能力，提供大容量的載體。此外，通過使平均細(xì)孔徑在115nm以下，可在將抗體分子的吸附量保持在較大值的同時(shí)防止二氧化硅球狀體的強(qiáng)度的下降。
[0032]作為二氧化硅球狀體的細(xì)孔容積，在水銀壓入法中，為1.5mL/g以上，優(yōu)選1.55mL/g以上，更優(yōu)選1.6mL/g以上。通過使細(xì)孔容積在1.5mL/g以上，可提高吸附抗體分子的能力，提供大容量的載體。此外，從二氧化硅球狀體強(qiáng)度的觀點(diǎn)考慮，細(xì)孔容積優(yōu)選
1.8mL/g 以下。
[0033]作為二氧化硅球狀體的比表面積，在水銀壓入法中，優(yōu)選55m2/g~75m2/g，更優(yōu)選60m2/g~75m2/g。作為比表面積，可與上述的平均細(xì)孔徑以及細(xì)孔容積一起根據(jù)目的進(jìn)行合理化。由于通過增大比表面積將提高吸附抗體分子的能力，因而是理想的，但如果增大則會(huì)降低二氧化硅球狀體的強(qiáng)度，因此設(shè)定在上述范圍內(nèi)即可。
[0034]這些基于水銀壓入法的細(xì)孔物性可使用島津制作所株式會(huì)社(島津製作所社)制“萊孔度計(jì)Autopore IV9510”等測定。
[0035]作為上述二氧化硅球狀體，可作為親和載體使用。作為親和載體，可使用將上述二氧化硅球狀體包含在內(nèi)作為基材并在該二氧化硅球狀體上固定配體而得的親和載體。作為配體，可使用A蛋白、G蛋白、伴刀豆球蛋白A、抗原、抗體等。
[0036]使用A蛋白作為配體的情況下，親和載體通過使用上述二氧化硅球狀體作為基材，可使A蛋白的固定化量達(dá)到10.0g/L-柱床以上，更理想的為11.0g/L-柱床以上，進(jìn)一步理想的為11.5g/L-柱床以上。[0037]這里，作為A蛋白的固定化量的測定方法，可干燥固定了 A蛋白的載體，對(duì)該載體進(jìn)行元素分析求得。
[0038]如果采用這樣的親和載體，可使滯留時(shí)間為I分鐘的高線流速區(qū)域中(在20cm柱中相當(dāng)于1200cm/小時(shí))的抗體分子的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量在50mg/mL-柱床以上,進(jìn)一步可使其在60mg/mL-柱床以上，并且，壓力損失在5巴以下，進(jìn)一步可使其在3巴以下。此外，作為這樣的親和載體的靜態(tài)結(jié)合容量在80mg/mL-柱床以上,進(jìn)一步可使其在85mg/mL_柱床以上。
[0039]作為壓力損失的測定方法，是在柱內(nèi)填充親和載體，將該柱裝填在色譜裝置中，使蒸餾水以各種線流速通過，求出運(yùn)轉(zhuǎn)壓力。接著，將空柱裝填在色譜裝置中，同樣地使蒸餾水以各種線流速通過，通過將求得的運(yùn)轉(zhuǎn)壓力從之前的填充了親和載體的柱的運(yùn)轉(zhuǎn)壓力中扣除來測定壓力損失。
[0040]作為動(dòng)態(tài)結(jié)合容量，可在柱內(nèi)填充親和載體，將該柱裝填在色譜裝置中，使含有抗體分子的樣品溶液以規(guī)定的線流速在柱內(nèi)通過，測定溶出液的吸光度，由測定到所添加的樣品溶液的吸光度的規(guī)定比例(例如10% )的穿透(日文:O 4夕幻1 —)時(shí)的添加抗體分子的質(zhì)量求得。吸光度可使用島津制作所株式會(huì)社制“UV-1800”等測定。
[0041]此外，作為靜態(tài)結(jié)合容量，可在親和載體中加入含有規(guī)定濃度的抗體分子的溶液，在適當(dāng)?shù)幕旌弦约皵嚢柚?，離心分離，通過測定吸光度使上清液的抗體分子的量少量化，使用朗繆爾曲線法(日文:9 > 7 S 二 7:/ 口 〃卜法)求得。吸光度可使用島津制作所株式會(huì)社制“UV-1800”等測定。
[0042]接著，對(duì)二氧化硅球狀體以及親和載體的制造方法進(jìn)行說明。以下，作為一例，說明上述物性的二氧化硅球狀體的制作、在該二氧化硅球狀體上固定A蛋白的方法。
[0043]作為上述物性的二氧化硅球狀體的制造方法，沒有特別的限定，作為一例，可乳化含有二氧化硅前體的分散相和連續(xù)相，使所得的乳液凝膠化以獲得二氧化硅球狀體。如果有必要，可適當(dāng)進(jìn)行用于增大二氧化硅球狀體的平均細(xì)孔徑以及細(xì)孔容積的處理。
[0044]作為乳化工序，理想的是介由微孔或多孔質(zhì)膜向連續(xù)相供給含有二氧化硅前體的分散相以制作乳液的方法。據(jù)此制作均勻的液滴徑的乳液，作為結(jié)果可獲得均勻系數(shù)在1.5以下的均勻粒徑的二氧化硅球狀體。作為這樣的乳化工序，作為一例可使用微混合器法或膜乳化法。
[0045]以下，對(duì)使用含有二氧化硅前體的水性液體作為含有二氧化硅前體的分散相、使用有機(jī)液體作為連續(xù)相來制作W/0型乳液的例子進(jìn)行說明。另外，也可將有機(jī)液體作為含有二氧化硅前體的分散相、將水性液體作為連續(xù)相來制作0/W型乳液。
[0046]作為含有二氧化硅前體的水性液體，如果可通過凝固形成沉淀物，則均可采用。具體而言，可例舉溶解了水溶性二氧化硅的水溶液、水解有機(jī)硅化合物所得的硅溶膠以及市售的硅溶膠等將固體二氧化硅分散了的水性分散液。尤其優(yōu)選使用堿金屬硅酸鹽的水溶液。作為堿金屬可例舉鋰、鈉、鉀、銣等，其中根據(jù)獲得的容易度、經(jīng)濟(jì)的理由最優(yōu)選鈉。鈉和硅酸的比例以Si02/Na20(摩爾比)計(jì)優(yōu)選2.0~3.8，進(jìn)一步優(yōu)選2.0~3.5。此外，堿金屬硅酸鹽水溶液的濃度以SiO2濃度計(jì)優(yōu)選5~30質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選5~25質(zhì)量％。
[0047]作為有機(jī)液體沒有特別的限定，可使用在水性液體中為不溶性的物質(zhì)，例如，可將以下所例舉的物質(zhì)中的I種或2種以上組合使用。[0048]正己烷、異己烷、正庚烷、異庚烷、正辛烷、異辛烷、壬烷、癸烷等脂肪族烴類，環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)己烯等的脂環(huán)族烴類，苯、甲苯、二甲苯、乙苯、丙苯、異丙苯、均三甲苯、四氫化萘、苯乙烯等芳香族烴類，丙醚、異丙醚等醚類，乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯、乙酸正戊酯、乙酸異戊酯、乳酸丁酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯等酯類等。
[0049]作為有機(jī)液體，優(yōu)選碳數(shù)9~12的飽和烴，綜合考慮操作性、火災(zāi)安全性、凝固粒子與有機(jī)液體的分離性、二氧化硅球狀體的形狀特性、有機(jī)液體在水中的溶解性等進(jìn)行選擇?？蓡为?dú)使用碳數(shù)9~12的飽和烴，也可將其中二種以上混合使用。此外，如果碳數(shù)9~12的飽和烴的化學(xué)穩(wěn)定性良好，可以是直鏈狀烴，也可以是有側(cè)鏈的烴。
[0050]作為碳數(shù)9~12的飽和烴的閃點(diǎn)，優(yōu)選20~80°C，更優(yōu)選30~60°C。在以閃點(diǎn)不足20°C的飽和烴作為有機(jī)液體的情況下，由于閃點(diǎn)過低，需要在防火上、操作環(huán)境上的應(yīng)對(duì)。此外，閃點(diǎn)超過80°C的飽和烴則由于揮發(fā)性小，有附著在得到的二氧化硅球狀體上的烴的量變多的可能性。
[0051]本實(shí)施方式中，乳液凝固之后的二氧化硅球狀體和有機(jī)液體通常固液分離。分離后的二氧化硅球狀體上附著或者吸附的有機(jī)液體優(yōu)選通過過濾操作、清洗操作、干燥操作等進(jìn)行分離。
[0052]本實(shí)施方式中，優(yōu)選在形成W/0型乳液時(shí)，使用表面活性劑。作為表面活性劑，例如，可使用以下所例舉的物質(zhì)中的I種、或者將2種以上組合使用。
[0053]可例舉失水山梨糖醇單硬脂酸酯、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、失水山梨糖醇單油酸酯、失水山梨糖醇三油酸酯等失水山梨糖醇脂肪酸酯類；
[0054]聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇硬脂酸酯等聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯類；
[0055]聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯辛基酚醚、聚氧乙烯壬基酚醚等聚氧乙烯高級(jí)醇醚類；
[0056]聚氧乙烯乙二醇單月桂酸酯、聚氧乙烯乙二醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯乙二醇單油酸酯等聚氧乙烯脂肪族酯類；
[0057]硬脂酸單甘油酯、油酸單甘油酯等甘油脂肪酸酯類等。
[0058]進(jìn)一步，也可使用聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯類、蔗糖脂肪酸酯類、聚甘油脂肪酸酯類聚氧乙烯氫化蓖麻油類等。
[0059]表面活性劑的使用量，根據(jù)表面活性劑種類、表示表面活性劑的親水性或疏水性程度的指標(biāo)HLB (Hydrophile-lipophile balance:親水親油平衡)、目標(biāo)二氧化娃球狀體的粒徑等條件而不同，但優(yōu)選在上述有機(jī)液體中含有500~20000ppm，更優(yōu)選含有1000~lOOOOppm。如果不足500ppm,乳液有變得不穩(wěn)定的可能性。另外,如果超過20000ppm,作為制品的二氧化硅球狀體上附著的表面活性劑量將變多，因此不優(yōu)選。 [0060]理想的是將含有二氧化硅前體的水性液體和有機(jī)液體在室溫(20~23°C )下的體積比值，作為得到的乳液中的W/0比值設(shè)為I~100左右。
[0061]作為乳化工序一個(gè)實(shí)施方式，將含有二氧化硅前體的水性液體通過微孔擠出至以層流流動(dòng)的有機(jī)液體中，可形成以有機(jī)液體為連續(xù)相、其中的含有二氧化硅前體的水性液體的液滴為分散相構(gòu)成的乳液，即w/0型乳液(例如可使用日本專利第4193626號(hào)公報(bào)記載的方法)。
[0062]本實(shí)施方式中，通過使有機(jī)液體的流速在0.001~5m/s，形成液滴徑分布狹窄的乳液液滴，可使得到的二氧化硅球狀體的液滴徑分布也狹窄。進(jìn)一步優(yōu)選有機(jī)液體的流速為0.1~4m/s的情況。
[0063]優(yōu)選使流道中流動(dòng)的有機(jī)液體的雷諾數(shù)(日文:X V > <數(shù))在2100以下。此處，在流道的截面為圓形的情況下雷諾數(shù)以式2計(jì)算，流道的內(nèi)徑D使用流道的截面中的最小徑。這里，D (流道的內(nèi)徑:m)，u (平均流速:m/秒)，P (流體密度:kg/m3)，μ (流體粘度:帕?秒)。
[0064]雷諾數(shù)(一)=D·u·p/y···式2
[0065]另外，在流道的截面不是圓形的情況下雷諾數(shù)以式3計(jì)算。這里，r為流道水力半徑(m)=流道的截面積(m2)/流道截面的與流體接觸的周長(m)，U、P、μ與式2相同。
[0066]雷諾數(shù)(一)=4×r·U·ρ/μ···式3
[0067]在雷諾數(shù)為2100以下的情況下，由于有機(jī)液體流動(dòng)為層流狀態(tài)，有機(jī)液體流動(dòng)穩(wěn)定。其結(jié)果是，由于通過微孔供給的含有二氧化硅前體的水性液體總是構(gòu)成具有一定的液滴徑的W/0型乳液，因此實(shí)質(zhì)上液滴徑均勻的二氧化硅球狀體易于制造。相反地，在雷諾數(shù)超過2100的情況下，由于有機(jī)液體流動(dòng)為紊流，與以往一樣構(gòu)成液滴徑不規(guī)則的W/0型乳液，其結(jié)果是，二氧化硅球狀體的粒徑也不規(guī)則。此外，對(duì)于該有機(jī)液體的流道的形狀沒有特別的限定。
[0068]圖1是表示用于進(jìn)行乳化工序的乳化裝置的一例的簡要剖視圖。圖1中，I以及2是丙烯酸樹脂制部件，3是在蝕刻處理下形成了流道3a的不銹鋼板，4是對(duì)形成了多個(gè)微孔4a的表面進(jìn)行了疏水化處理的不銹鋼板。于是，有機(jī)液體以從連續(xù)相供給部5供給、從連續(xù)層排出部6排出的方式在流道3a以層流狀態(tài)流動(dòng)，含有二氧化硅前體的水性液體從分散相供給部7供給，介由微孔4a被壓入有機(jī)液體中。不銹鋼板3的流道3a，可沿著液體流動(dòng)方向形成多條流道3a。
[0069]圖1所示的例子中，有機(jī)液體的流道以間隔壁劃分形成，通過沿間隔壁的厚度方向貫通的微孔壓入水性液體。藉此，由于水性液體與有機(jī)液體以直角交流(日文:直交流)方式混合，通過有機(jī)液體的流動(dòng)易于得到乳液液滴被切離的效果，因此容易穩(wěn)定得到粒徑小的二氧化硅球狀體。
[0070]此外，優(yōu)選在每個(gè)流道設(shè)置多個(gè)微孔。在該情況下，在有機(jī)液體的流道上，優(yōu)選以與微孔的截面形狀外切的圓的直徑的1/2以上為間隔設(shè)置多個(gè)微孔。進(jìn)一步優(yōu)選以與微孔的截面形狀外切的圓的直徑以上為間隔設(shè)置。如果將微孔的間隔僅僅設(shè)置為短于外切圓的直徑的1/2，則乳液的液滴合并，其結(jié)果是，液滴徑有變得不均勻的可能性，因而不優(yōu)選。但是，在不發(fā)生合并的范圍內(nèi)盡可能密集地設(shè)置則可提高生產(chǎn)性，因而優(yōu)選。
[0071 ] 本實(shí)施方式中，作為設(shè)有微孔的間隔壁的材料，優(yōu)選使用對(duì)含有二氧化硅前體的水性液體以及有機(jī)液體具有耐受性的材料。以金屬為主體的材料由于加工性以及強(qiáng)度優(yōu)良因而優(yōu)選，但也可優(yōu)選使用其它以樹脂為主體的材料。作為樹脂，如果使用選自聚苯硫醚、聚醚醚酮、聚酰亞胺、聚酰胺酰亞胺、芳香族聚酯以及氟樹脂的I種以上，則因加工性、尺寸穩(wěn)定性優(yōu)良而優(yōu)選。
[0072]此外，作為設(shè)置微孔的間隔壁的材料，優(yōu)選為親連續(xù)相(該情況下為親有機(jī)液體)性的材料。因此，在金屬材質(zhì)的情況下，希望通過燒上油(日文:油&焼務(wù)付#3 )、或者與疏水化處理劑進(jìn)行反應(yīng)、用疏水性聚合物進(jìn)行涂覆等方法，實(shí)施使其具有親有機(jī)液體性的處理。這是為了促使含有二氧化硅前體的水性液體通過微孔之后自間隔壁發(fā)生液體分離，使用高速相機(jī)的觀察表明，在間隔壁為親水性的情況下，通過微孔后，水性液體沿著間隔壁流動(dòng)，容易形成大的乳液。
[0073]作為乳化工序的其它實(shí)施方式，也可以使用多孔質(zhì)膜來代替上述微孔。介由多孔質(zhì)膜向有機(jī)液體供給含有二氧化硅前體的水性液體，從而可與微孔同樣地制作均勻的液滴徑的乳液。多孔質(zhì)膜優(yōu)選表面為疏分散相(該情況下為疏水性)的多孔質(zhì)膜。藉此，使含有二氧化娃前體的水性液體成為均勻的液滴分散在有機(jī)液體中。
[0074]作為多孔質(zhì)膜的一例，可例舉多孔質(zhì)玻璃、高分子材料過濾器、金屬燒結(jié)過濾器等。
[0075]作為在乳液中添加膠凝劑獲得二氧化硅球狀體的工序，有從I滴乳液分散相制造I粒二氧化硅球狀體的方法。
[0076]通過將乳液凝膠化，球狀的水溶液的分散液滴在保持該球狀的狀態(tài)下被凝膠化，得到球狀的二氧化硅水凝膠。凝膠化優(yōu)選在乳液中導(dǎo)入膠凝劑的方法。作為膠凝劑，可使用無機(jī)酸或有機(jī)酸等酸，特別地，優(yōu)選作為無機(jī)酸的硫酸、鹽酸、硝酸、碳酸等。從操作的容易性等方面看，最簡便且優(yōu)選的是使用二氧化碳的方法。關(guān)于二氧化碳，可導(dǎo)入100%濃度的純二氧化碳，也可導(dǎo)入空氣或用惰性氣體稀釋了的二氧化碳。凝膠化所需的時(shí)間通常優(yōu)選4~30分鐘，凝膠化時(shí)的溫度優(yōu)選5~30°C。
[0077]凝膠化結(jié)束后，優(yōu)選靜置反應(yīng)體系，使有機(jī)液體的相和含有二氧化硅水凝膠的水性相2相分離來分離硅膠。在使用飽和烴有機(jī)液體的情況下，由于在上層的有機(jī)液體的相和在下部的含有二氧化硅水凝膠的水性液體相發(fā)生分離，因此通過公知的方法分離兩者。
[0078]對(duì)二氧化硅水凝膠的水漿料，根據(jù)需要添加硫酸等酸將pH調(diào)整為I~5左右完成凝膠化，過濾水漿料，水洗得到二氧化硅水凝膠，通過將其在100~150°C左右的溫度下干燥I~30小時(shí)左右，得到二氧化硅球狀體。
[0079]此外，在使用硅酸堿水溶液作為含有二氧化硅前體的水性液體、使用酸作為膠凝劑的情況下，由于生成副產(chǎn)物堿金屬鹽(例如膠凝劑為二氧化碳時(shí)則是碳酸鈉等)，為了防止該鹽混入二氧化硅球狀體，優(yōu)選在過濾的時(shí)候充分水洗二氧化硅水凝膠(濕濾餅)。根據(jù)情況，可在水洗后的濕濾餅中再次添加水使之成為漿料，再次過濾，反復(fù)水洗。此外此時(shí)，根據(jù)需要可將該漿料的PH調(diào)整到I~5左右進(jìn)行再次熟化操作。
[0080]通過上述乳化工序以及凝膠化工序得到的二氧化硅球狀體(以下，有時(shí)稱為“乳化后的二氧化硅球狀體”)具有均勻的粒徑，通過適當(dāng)調(diào)整乳化以及凝膠化的條件，可提供平均粒徑、均勻系數(shù)(D10/D90)、平均細(xì)孔徑以及細(xì)孔容積在上述范圍內(nèi)的二氧化硅球狀體。
[0081]上述得到的二氧化硅球狀體，在乳化工序以及凝膠化工序之后，根據(jù)需要，為了增大平均細(xì)孔徑以及細(xì)孔容積，可進(jìn)一步進(jìn)行以下處理。
[0082]可通過采用以下任一種方法，增大二氧化硅球狀體的平均細(xì)孔徑，例如:將乳化后的二氧化硅球狀體含浸在2~50%磷酸中、于100~700°C加熱處理的方法(磷酸浸潰一加熱處理法，例如日本專利特開平3-23211號(hào)公報(bào)記載的方法);于270~350°C水熱處理的方法(水熱處理法，例如日本專利特公昭和61-20487號(hào)公報(bào)記載的方法)；WNaCl等無機(jī)鹽水溶液填充于硅膠的細(xì)孔內(nèi)，干燥后，于350~1500°C燒成的方法(無機(jī)鹽填充一燒成法，例如日本專利特開昭47-5817號(hào)公報(bào)記載的方法)。
[0083]進(jìn)一步，對(duì)于乳化后的二氧化硅球狀體或者乳化后進(jìn)一步增大了細(xì)孔徑的二氧化硅球狀體，通過使其與堿水溶液或者氟水溶液進(jìn)行接觸，可在保持均勻系數(shù)的狀態(tài)下，增加其平均細(xì)孔徑以及細(xì)孔容積(例如可使用日本專利特開2007-238426號(hào)記載的方法)。
[0084]在堿水溶液的處理中，作為堿，可使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銣、氫氧化銫等堿金屬的氫氧化物，氫氧化鎂、氫氧化鈣、氫氧化鍶、氫氧化鋇等堿土金屬的氫氧化物等強(qiáng)堿。優(yōu)選氫氧化鈉及/或氫氧化鉀。
[0085]使用的堿與硅膠球狀體的質(zhì)量比(堿(OH)質(zhì)量/硅膠原體質(zhì)量)為0.02/1~
0.2/1，優(yōu)選0.05/1~0.15/1左右。如果堿的比例不到以上范圍則不能充分進(jìn)行調(diào)整硅膠原體細(xì)孔物性的反應(yīng)，比例超過以上范圍則難以在控制細(xì)孔物性的同時(shí)進(jìn)行調(diào)整。
[0086]堿水溶液的濃度為0.1~40質(zhì)量％，優(yōu)選0.5~30質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選I~20質(zhì)量％。如果濃度不到以上范圍則不能充分獲得堿的使硅膠原體細(xì)孔物性增加的作用，此外如果濃度超過以上范圍則反應(yīng)過度，難以控制細(xì)孔物性。此外，堿水溶液中的硅膠原體的漿料濃度例如為I~60質(zhì)量％，優(yōu)選2~50質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選3~40質(zhì)量％。
[0087]反應(yīng)溫度為5~100°C，優(yōu)選10~80°C，進(jìn)一步優(yōu)選20~50°C左右。此外，可不用特地進(jìn)行加溫或冷卻，以室溫進(jìn)行反應(yīng)。
[0088]處理時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間)可根據(jù)堿水溶液的濃度、反應(yīng)溫度、堿質(zhì)量和硅膠原體質(zhì)量t匕、漿料濃度等因素變化，但通常在I分鐘~50小時(shí)，優(yōu)選10分鐘~40小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選30分鐘~30小時(shí)，最優(yōu)選I~24小時(shí)左右。
[0089]將處理工序結(jié)束后的漿料通過過濾或離心分離進(jìn)行固液分離，將分離后的硅膠餅置于攪拌槽中，使之再次分散于水中，添加硫酸、鹽酸、硝酸等適當(dāng)?shù)乃崾筆H達(dá)到I~3左右，在漿料狀態(tài)下攪拌0.1~2小時(shí)，充分清洗堿。根據(jù)需要，進(jìn)一步通過將其過濾、清洗、干燥，得到調(diào)整了細(xì)孔物性的二氧化硅球狀體。
[0090]可使用氟化氫水溶液代替上述堿水溶液。使用氟化氫水溶液的情況下，可與上述使用堿水溶液的情況同樣處理。
[0091]使用的氟化氫與硅膠原體的質(zhì)量比(氟化氫質(zhì)量/硅膠原體質(zhì)量)為0.1/1~
1.8/1，優(yōu)選0.2/1~1.6/1左右。此外，氟化氫水溶液的濃度為0.01~20質(zhì)量％，優(yōu)選0.5~15質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選I~10質(zhì)量％。在氟化氫水溶液的濃度在上述范圍中的情況下，可適度控制細(xì)孔物性。
[0092]作為將A蛋白固定于上述二氧化硅球狀體的工序，可通過使稱為連接物的結(jié)構(gòu)介于二氧化硅球狀體和配體之間，使連接物的一端與二氧化硅球狀體結(jié)合，并且使連接物的另一端與配體結(jié)合，以此將配體固定在二氧化硅球狀體上。
[0093]以下，作為一例，對(duì)使二氧化硅球狀體和含有環(huán)氧基的化合物進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)一步與A蛋白反應(yīng)的方法進(jìn)行說明。
[0094]通過使二氧化硅球狀體與含有環(huán)氧基的化合物進(jìn)行反應(yīng)，可在二氧化硅球狀體表面固定含有環(huán)氧基的化合物，形成連接物。連接物在末端具有環(huán)氧基。
[0095]作為含有環(huán)氧基的化合物，優(yōu)選使用具有環(huán)氧基的硅烷偶聯(lián)劑。作為含有環(huán)氧基的硅烷偶聯(lián)劑，可使用Y-環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、Y-環(huán)氧丙氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、β _(3，4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷等。
[0096]作為使二氧化硅球狀體與含有環(huán)氧基的化合物進(jìn)行反應(yīng)的方法，沒有特別的限定，例如，可使用在溶劑中加熱二氧化硅球狀體和含有環(huán)氧基的化合物的方法。反應(yīng)溫度例如為30~400°C左右，優(yōu)選100~300°C。反應(yīng)時(shí)間例如為0.5~40小時(shí)左右，優(yōu)選3~20小時(shí)。
[0097]作為溶劑，只要是不與含有環(huán)氧基的化合物發(fā)生反應(yīng)，且在反應(yīng)溫度下穩(wěn)定的物質(zhì)，就沒有特別的限定。從含有環(huán)氧基的化合物的溶解性、沸點(diǎn)，進(jìn)一步與其它溶劑的親和性(即清洗時(shí)的除去性)等觀點(diǎn)考慮，通常，可使用苯、甲苯、二甲苯、辛烷、異辛烷、四氯乙烯、氯苯、溴苯等。此外，反應(yīng)操作可在溶劑的回流下進(jìn)行。
[0098]含有環(huán)氧基的化合物的固定化量，通常越多，即達(dá)到致密覆蓋二氧化硅球狀體表面整體的量，可提高二氧化硅球狀體的耐堿性，從該觀點(diǎn)考慮是優(yōu)選的。具體而言，優(yōu)選以使每Ig 二氧化硅球狀體上的含有環(huán)氧基的化合物的量(含有環(huán)氧基的化合物的固定化量除以二氧化硅球狀體的質(zhì)量而得的值)達(dá)到220 μ mol/g以上的條件進(jìn)行反應(yīng)。含有環(huán)氧基的化合物的固定化量更優(yōu)選220~320 μ mol/g，特別優(yōu)選240~300 μ mol/g。
[0099]此外，含有環(huán)氧基的化合物的固定化量可基于公知的方法求出。例如，對(duì)于將含有環(huán)氧基的化合物固定后的硅膠，利用元素分析法測得碳含有率，基于該測得的碳含有率，使用I分子含有環(huán)氧基的 化合物所含的碳的量以及二氧化硅球狀體質(zhì)量，可算出含有環(huán)氧基的化合物的固定化量。
[0100]在二氧化硅球狀體和含有環(huán)氧基的化合物的反應(yīng)體系中，進(jìn)一步，可混合三乙胺、吡啶、二異丙基乙胺等胺化合物。藉此，通過胺的催化作用，促進(jìn)二氧化硅球狀體和含有環(huán)氧基的化合物的反應(yīng)。
[0101]接著，將A蛋白固定在導(dǎo)入了連接物的二氧化硅球狀體上。作為A蛋白，可使用具有賴氨酸氨基的A蛋白。其中,可優(yōu)選使用重組蛋白A。
[0102]作為使配體結(jié)合在上述二氧化硅球狀體的連接物結(jié)構(gòu)上的方法，此處沒有特別的限定，可將二氧化硅球狀體和含有A蛋白的溶液混合，使用適當(dāng)催化劑和反應(yīng)試劑等在適當(dāng)?shù)娜軇┫逻M(jìn)行反應(yīng)。在連接物結(jié)構(gòu)和配體的反應(yīng)中，例如，反應(yīng)溫度可為20~30°C，反應(yīng)時(shí)間可為I~24小時(shí)。反應(yīng)體系的pH優(yōu)選8~9.5，可通過緩沖液調(diào)整。
[0103]作為A蛋白的摻合量，單位填充容積優(yōu)選相當(dāng)于10.0mg/mL-柱床以上的量，更優(yōu)選11.5mg/mL-柱床以上。
[0104]此外，為了使連接物結(jié)構(gòu)中殘留的環(huán)氧基失活，在配體結(jié)合了二氧化硅球狀體之后，優(yōu)選使用乙醇胺和三羥甲基氨基甲烷(日文:卜U 7 )進(jìn)行反應(yīng)，或者以酸性水溶液進(jìn)行處理。
[0105]作為反應(yīng)后的后處理，沒有特別的限制，可通過過濾以及清洗等通常采用的方法進(jìn)行。
[0106]此外，固定化配體的載體，優(yōu)選以pH5~6于4~8 °C冷藏保存，進(jìn)一步作為防腐劑
可添加丙二醇等。[0107]作為A蛋白的固定化量，優(yōu)選使單位填充容量的A蛋白的量(A蛋白的固定化量除去填充容量后的值)在10mg/mL-柱床以上進(jìn)行反應(yīng)。A蛋白的固定化量更優(yōu)選為11.5mg/mL-柱床以上。
[0108]A蛋白的固定化量可基于公知的方法求出。例如，由摻合了的A蛋白溶液的濃度，和使該溶液與二氧化硅球狀體混合、結(jié)合了 A蛋白后、分離二氧化硅球狀體所得的A蛋白溶液的濃度的差，可計(jì)算在二氧化硅球狀體上固定化了的量。溶液濃度可通過光學(xué)方法測定。
[0109]在用上述親和載體實(shí)施色譜法的情況下，將親和載體填充于柱中使用。作為柱可適當(dāng)使用玻璃制、不銹鋼制、樹脂制等的柱。
[0110]實(shí)施例
[0111]以下，通過實(shí)施例對(duì)進(jìn)行本發(fā)明詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限定于此。在以下的說明中，共通成分使用相同物質(zhì)。此外，關(guān)于沒有特別描述的成分，使用關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社(関東化學(xué)社)制的產(chǎn)品。
[0112](制造例I)實(shí)施例的親和載體的制作
[0113](1)分散相以及連續(xù)相的制備
[0114]作為分散相，將3號(hào)硅酸鈉(AGC S1-Tech株式會(huì)社(AGC工^ 4 f 夕社)制)用水稀釋，制備SiO2濃度為16.9質(zhì)量％、Na2O濃度為6.13質(zhì)量％ (Si02/Na20摩爾比=
2.85)、比重1.222的硅酸鈉溶液。
[0115]作為連續(xù)相，制備在比重0.73的直鏈飽和烴癸烷(CltlH22,東曹株式會(huì)社(東乂一社)制)中溶解有作為表面活性劑的1.0質(zhì)量％的失水山梨糖醇單油酸酯(三洋化成工業(yè)株式會(huì)社(三洋化成工業(yè)社)制)而得的溶液。
[0116](2)乳化裝置的制作
[0117]用于乳化分散相和連續(xù)相的乳化裝置示于圖1。
[0118]圖1所示的乳化裝置中，I以及2是丙烯酸樹脂制部件，3是在蝕刻處理下形成了流道(微通道)3a的不銹鋼板，4是形成了多個(gè)微孔4a的不銹鋼板。于是，連續(xù)相以從連續(xù)相供給部5供給、從連續(xù)相排出部6排出的方式在流道3a以層流狀態(tài)流動(dòng)，硅酸鈉溶液構(gòu)成的分散相從分散相供給部7供給，介由微孔4a被壓入連續(xù)相中。
[0119]通過蝕刻以并列配置2條流道3a的方式對(duì)不銹鋼板3進(jìn)行加工。2條流道3a分別為 3.0mm(寬)X0.15mm(厚)X63mm(長)。
[0120]對(duì)于不銹鋼板4，通過激光加工，以每I條流道3a上有橫向26個(gè)X縱向510個(gè)=總計(jì)13260個(gè)從排出口側(cè)的面可見的孔直徑14 μ m的微孔4a的方式進(jìn)行加工。不銹鋼板4上，為了使其表面具有拒水性，使用溶劑可溶型氟樹脂(旭硝子株式會(huì)社(旭硝子社)制:CYTOP CTL-102AE)涂覆表面。
[0121](3)乳化后的二氧化硅球狀體的制作
[0122]將上述(2)所制作的乳化裝置水平放置進(jìn)行使用，從連續(xù)相供給部5供給上述1)所制備的連續(xù)相，從分散相供給部7通過微孔4a供給上述(1)所制備的由硅酸鈉溶液構(gòu)成的分散相，從而連續(xù)制造將硅酸鈉溶液分散于連續(xù)相中的W/0型乳液。此時(shí)，連續(xù)相的供給量在每I流道3a中為642mL/小時(shí)，流道中流動(dòng)方向的流速為3m/秒。實(shí)驗(yàn)于常溫下進(jìn)行，此時(shí),分散相的供給量在每一個(gè)微孔4a中為10.4 μ L/小時(shí)。
[0123]接著，在攪拌得到的乳液的同時(shí)供給15分鐘二氧化碳，使二氧化硅球狀體析出。進(jìn)一步，加水與連續(xù)相分離后，添加20質(zhì)量％的硫酸，除去CO2后，水洗干燥，得到乳化后的二氧化硅球狀體。
[0124]得到的乳化后的二氧化硅球狀體的物性如下所示，具有均勻的粒徑。
[0125]平均粒徑:40.6μπι
[0126]均勻系數(shù)(D10/90):L 31
[0127]平均細(xì)孔徑:15.6nm
[0128]細(xì)孔容積:1.16mL/g
[0129]比表面積:298m2/g
[0130]此處，作為測定方法，利用激光式光散射法使用LA-950V2 (堀場制作所株式會(huì)社(堀場製作所社)制)測定平均粒徑。此外，使用Multisizer III (貝克曼庫爾特有限公司制)利用庫爾特計(jì)數(shù)法測定DlO粒徑以及D90粒徑，由其比值(D10/D90)求得均勻系數(shù)。
[0131]此外，平均細(xì)孔徑、細(xì)孔容積以及比表面積通過使用Autopore IV9510(島津制作所株式會(huì)社制)利用水銀壓入法測定。以下相同。
[0132](4) 二氧化硅球狀體的制作
[0133]在上述乳化工序所得的乳化后的二氧化硅球狀體34.5g中，以相對(duì)于SiO2達(dá)到0.7質(zhì)量％的條件添加1.5質(zhì)量％的氯化鈉(NaCl)水溶液，于180°C干燥一晝夜。將其投入坩鍋，于180°C保持6.5小時(shí)后，于730°C進(jìn)行13小時(shí)的燒成。為了除去多余的鈉成分，用18%的鹽酸水溶液進(jìn)行2小時(shí)的回流處理。過濾、清洗后，在規(guī)定量的0.85M的氫氧化鈉(NaOH)水溶液中以25°C浸潰24小時(shí)。過濾后，以pHl.5的硫酸水溶液清洗，得到二氧化硅球狀體的最終產(chǎn)品。
[0134]得到的二氧化硅球狀體的物性如下。
[0135]平均粒徑:34.4μηι
[0136]均勻系數(shù)(D10/90):L 31
[0137]平均細(xì)孔徑:105.0nm
[0138]細(xì)孔容積:1.64mL/g
[0139]比表面積:60m2/g
[0140](5)連接物的導(dǎo)入
[0141]在得到的二氧化硅球狀體IOg中加入80mL甲苯、4.62mL 二異丙基乙胺、6.0OmL的Y _環(huán)氧丙氧基丙基二甲氧基硅烷，回流4.5小時(shí)。放直冷卻后，過濾，以200mL甲苯、IOOmL四氫呋喃(THF)、130mL甲醇清洗，于70°C干燥。
[0142]對(duì)于得到的二氧化硅球狀體每Ig中的連接物固定化量，使用全自動(dòng)元素分析裝置(CHNS/0) 240011(珀金埃爾默股份有限公司(Perkin Elmer社)制)進(jìn)行元素分析，結(jié)果如下所示。
[0143]連接物固定化量:260 μ mol/g
[0144](6)配體的導(dǎo) 入
[0145]在得到的導(dǎo)入連接物的二氧化硅球狀體4g中加入0.2M碳酸氫鹽緩沖液、以及相當(dāng)于單位填充容積12mg/mL-柱床的重組蛋白A(利用U.S.5084559號(hào)公報(bào)中記載的方法制作)，于室溫?cái)嚢?小時(shí)。過濾、水洗后，在16mL的0.5質(zhì)量％的鹽酸水溶液中于室溫下浸潰一晝夜，使殘留的環(huán)氧基失活。過濾后，以130mL磷酸緩沖生理食鹽水(PBS，pH7.4)、130mL檸檬酸緩沖液(pH2.2)清洗，再以130mL的PBS、60mL的50mM NaOH水溶液、130mL蒸餾水清洗。在含有1%芐醇的0.1M乙酸緩沖液(pH5.2)中冷藏保存。
[0146]將得到的親和載體干燥，對(duì)A蛋白的配體固定化量使用全自動(dòng)元素分析裝置(CHNS/0) 2400II (珀金埃爾默股份有限公司制)進(jìn)行元素分析，結(jié)果單位填充容積如下所
/Jn ο
[0147]配體固定化量:11.5mg/mL_柱床
[0148]此外，靜態(tài)結(jié)合容量(SBC)如下所示。作為靜態(tài)結(jié)合容量，在A蛋白固定化載體
0.1mL-柱床中加入初始濃度為O~1.82mg/mL的多克隆human IgG溶液(西格瑪奧德里奇公司( '> 夕''7 7 A K -j ^ f社)制)，在室溫下用旋轉(zhuǎn)混合器(日文:口一夕〗J 一$今寸一)攪拌一晝夜，離心分離后，通過上清液的280nm吸光度測定(UV-1800 (島津制作所社制))定量殘留的IgG濃度，使用朗繆爾曲線法算出。
[0149]靜態(tài)結(jié)合容量(SBC):88mg/mL-柱床 [0150](制造例2)比較例的親和載體的制作
[0151]在根據(jù)上述制造例I的實(shí)施例的親和載體的制作中，除了作為二氧化硅球狀體的最終產(chǎn)品使用AGC S1-Tech公司制“M.S.GEL.SIL D-50-1000AW”以外，進(jìn)行同樣的操作，制作親和載體。
[0152]使用的二氧化硅球狀體“M.S.GEL.SIL D-50-1000AW”的物性如下所示。
[0153]平均粒徑:45.7μπι
[0154]均勻系數(shù)(D10/90):1.93
[0155]平均細(xì)孔徑:99.0nm
[0156]細(xì)孔容積:1.78mL/g
[0157]比表面積:71m2/g
[0158]此外，親和載體的物性如下所示。
[0159]配體固定化量:11.6mg/mL-柱床
[0160]靜態(tài)結(jié)合容量(SBC):74mg/mL-柱床
[0161](實(shí)施例1)
[0162]作為實(shí)施例1，將以上述制造例I制作的親和載體填充于內(nèi)徑5mmX長200mm的玻璃制柱中，制作親和色譜法用柱。
[0163](比較例I~3)
[0164]作為比較例1，除了使用以制造例2制作的比較例的親和載體以外，其它與上述實(shí)施例I 一樣，制作親和色譜法用柱。
[0165]作為比較例2，除了使用市售的瓊脂糖類載體(MabSelect SuRe, GE醫(yī)療公司(GEHealthcare社)制)以外，其它與上述實(shí)施例1 一樣，制作親和色譜法用柱。
[0166]作為比較例3，除了使用市售的CPG(受控微孔玻璃(日文>卜π— ;7 — 7 ^ ))類載體(Prosep Ultra Plus，密理博有限公司(Millipore社)制)以外，其它與
上述實(shí)施例1 一樣，制作親和色譜法用柱。
[0167]〈評(píng)價(jià)〉
[0168]測定在實(shí)施例1以及比較例I~3的柱中流通水的情況下的線流速和壓力損失的關(guān)系。結(jié)果示于圖2中。[0169]將親和載體填充于內(nèi)徑5mmX長200mm的玻璃制柱中，將柱裝填于色譜裝置“AKTAexplorerlOS^GE醫(yī)療公司制)，在各種線流速下流通蒸餾水，求出運(yùn)轉(zhuǎn)壓力A。接著，除了不在柱內(nèi)填充親和載體外進(jìn)行同樣的操作，求出運(yùn)轉(zhuǎn)壓力B。在各線流速下從運(yùn)轉(zhuǎn)壓力A減去運(yùn)轉(zhuǎn)壓力B，求出壓力損失。
[0170]如圖2所示，實(shí)施例1 (以實(shí)線表示近似直線)與比較例I (以點(diǎn)虛線表示近似直線)顯示出相同的壓力損失，在相當(dāng)于滯留時(shí)間為I分鐘的1200cm/小時(shí)的高線流速下顯示出3巴以下的低壓力損失。雖然實(shí)施例1的二氧化硅球狀體與比較例I相比平均粒徑更小，但由于均勻系數(shù)小，可將壓力損失抑制在低水平。另一方面，瓊脂糖類載體的比較例
2(以雙點(diǎn)劃線表示近似直線)在同樣的線流速下有10巴以上的高壓力損失，CPG類載體的比較例3(以長虛線表示近似直線)在同樣的線流速下有3巴以上壓力損失。
[0171](實(shí)施例2)
[0172]作為實(shí)施例2，將上述制造例I的親和載體填充于內(nèi)徑5mmX長50mm的玻璃制柱中，制作親和色譜法用柱。
[0173](比較例4~8)
[0174]作為比較例4，除了使用以制造例2制作的親和載體以外，其它與上述實(shí)施例2 —樣，制作親和色譜法用柱。
[0175]作為比較例5，除了使用市售的瓊脂糖類載體(MabSelect Xtra, GE醫(yī)療公司制)以外，其它與上述實(shí)施例2 —樣，制作親和色譜法用柱。 [0176]作為比較例6，除了使用市售的瓊脂糖類載體(MabSelect SuRe, GE醫(yī)療公司制)以外，其它與上述實(shí)施例2 —樣，制作親和色譜法用柱。
[0177]作為比較例7，除了使用市售的瓊脂糖類載體(MabSelect SuRe XL，GE醫(yī)療公司制)以外，其它與上述實(shí)施例2 —樣，制作親和色譜法用柱。
[0178]作為比較例8，除了使用市售的CPG(受控微孔玻璃)類載體(Pros印Ultra Plus,密理博有限公司制)以外，其它與上述實(shí)施例2 —樣，制作親和色譜法用柱。
[0179]< 評(píng)價(jià) >
[0180]按照以下順序測定動(dòng)態(tài)結(jié)合容量(DBC)，結(jié)果示于圖3中。將實(shí)施例2以及比較例5~8的柱裝填于色譜裝置“AKTA explorerlOS" (GE醫(yī)療公司制)，在各柱中以各種線流速流通含有0.5mg/mL多克隆human IgG的PBS(pH7.4)。對(duì)流通的含有0.5mg/mL多克隆human I gG的PBS (pH7.4)，在溶出液的吸光度穿透IO %的時(shí)刻，求出添加的多克隆humanIgG的質(zhì)量，算出動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。
[0181]如圖3所示，實(shí)施例2的柱與比較例4~8相比，顯示出高動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。在滯留時(shí)間為I分鐘的高線流速區(qū)域中，瓊脂糖類載體的比較例5~7為20~30mg/mL-柱床，CPG類載體的比較例8以及制造例2的柱的比較例4為約40mg/mL-柱床，相對(duì)于此，實(shí)施例
2的柱顯示出約60mg/mL-柱床的高性能。
[0182]產(chǎn)業(yè)上利用的可能性
[0183]本發(fā)明的二氧化硅球狀體，可用于前述的在二氧化硅球狀體上固定有配體的結(jié)合容量大的親和載體的制造。
[0184]這里引用2011年10月28日提出申請(qǐng)的日本專利申請(qǐng)2011-237204號(hào)的說明書、權(quán)利要求書、附圖和摘要的全部內(nèi)容作為本發(fā)明的說明書的揭示。[0185]符號(hào)說明
[0186]I丙烯酸樹脂制板
[0187]2丙烯酸樹脂制板
[0188]3不銹鋼板
[0189]3a流道
[0190]4不銹鋼板
[0191]4a微孔
[0192]5連續(xù)相供給部
[0193]6連續(xù)相排出部
[0194]7分散相供給部
【權(quán)利要求】
1.一種二氧化硅球狀體，其特征在于， (a)利用激光式光散射法的測定方法中，平均粒徑為30μ m~40 μ m ; (b)利用庫爾特計(jì)數(shù)法的測定方法中，粒徑分布的體積換算的累積量從較小側(cè)開始為10%的粒徑DlO與90%的粒徑D90之比、即D10/D90在1.50以下； (c)利用水銀壓入法的測定方法中，平均細(xì)孔徑在85nm~115nm的范圍內(nèi)，細(xì)孔容積在1.5mL/g 以上。
2.如權(quán)利要求1所述的二氧化硅球狀體，其特征在于，所述的粒徑分布的體積換算的累積量從較小側(cè)開始為10%的粒徑DlO與90%的粒子徑D90之比、即D10/D90在1.35以下。
3.如權(quán)利要求1或2所述的二氧化硅球狀體，其特征在于，所述的平均粒徑為33μ m~37 μ m0
4.如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的二氧化娃球狀體,其特征在于,具有55m2/g~75m2/g的比表面積。
5.一種親和載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的二氧化娃球狀體，且在所述的二氧化硅球狀體上固定有配體。
6.如權(quán)利要求5所述的親和載體，其特征在于，配體為A蛋白，該A蛋白的固定化量在I Omg/mL-柱床以上 。
7.如權(quán)利要求5所述的親和載體，其特征在于，具有50mg/mL-柱床以上的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103906708SQ201280052688
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】宮原浩嘉, 中島亮, 東賢志 申請(qǐng)人:旭硝子硅素技術(shù)株式會(huì)社