一種定量鑒定麥芽汁中混濁物質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量鑒定麥芽汁中混濁物質(zhì)的方法，是以麥芽汁作為樣品，先對(duì)麥汁離心，沉淀冷凍干燥；然后測(cè)定凍干粉中的蛋白質(zhì)、總糖及總多酚含量；并采用質(zhì)譜手段鑒定蛋白質(zhì)；采用色譜手段進(jìn)行氨基酸分析、單糖組成分析及多糖分子量的測(cè)定；采用紅外光譜對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。本發(fā)明采用定量的方法明確了麥芽汁混濁物質(zhì)的組成情況，確定引起江蘇啤酒大麥麥芽的混濁成分主要為低分子量（1000Da左右）的葡聚糖，這些葡聚糖的產(chǎn)生是由于內(nèi)源外切葡聚糖酶的不足導(dǎo)致的，本結(jié)果可以指導(dǎo)大麥育種人員和麥芽制造人員控制大麥及其制麥過(guò)程中的內(nèi)源外切葡聚糖酶，促進(jìn)葡聚糖的降解，提高麥芽的釀造質(zhì)量，具有積極的意義。
【專利說(shuō)明】一種定量鑒定麥芽汁中混濁物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種定量鑒定麥芽汁中混濁物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)啤酒產(chǎn)量已連續(xù)多年位居世界第一，但是與此同時(shí)，我國(guó)啤酒麥芽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展卻一直不盡人意。究其原因，由于地理氣候、品種、生產(chǎn)工藝等條件的差異，國(guó)產(chǎn)麥芽各種酶系活力不足，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、半纖維素等物質(zhì)降解不充分，其中糖化后的麥汁濁度過(guò)高是其突出的質(zhì)量缺陷之一，造成國(guó)產(chǎn)麥芽無(wú)法用于生產(chǎn)高端啤酒，或使用量受到很大限制。目前對(duì)于麥汁混濁物質(zhì)的鑒定，多以染料染色后顯微觀察為主，這種方法不能準(zhǔn)確了解麥汁中混濁物質(zhì)的組成情況，因而無(wú)法根據(jù)實(shí)際情況解決麥汁濁度過(guò)高的問題。
[0003]與此同時(shí)，由于濁度這一指標(biāo)在國(guó)標(biāo)《啤酒麥芽》(QB/T1686-2008)中未做要求，因此未引起育種人員的重視，而麥芽行業(yè)的技術(shù)層次稍微偏低，且麥芽企業(yè)利潤(rùn)微薄，沒有足夠的科研人員和資金投入，因此，這些缺陷導(dǎo)致以江蘇地產(chǎn)啤酒大麥麥芽為主的部分國(guó)產(chǎn)麥芽在啤酒釀造中用量較低，且主要用于中、低檔酒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了 一種定量檢測(cè)麥汁混濁物質(zhì)的方法。
[0005]為解決上述問題，提供技術(shù)方案如下:1)過(guò)濾后的麥芽汁離心收集沉淀物質(zhì)，沉淀物質(zhì)進(jìn)行冷凍干燥；2)分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量、總糖含量、多酚含量；3)取凍干粉，溶含有SDS和β -巰基乙醇的尿素中，離心去除不溶部分，上清液進(jìn)行SDS-PAGE ；4)切取SDS-PAGE電泳膠上的目標(biāo)條帶，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化之后，通過(guò)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定；4)取凍干粉，用鹽酸在110°C真空條件下水解，水解液經(jīng)過(guò)濾、離心后用高效液相色譜法測(cè)定氨基酸含量；5)取凍干粉，加蒸餾水和HCl于沸水浴中水解，冷卻至室溫后加NaOH中和，離心，過(guò)濾膜，用高效陰離子交換色譜分析單糖含量；6)取凍干粉，溶于蒸餾水，離心去除不溶物，取上清，用高效體積排阻色譜分析多糖分子量；7)取凍干粉，用傅里葉紅外光譜儀分析多糖結(jié)構(gòu)。
[0006]本發(fā)明具體技術(shù)方案如下:
[0007]I)過(guò)濾后的麥汁離心，12000r/min離心30min后，棄去上清，沉淀物質(zhì)冷凍干燥；
[0008]2)采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定總多酹含量；
[0009]3)蛋白質(zhì)的鑒定方法:稱取IOmg凍干粉，溶于500yL8mol/L尿素(含有1% (ff/V)SDS、1% (V/V) β-巰基乙醇)中，離心去除不溶部分，上清依照Laemmli的方法進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠和濃縮膠的聚丙烯酰胺終濃度分別為12.5%(w/v)和5%(w/v)，用考馬斯亮藍(lán)染色，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白為:β -半乳糖苷酶(116kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵清蛋白(45.0kDa)、乳酸脫氫酶(35.0kDa)、REaseBsp981 (25.0kDa)、β -乳球蛋白(18.4kDa)和溶解酵素(14.4kDa);切取 SDS-PAGE 電泳膠上的目標(biāo)條帶，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化之后，通過(guò)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBInr)檢索(http://www.matrixscience.com/)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定；
[0010]4)氨基酸含量分析:稱取凍干粉約0.15g，精確到0.0lg，用6mol/L鹽酸在110°C真空條件下水解22h，水解液經(jīng)過(guò)濾、離心后用高效液相色譜法測(cè)定氨基酸含量；色譜柱:HYPERSIL OSD色譜柱(250mmX 4.6mm, 5 μ m);柱溫:40°C ;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng):338nm ;流動(dòng)相A =IOOOmL0.8%乙酸鈉溶液與225mL三乙胺混合后用5%醋酸將pH調(diào)至7.20±0.05，加入5mL四氫呋喃，混合；流動(dòng)相B:用2%醋酸將400mL2%乙酸鈉溶液的pH調(diào)至7.20±0.05，加入800mL乙腈和800mL甲醇,混合；流速:1.0mL/min ;梯度洗脫條件:0?27.5min,92%A、8%B ；27.5 ?32min，40%A、60%B ；32 ?35.5min,100%B ；
[0011]5)單糖組成分析:稱取IOmg凍干粉,加4ml蒸懼水和4ml4mol/L HCl,于沸水浴中水解lh，冷卻至室溫后加4ml4mol/L NaOH中和，離心，過(guò)0.45 μ m濾膜，用高效陰離子交換色譜分析單糖含量；色譜柱=CarboPac PA20 ;檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器；流動(dòng)相A:水；流動(dòng)相B:250mmol/L NaOH ;流動(dòng)相C:lmol/L NaAc ;流速:0.5mL/min ;梯度洗脫條件:0?21.1min, 98.2%Α、1.8%Β ；21.1 ?30min，93.2%Α、1.8%B、5%C ；30 ?30.lmin, 78.2%Α、1.8%Β、20%C ；30.1 ?50min，20%A、80%B ；
[0012]6)多糖分子量測(cè)定:稱取IOmg凍干粉，溶于ImL蒸餾水，離心去除不溶物，取上清，用高效體積排阻色譜(HPSEC)分析多糖分子量；色譜柱:Ultrahydr0gelTMLinear(300mmX7.8mm 1.d.)，兩根串聯(lián)；檢測(cè)器:視差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相:0.lmol/L NaNO3 ;流速:0.9mL/min ;柱溫:45°C ；
[0013]7)多糖結(jié)構(gòu)分析:取凍干粉，用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行分析；
[0014]稱取凍干粉2mg與IOOmg KBr混合，研磨均勻，壓片，測(cè)定紅外光譜，并用空片做空白；分辨率:0.5?16cm—1 ;測(cè)試波數(shù)范圍:4000?400cm—1 ;波數(shù)精度:< 0.0lcnT1 ;掃描次數(shù)，32。
[0015]本發(fā)明有益效果:確定引起江蘇啤酒大麥麥芽的混濁成分主要為低分子量(IOOODa左右)的葡聚糖，這些葡聚糖的產(chǎn)生是由于內(nèi)源外切葡聚糖酶的不足導(dǎo)致的，該結(jié)果可以指導(dǎo)大麥育種人員和麥芽制造人員控制大麥及其制麥過(guò)程中的內(nèi)源外切葡聚糖酶，促進(jìn)葡聚糖的降解，提高麥芽的釀造質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為混濁蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖；
[0017](M 為 marker)。
[0018]圖2為HPSEC法測(cè)定混濁物質(zhì)中多糖分子量的色譜圖。
[0019]圖3為紅外光譜法鑒定混濁物質(zhì)中多糖結(jié)構(gòu)的光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例
[0021]取單二麥芽協(xié)定糖化制備的麥芽汁2000mL，12000r/min離心30min后，棄去上清，沉淀冷凍干燥。得到凍干粉約0.2g。
[0022]I)對(duì)混濁物質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定[0023]采用凱氏定氮測(cè)定總氮含量，蛋白質(zhì)含量=總氮含量X6.25。結(jié)果顯示蛋白質(zhì)含量為 15.23%。
[0024]2)對(duì)混濁物質(zhì)進(jìn)行總糖含量測(cè)定
[0025]采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定總糖含量，結(jié)果以葡萄糖計(jì)，含量為82.57%。
[0026]3)對(duì)混濁物質(zhì)進(jìn)行總多酚含量測(cè)定
[0027]采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定總多酚含量，結(jié)果以沒食子酸計(jì)，含量為1.07%。
[0028]4)混濁物質(zhì)的蛋白質(zhì)鑒定
[0029]取凍干粉，溶于8mol/L 尿素(含有1% (W/V)SDS、1% (V/V) β -巰基乙醇)中，離心去除不溶部分。上清采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)根據(jù)分子量分離蛋白質(zhì)(圖1)。切取SDS-PAGE電泳膠上的目標(biāo)條帶，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化之后，通過(guò)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBInr)檢索(http://www.matrixscience.com/)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。
[0030]表1蛋白質(zhì)鑒定的結(jié)果

蛋白質(zhì)名稱NCBI登錄號(hào)
1AMY2/BASI 復(fù)合體 A 鏈 gi|4699831
[0031]
2AMY2/BASI U介休 A 鏈 gi|4699831
3protein Z4gi|131091
4大麥醇溶蛋白 gi|288709
[0032]5calcosin 2gi|34538477
6BT1-C'Mc2.1gij6634471
[0033]5)氨基酸含量分析
[0034]表2采用色譜法進(jìn)行氨基酸含量分析
氨基酸a、量(g/100g)氨基酸含量(g/1 OOg)
^天冬氨酸134半胱氨酸0.15
谷氨酸2.53纈氨酸1.14
絲氨酸0.59蛋氨酸0 26
組氨酸0.48苯丙氨酸0.75
[0035]甘氨酸0.88異亮氨酸0.69
蘇氨酸0.61亮氨酸1.08
精氨酸0.99賴氨酸0.77
丙氨酸0.97脯氨酸1.28
酪氨酸0.47總量14.98
[0036]6)單糖組成分析[0037]稱取凍干粉10mg，HCl水解后，采用高效陰離子交換色譜測(cè)定單糖含量，結(jié)果如下:
[0038]表3采用高效陰離子交換色譜測(cè)定單糖含量
【權(quán)利要求】
1.一種定量鑒定麥芽汁中混濁物質(zhì)的方法，其特征在于，步驟如下:1)過(guò)濾后的麥芽汁離心收集沉淀物質(zhì)，沉淀物質(zhì)進(jìn)行冷凍干燥；2)分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量、總糖含量、多酚含量；3)取凍干粉，溶于含有SDS和β -巰基乙醇的尿素中，離心去除不溶部分，上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳；4)切取SDS-PAGE電泳膠上的目標(biāo)條帶，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化之后，通過(guò)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定；4)取凍干粉，用鹽酸在110°C真空條件下水解，水解液經(jīng)過(guò)濾、離心后用高效液相色譜法測(cè)定氨基酸含量；5)取凍干粉，加蒸餾水和HCl于沸水浴中水解，冷卻至室溫后加NaOH中和，離心，過(guò)濾膜，用高效陰離子交換色譜分析單糖含量；6)取凍干粉，溶于蒸餾水，離心去除不溶物，取上清，用高效體積排阻色譜分析多糖分子量；7)取凍干粉，用傅里葉紅外光譜儀分析多糖結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，具體步驟如下: 1）過(guò)濾后的麥汁離心，12000r/min離心30min后，棄去上清，沉淀物質(zhì)冷凍干燥； 2)采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定總多酹含量； 3)蛋白質(zhì)的鑒定方法:稱取IOmg凍干粉，溶于500μL8mol/L尿素(含有1% (W/V)SDS、1% (V/V) β-巰基乙醇)中，離心去除不溶部分，上清液進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠和濃縮膠的聚丙烯酰胺終濃度分別為12.5%(w/v)和5%(w/v)，用考馬斯亮藍(lán)染色，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白為半乳糖苷酶(116kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵清蛋白(45.0kDa)、乳酸脫氫酶(35.0kDa)、REase Bsp981 (25.0kDa)、β-乳球蛋白(18.4kDa)和溶解酵素(14.4kDa);切取SDS-PAGE電泳膠上的目標(biāo)條帶，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化之后，通過(guò)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBInr)檢索進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定； 4)氨基酸含量分析:稱取凍干粉約0.15g，精確到0.01g,用6mol/L鹽酸在110°C真空條件下水解22h，水解液經(jīng)過(guò)濾、離心后用高效液相色譜法測(cè)定氨基酸含量；色譜柱:HYPERSIL OSD色譜柱(250_Χ4.6_，5μπι);柱溫:40°C ;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng):338nm ;流動(dòng)相A =1000mL0.8%乙酸鈉溶液與225mL三乙胺混合后用5%醋酸將pH調(diào)至7.20±0.05，加入5mL四氫呋喃，混合；流動(dòng)相B:用2%醋酸將400mL2%乙酸鈉溶液的pH調(diào)至7.20±0.05，加入8OOmL乙腈和8OOmL甲醇，混合；流速:1.0mL/min ;梯度洗脫條件:0~27.5min,92%A、8%B ；27.5 ~32min，40%A、60%B ；32 ~35.5min,100%B ； 5)單糖組成分析:稱取IOmg凍干粉,加4ml蒸懼水和4ml4mol/LHCl,于沸水浴中水解Ih,冷卻至室溫后加4ml4mol/L NaOH中和，離心，過(guò)0.45 μ m濾膜，用高效陰離子交換色譜分析單糖含量；色譜柱=CarboPac PA20 ;檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器；流動(dòng)相A:水；流動(dòng)相B:250mmol/L NaOH ;流動(dòng)相 C: lmol/L NaAc ;流速:0.5mT,/miη ;梯度洗脫條件:0 ~21.1min,98.2%AU.8%B ；21.1 ~30min，93.2%A、1.8%B、5%C ;30 ~30.lmin，78.2%A、1.8%B、20%C ;30.1 ~50min，20%A、80%B ； 6)多糖分子量測(cè)定:稱取IOmg凍干粉，溶于ImL蒸餾水，離心去除不溶物，取上清，用高效體積排阻色譜分析多糖分子量；色譜柱:Ultrahydrogel?Linear (300mmX 7.8mm1.d.),兩根串聯(lián)；檢測(cè)器:視差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相:0.lmol/L NaNO3 ;流速:0.9mL/min ;柱溫:45℃ ； 7)多糖結(jié)構(gòu)分析:取凍干粉，用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行分析； 稱取凍干粉2mg與IOOmg KBr混合，研磨均勻，壓片，測(cè)定紅外光譜，并用空片做空白；分辨率:0.5~16cm—1 ;測(cè)試波數(shù)范圍:4000~400cm—1 ;波數(shù)精度:< 0.01cnf1 ;掃描次數(shù)，.32。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103575846SQ201310542025
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】蔡國(guó)林, 李曉敏, 張辰東, 陸健, 孫軍勇 申請(qǐng)人:江南大學(xué)