用于植入前因子的新型檢測方法以及植入前因子肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測PIF存在與否的分析方法，以及通過此方法鑒定出來的PIF肽。具體地說，本發(fā)明涉及用于檢測PIF的流式細胞術檢測方法。它至少部分地基于如下觀察結(jié)果：利用了熒光標記的抗淋巴細胞和抗血小板的抗體的流式細胞術表明，在PIF存在下，玫瑰花結(jié)的形成增加。它還基于如下觀察結(jié)果：流式細胞術表明，在PIF存在下，與CD2結(jié)合的單克隆抗體減少了。本發(fā)明還涉及PIF肽，當PIF肽被加入到Jurkat細胞培養(yǎng)物中時，能夠觀察到它可以：或者(i)減少抗CD2抗體與Jurkat細胞的結(jié)合；或者(ii)增加Jurkat細胞中CD2的表達；或者(iii)減小Jurkat細胞的可存活性。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了ELISA檢測方法，可以通過確定待測樣品對抗CD2抗體與CD2底物相結(jié)合的效果而檢測PIF。
【專利說明】用于植入前因子的新型檢測方法以及植入前因子肽
[0001]本申請是針對2002年6月28日遞交的申請?zhí)枮?01210307132.X、發(fā)明名稱為“用于植入前因子的新型檢測方法以及植入前因子肽”的分案申請。
[0002]上述分案申請是針對2002年6月28日遞交的申請?zhí)枮?01110025233.3、發(fā)明名稱為“用于植入前因子的新型檢測方法以及植入前因子肽”的分案申請。
[0003]上述分案申請是針對2002年6月28日遞交的申請?zhí)枮?00710086405.1、發(fā)明名稱為“用于植入前因子的新型檢測方法以及植入前因子肽”的分案申請。
[0004]上述分案申請是針對2002年6月28日遞交的申請?zhí)枮?2813319.6、發(fā)明名稱為“用于植入前因子的新型檢測方法以及植入前因子肽”的分案申請。
1.【技術領域】
[0005]本發(fā)明涉及植入前因子(preimplantation factor,以下簡稱為PIF),它是受孕和胚胎可存活性(embryo viability)的早期標志物。本發(fā)明還涉及檢測PIF活性的新方法，以及PIF肽。
2.【背景技術】 [0006]不育是困擾世界上數(shù)百萬對夫婦的重要健康問題。人類孕體的早期死亡是一個常見現(xiàn)象，而這也是造成不育的一方面因素。在自然的單個胎兒(single conceptions)中，約有73%都在妊娠的第6周之前死亡(Boklage CE.，從受孕至足月生產(chǎn)之間人類胎兒的存活概率.國際生育學雜志(Int J Fertil) 1990 ；35:75)。這主要是由于在植入之前或植入后的很短時間內(nèi)所發(fā)生的早期胚胎死亡。大齡婦女的生育率較低，而由年輕婦女捐獻卵母細胞后生育率提高，與上述現(xiàn)象相關的數(shù)據(jù)表明:對于獲得成功的妊娠而言，卵母細胞的質(zhì)量很重要(Navot D, Bergh PA, Williams MA等,較差的卵母細胞質(zhì)量而不是植入失敗引起了與年齡相關的雌性生育力的下降，柳葉刀(Lancet) 1991 ；337:1375)。
[0007]體外受精(in vitro fertilization,以下簡稱為“ IVF”)技術已經(jīng)被發(fā)展起來，用于解決不育的問題。但是，在體外培養(yǎng)用于植入的胚胎時的人工條件下，維持胚胎的可存活性甚至更困難一些。在體外，胚胎的生長速度要比在體內(nèi)時慢，通常只有25-65%的胚胎能夠發(fā)育到囊胚階段(在Gomel V，Leung PCK，編的“體外受精和輔助生殖”(In vitrofertilization and assisted reproduction)第 10 屆世界大會(Procc 10th WorldCongress), 1997:1 中的 Gardner DK, Lane M, KOuridakis K, Schoolvcraft WB.，基于生理學復合體的無血清培養(yǎng)基增強哺乳動物胚胎發(fā)育(Complex physiologically basedserum-free culture media increase mammalian embryo development))現(xiàn)有技術尚不倉泛鑒別出那些可能植入和存活的胚胎。人絨毛膜促性腺激素(hCG)是目前正在使用的用于體內(nèi)受精和早期胚胎植入的標志物，但是，它只有在植入后的幾天才能被檢測到。由于缺乏胚胎可存活性的適當標志物，因此，目前很多不能植入的胚胎都被轉(zhuǎn)移了，從而降低了獲得成功妊娠的機會。
[0008]為了解決胚胎可能無法存活的問題，更多數(shù)量的胚胎被同時轉(zhuǎn)移到了未來母親的體內(nèi)。大量胚胎的轉(zhuǎn)移可能導致多次懷孕(multiple pregnancies),這是固有的危險,但如果只轉(zhuǎn)移少量胚胎，又可能有沒有一個胚胎能植入的風險，從而失去一整個IVF周期。很明顯，需要改進對胚胎的選擇，并定義準確的標志物以確定胚胎的可存活性。此外，使用非侵入性方法，通過在培養(yǎng)基中檢測對可存活的、能植入的胚胎特異的產(chǎn)物，將使得人們可以選擇出那些最有可能產(chǎn)生成功妊娠的胚胎，而不會對胚胎產(chǎn)生傷害。
[0009]決定妊娠成功與否的另一個因素是孕體與母體免疫系統(tǒng)之間的相互作用。在受精后的很短時間內(nèi)，應該發(fā)生妊娠的系統(tǒng)母體識別(a systemic maternal recognition ofpregnancy)。由特異性早期胚胎信號所激發(fā)的母體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，可能是該過程中的關鍵。一旦卵母細胞被受精，合子直到孵化中的囊胚(hatching blastocyst)都被透明帶(thezone pellucida)所包圍，透明帶是堅硬的半透明的膜。因此，當胚胎還在輸卵管和子宮腔內(nèi)發(fā)育時，胚胎-母體之間的交流(communication)就已經(jīng)通過胚胎所分泌的化合物而同時發(fā)生了。
[0010]已經(jīng)表明，以孕婦的血清和可存活胚胎為條件的培養(yǎng)基，可以提高血小板和T淋巴細胞在⑶2抗體存在下形成玫瑰花結(jié)的量。正如在1997年7月8日授權(quán)的Barnea等人的美國專利5，646，003以及1999年11月9日授權(quán)的Barnea等人的美國專利5，981，198中已經(jīng)公開的那樣，植入前因子(PIF)的存在可以通過將淋巴細胞、血小板、來自懷孕受試者的熱失活的血清、豚鼠補體以及Tll (抗CD2)單克隆抗體(Dakko，丹麥)混合在一起而檢測出來，其中，懷孕受試者的PIF提高了血小板和淋巴細胞之間形成的玫瑰花結(jié)的量。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PIF(i)由二細胞期前的可存活的早期人和小鼠胚胎所分泌；在IVF之后，在胚胎轉(zhuǎn)移后的3-4天，可以在外周循環(huán)中檢測到；(iii)與73%的帶回家的嬰兒有關，而在早期PIF陰性結(jié)果中則為3%; (iv)在子宮內(nèi)受孕后5-6天可以檢測出來；(V)在未懷孕的血清或不可存活的胚胎中不存在；以及(vi)除了人之外，還存在于多種懷孕的哺乳動物中，包括小鼠、馬、奶牛和豬。此外，如果發(fā)`生自然流產(chǎn)，在hCG分泌減少前的兩周，就已經(jīng)觀察到了 PIF從循環(huán)系統(tǒng)中的消失。
[0011]在上述PIF檢測中所使用的單克隆抗體，其靶標是被稱為CD2的淋巴細胞相關抗原。⑶2存在于約80-90%的人外周血淋巴細胞上，以及超過95%的胸腺細胞、所有形成紅細胞玫瑰花結(jié)的T淋巴細胞以及NK細胞的一個亞型上。⑶2在T細胞活化中的各種作用已經(jīng)被提出，包括作為粘附分子以減小T細胞活化所需抗原的量，以及作為T細胞活化的共同刺激分子(costimulatory molecule)分子或直接促進劑。而且，已經(jīng)暗示，⑶2在誘導免疫無能、細胞因子生產(chǎn)的調(diào)節(jié)以及T細胞正選擇的調(diào)控中起作用。
[0012]⑶2的天然配基是結(jié)構(gòu)相關的IgSF CAMs⑶58 (LFA-3)，一種組織分布較廣的細胞表面粘附配基。此外，⑶2可以與⑶48、⑶59以及⑶15 (Lewis x)相關的糖結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用。CD2以很低的親和力與CD58結(jié)合，而解離常數(shù)卻非常大。CD2及其配基CD58的側(cè)向再分布也影響了細胞粘附的強度。CD2粘附性的調(diào)控影響了 CD2增強抗原敏感度的能力。不能進行親和力調(diào)控的CD2細胞系在抗原特異性應答上表現(xiàn)出了明顯的不足。CD2親和力提高所產(chǎn)生的粘附力，直接為T細胞敏感度做出了貢獻，而后者與CD2介導的信號轉(zhuǎn)導無關。
3.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明涉及用于檢測PIF存在與否的分析方法，以及通過此方法鑒定出來的PIF肽。具體地說，本發(fā)明涉及用于檢測PIF的流式細胞術檢測方法。它至少部分地基于如下觀察結(jié)果:利用了熒光標記的抗淋巴細胞和抗血小板的抗體的流式細胞術表明，在PIF存在下，玫瑰花結(jié)的形成增加。它還基于如下觀察結(jié)果:流式細胞術表明，在PIF存在下，與CD2結(jié)合的單克隆抗體減少了。
[0014]本發(fā)明還涉及PIF肽，當PIF肽被加入到Jurkat細胞培養(yǎng)物中時，能夠觀察到它可以:或者Q)減少抗CD2抗體與Jurkat細胞的結(jié)合；(ii)增加Jurkat細胞中CD2的表達；或者(iii)降低Jurkat細胞的可存活性。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了 ELISA檢測方法，可以通過確定待測樣品對抗CD2抗體與CD2底物相結(jié)合的效果而檢測PIF。
4.【專利附圖】

【附圖說明】 [0015]圖1A-B.由小鼠胚胎培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基(MECCM)的PIF純化；(A)示出了MECCM-3kDA超濾液的高效液相色譜(HPLC)的譜圖，所述超濾液先前已通過MabCD2親和層析進行了純化；(B)示出了在對(A)中得到的PIF活性級分進行進一步HPLC純化后的譜圖。
[0016]圖2A-C.從MECCM純化得到的不同PIF肽的Western印跡分析；Mab⑶2被用作一抗，反意(ant1-sense)小鼠馬辣根過氧化物酶(HRP)-生物素鏈霉親和素復合體被用作二抗。通過ECL檢測試劑(Amersham Pharmacia Biotech)鑒定特異性PIF帶。
[0017]圖3A-B.(A)示出了在新鮮的培養(yǎng)基(CM)、小鼠胚胎培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基(MECCM)和MabCD2的存在下，淋巴細胞-血小板玫瑰花結(jié)形成(L-P)的流式細胞儀測定。L(MaW:D45-PE)和P(Mab⑶42a_FITC)的熒光標記的特異抗體被用于檢測L-P復合物。與培養(yǎng)基(CM)相比，MECCM的L-P形成要高30-40%。(B)示出了 MECCM對MabCD2與Jurkat細胞(JC)相結(jié)合的作用的FC。JC與樣品一起進行溫育，并進一步與Mab⑶2 Cy5 一起進行溫育。與⑶2結(jié)合的抗體被存在于MECCM中的PIF所降低。箭頭指出了 PIF活性。
[0018]圖4A-C.從MECCM純化得到的PIF肽的質(zhì)譜譜圖。通過超濾、滲濾、HPLC, Mab⑶2親和層析以及進一步的HPLC而從MECCM純化得到的PIF活性級分的分子量(MW)通過質(zhì)譜測定。PIF 肽的 MW 為 A)610-9%Da ;B) 963_1848Da ;以及 C) 1807_1846Da。
[0019]圖5A-F.PIF對在Jurkat細胞中的MabCD2結(jié)合(A)、熒光(B)和可存活性(C)的陰性作用以及PIF對MabCD2結(jié)合⑶、突光(E)和可存活性(F)的陽性作用的流式細胞術分析。在陽性樣品中，PIF與CD2競爭(箭頭指出了 PIF活性)。
[0020]圖6.合成的PIF肽對Jurkat細胞CD2表達的影響。
5.【具體實施方式】
[0021]在第一組實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于確定樣品中是否存在植入前因子的方法，該方法包括檢測樣品中是否含有抑制抗CD2抗體與CD2抗原相結(jié)合的成分的步驟；其中，抑制抗CD2抗體與CD2相結(jié)合的能力與植入前因子的存在之間具有正相關性。
[0022]例如，此類方法可以用于流式細胞術或者酶聯(lián)免疫吸附測定方法之中，使用本領域公知的其他技術。在下面的第7部分中，介紹了用于檢測抗CD2抗體與CD2相結(jié)合的流式細胞術方法的一個非限制性實例。
[0023]此處所使用的術語抗CD2抗體，可以是與CD2特異性結(jié)合的單克隆或多克隆抗體。Pharmigen就出售一種此類的單克隆抗體(見下文)。[0024]⑶2抗原可以是純化⑶2抗原的形式，也可以由細胞所攜帶。在本發(fā)明的一個非限制性實施方案中，所述細胞為Jurkat細胞。表達CD2的其他細胞系在本領域中是公知的。
[0025]樣品可以是血清樣品(例如，來自有待檢測受精/植入/胚胎存留的受試者的血清)，可以是培養(yǎng)液樣品(例如，為在IVF轉(zhuǎn)移前確定胚胎的可存活性)，也可以是有待檢測PIF肽是否存在的溶液(例如，在PIF作用劑的純化中；參見下面的第6部分)。
[0026]受試者可以是人類受試者(例如疑為已受孕的人)或非人類受試者(例如農(nóng)業(yè)動物或動物園的動物)。
[0027]在第二組實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于確定樣品中是否存在植入前因子的方法，包括通過流式細胞術檢測樣品中是否含有能增加淋巴細胞、血小板和抗⑶2抗體之間形成的玫瑰花結(jié)的成分的步驟，其中，玫瑰花結(jié)形成量的增加與植入前因子的存在之間具有正相關性。例如，此類檢測可以通過使用熒光標記的以淋巴細胞和血小板為靶標的抗體而進行，其中，最好對抗血小板和抗淋巴細胞的抗體使用不同的標記。
[0028]所述的增加是相對于已知的陰性對照而言的。
[0029]本發(fā)明也提供了下列分離的肽:
[0030](I) 一種分離的肽，具有選自由如下成員所構(gòu)成的組的序列=Met-Val-Arg-1le-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala ；Met-Val-Arg-1Ie-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser ;Met_Va1-Arg-1 Ie-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser-Asp ； Lii1^Met-Val-Arg-1le-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser-Asp-Asp,或者一種包含所述肽的分離的肽,能夠與抗⑶2抗體相結(jié)合并且不是環(huán)子孢子蛋白(circumsporooite protein)；
[0031](2) 一種具有序列` Ser-Gly-1le-Val-1le-Tyr-Gln-Tyr-Met-Asp-Asp-Arg-Tyr-Val-Gly-Ser-Asp-Leu的分離的肽，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗⑶2抗體相結(jié)合并且不是HIV蛋白；
[0032](3) 一種具有序列 Val-1le-1le-1le-Ala-Gln-Tyr-Met-Asp 的分離的妝，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗CD2抗體相結(jié)合；以及
[0033](4) 一種分離的肽，具有選自由如下成員所構(gòu)成的組的序列:Ser-Gln-Ala-Val-GIn-Glu-His-Ala-Ser-Thr 以及 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Xaa-Gly，其中Xaa可以是任何氨基酸，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗CD2抗體相結(jié)合并且不是人類類維生素A (retinoid)和甲狀腺激素的沉默介質(zhì)(silencing mediator)。
[0034](5) 一種具有序列 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Met-Gly 的分離的肽。
[0035]6.實施例:PIF肽的鑒定
[0036]通過超濾、凍干、高效液相色譜(HPLC)、親和層析和western印跡,將PIF從大體積的MECCM中分離出來。二細胞(two-cell-to)囊胚期的小鼠胚胎在含有下列成分的Ham’sF-1O培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)天:青霉素、鏈霉素、MgS04、NaHC03、KHC03和乳酸鈣，此外還添加0.1%的BSA。使用前，MECCM 一直儲存在_80°C。
[0037]將一升MECCM利用Amicon 膜(3kDa截止；YM_3kDa, Amicon.Millipore C0.,美國)通過超濾進行純化。利用300ml純水對濃縮的MECCM進行進一步的滲濾。此外，也以同樣的方式對新鮮的培養(yǎng)基(CM，不含胚胎)進行處理。只有MECCM-3kDa超濾液和滲濾液表現(xiàn)出了 PIF活性，然后它們被收集起來并通過凍干法濃縮。[0038]已經(jīng)觀察到，PIF能夠結(jié)合抗⑶2單克隆抗體(Mab⑶2)。因此，首先通過親和層析將PIF活性部分進行純化，其中使用了瓊脂糖-酰肼_MabCD2活化膠。按下述方法制備抗體親和基質(zhì)。通過 Econo-Pac IODG 脫鹽柱，將 1.5mg MabCD2 (clone RPA-2.10, Pharmigen,Becton Dickinson)與pH 5.5的偶聯(lián)緩沖液進行緩沖液交換，并進一步用高碘酸鈉氧化，并偶聯(lián)至2ml的瓊脂糖-酰肼活化膠上，可以按照制造商提供的說明進行(Aff1-gelHidrazide免疫親和試劑盒，BioRad實驗室，加州，美國)。然后，利用Mab⑶2親和層析柱(10x20mm)對MabCD2_3kDa超濾液-滲濾液凍干粉進行進一步純化。將2g MECCM_3kDa粉末溶于IOml純水中，將pH調(diào)至中性,通過0.22m注射器無菌濾器(Corning Inc.,NY,美國)進行過濾，并在重力流動的情況下通過親和層析柱5次。所述柱子用5柱床體積的pH 7.2的IOOmM磷酸鹽緩沖液沖洗，然后用5柱床體積的0.5M NaCl沖洗。
[0039]結(jié)合上的PIF用3ml 0.1M的乙酸洗脫下來。將洗下PIF的級分收集起來，進行PIF活性檢測，并通過凍干法濃縮。
[0040]總量為300mg的經(jīng)親和層析進一步純化的MECCM_3kDa超濾液被分為三批，在Clipeus C18 制備性柱(Higgins Analytical, Inc.,美國)上進行 HPLC。制備性 HPLC 的運行參數(shù)為:流速，15ml/min。緩沖液:A = 0.1 %三氟乙酸(TFA) ；B = 0.1 % TFA，溶于99.9%乙腈中(CH3CN)。梯度:0% B，5分鐘，加上0-60% B30分鐘，以及0-100% B3分鐘。
[0041]通過蒸發(fā)進一步濃縮HPLC的級分。將HPLC濃縮的級分的pH值調(diào)至中性，并再次檢測PIF活性。幾個級分表現(xiàn)出較高的PIF活性(參見圖1A)。這些級分通過附加的HPLC，在Vydac C8分析柱(4.6x250mm ;Hesperia，加州，美國)上加以純化。附加HPLC的運行參數(shù)為:流速，lml/min。緩沖液:A = 0.1 %三氟乙酸(TFA) ;B = 0.1 % TFA，溶于99.9%乙腈中(CH3CN)。梯度:0% B，5分鐘，加上0-60% B30分鐘，以及0-100% B3分鐘。幾個洗脫級分表現(xiàn)出PIF活性(參見圖1B)，并被進一步測序以確定其氨基酸組成，通過質(zhì)譜確定它們的分子量(MW)。
[0042]由MECCM純化得到的PIF活性級分在Western印跡(“WB”)中給出了正信號。在WB中，使用CM超濾凍干部分的溶液作為陰性對照。WB的條件如下。對于膠，使用了 SDS-PAGE預裝膠(pre-casting gels) (BioRad),具有16.5%瓊脂糖分離膠和4%瓊脂糖濃縮膠。跑膠的溶液中含有 IOOmM Tris, IOOmM Tricine, 0.1% SDS, pH 8.3 (Tris-Tricine 跑膠緩沖液)。由30微升PIF-MECCM純化級分和10微升Tricine上樣緩沖液[200mMTris (三羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)pH 6.8，2%十二烷基磺酸鈉(SDS)，40%甘油，0.04%考馬斯亮藍(CBB-G250) ] (BioRad)組成的樣品，在95°C下溫育5分鐘。冷卻后，將樣品加入到SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)的上樣孔中。為了確定低分子量(MW)多肽的分子量，將10微升用水按
I: 20稀釋的SDS-PAGE標準物(BioRad)加入到每塊膠的一個孔中。電泳時，樣品和標準物在175v下跑5分鐘，然后在60v下跑I小時。
[0043]然后，將獲得的膠進行電印跡(electro-blot),使用IOOmM pH為11的CAPS [3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸]緩沖液作為轉(zhuǎn)移緩沖液。電印跡在80mA下進行I小時，轉(zhuǎn)移到0.22 μ m硝酸纖維素膜(BioRad)上。
[0044]然后，利用5%的封閉溶液(Amersham, Pharmacia, Biotech, NJ,美國)在室溫下封閉硝酸纖維素膜18小時，然后利用PBS-T[磷酸鹽緩沖液-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(Tween 20)]沖洗4次，持續(xù)20分鐘。進行一抗溫育時，已封閉的膜于室溫下在2μ g/ml的Mab⑶2 (Pharmigen) -PBS-T溶液中溫育2小時，然后按上述方法沖洗。進行二抗溫育時，膜于室溫下在馬抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(I: 1000，溶于PBS-T)溶液中溫育I小時。然后，通過ECL-化學熒光系統(tǒng)(Amersham)使PIF帶可見。圖2示出了從MECCM純化得到的PIF肽的典型WB。
[0045]用于測定PIF的流式細胞術(FC)被發(fā)展起來，提高了美國專利5，646，003和5，981，198中所介紹的方法的效率和重現(xiàn)性。尤其是，采用懷孕和未懷孕的人和豬血清，MECCM，CM以及分離的PIF級分，通過FC對玫瑰花結(jié)的形成進行了評估，利用了Mab⑶2或Mab⑶2-Cv5 (Cy-鉻偶聯(lián)的抗體)，Mab⑶45-PE (藻紅蛋白偶聯(lián)的抗體)以及Mab⑶41a-FITC(異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的抗體)，所有的抗體都來自Pharmigen。MECCM與CM相比，其標記的P-L復合體比例要高30-40% (圖3A)。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在檢測分析中MECCM或懷孕的血清與固定化Mab⑶2的預溫育，阻止了 P-L的形成。在檢測分析中，向L-P中加入Mab⑶58 (淋巴細胞功能相關的抗原-3或LFA-3)抗體并不能通過PIF活性樣品的作用而完全阻止玫瑰花結(jié)的形成。
[0046]發(fā)展了一種利用Jurkat細胞(JC)和MabCD2_Cy5的FC-PIF定量檢測法(圖3B)。使用無限增殖的淋巴細胞系后，就不再需要新鮮的供體血液以通過生物測定法評估PIF活性。已經(jīng)確認JC-FC檢測對于人血清樣品(參加表1)而言是有效的，并且在PIF純化期間被用于評估級分的PIF活性。
[0047]純化的PIF活性級分的麗通過質(zhì)譜分析測定，利用產(chǎn)自PerspectiveBiosystems (Cambridge, MA,美國)的 Voyager-RP Biospectrometry MALD1-T0F 工作站。將樣品與基質(zhì)相混合，其中，所述基質(zhì)存在于乙臆:水為1: 2的混合物中，并含有I %的三氟乙酸。譜圖為約200次掃描的平均值。來自MECCM的PIF肽的麗在610-1845Da之間(圖 4)。
[0048]此外，已經(jīng)評估出`了 PIF-活性級分與Mab⑶2的預溫育消除了該PIF-活性。這些數(shù)據(jù)表明，PIF可能是⑶2或同源肽的一部分。然而，在對純化的PIF肽進行測序之后，證明了這些肽并不是CD2的一部分，而且，它們的氨基酸序列是獨特的。
[0049]通過JC-FC檢測證明，MEECM-PIF肽對T細胞所表達的⑶2有三種不同的作用。這些作用涉及:減小Mab⑶2與JC的結(jié)合；通過JC對⑶2表達進行向上調(diào)節(jié)(up-regulating);或降低JC的可存活性。
[0050]從小鼠胚胎中得到的純化PIF活性級分通過Edman降解進行測序，采用AppliedBiosystems脈沖液體測序儀(Pulsed Liquid Sequencer)(型號477A)。用異硫氰酸苯酯對釋放出來的氨基酸進行衍生處理，以便得到PTH-氨基酸，PTH-氨基酸可以通過在與測序儀配合的HPLC系統(tǒng)上進行的反向HPLC檢測出來。幾種PIF級分得到了獨一無二的序列。幾種肽給出的序列，其N端的九個或十個殘基是完全相同的，這表明這些肽是由相同的分子(參見表1I)截短后得到的不同形式。PIF肽被確定為至少三個獨特的家族，為來源于胚胎的或妊娠相關的小肽。包括三種PIF肽的一個家族的氨基酸序列與環(huán)子孢子蛋白(Circumsporozoite protein) (_原蟲:惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum))的一個區(qū)域100%匹配。PIF肽的這一家族通過JC向上調(diào)節(jié)⑶2的表達。一種與上述PIF肽家族只有前五個氨基酸殘基相同的PIF肽(14個氨基酸)，以及另一種與HIV-1RNA指導的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶，EC 2.7.7.49)序列有11個氨基酸匹配的PIF肽(18個氨基酸)，也可以通過JC向上調(diào)節(jié)CD2的表達。此外，另一個包括兩個PIF肽(9個和13個氨基酸)的家族與人受體作用因子(receptor-1nteracting factor)的序列有10個氨基酸匹配,后者為類維生素A和甲狀腺激素的沉默介質(zhì)(a silencing mediator for retinoid and thyroidhormone receptor, SMRT) (Chen and Evans, 1995)。該 PIF 肽家族的更短的成員表現(xiàn)出了對MabCD2與JC結(jié)合的競爭作用，而且更長的PIF肽降低了 JC的可存活性。值得注意的是，由核受體介導的轉(zhuǎn)錄沉默在發(fā)育、分化和腫瘤形成中很重要。
[0051]PIF肽通過固相肽合成(SPPS)法進行合成,使用Applied Biosystems肽合成儀，采用Fmoc (9-芴甲氧羰基)化學法，其中每個氨基酸的氨基氮都被Fmoc所封閉。偶聯(lián)時，利用 3mol/ml 的 2_(1H_苯并三唑-1-基)-1,1,3, 3-tetrametyluronium 四氟硼酸酯/1-輕基苯并三唑，在二異丙基乙胺存在下，將N端已被保護起來的氨基酸的羧基活化。然后，將活化的氨基酸順序地加入到新生的肽上。在合成完成后，通過反向HPLC進行最后的純化，并通過MALD1-T0F質(zhì)譜和氨基酸分析對其加以確認。PIF合成肽在Jurkat細胞的⑶2現(xiàn)象中表現(xiàn)出相似的作用(圖6)，也可以被Mab CD2免疫檢測到。
[0052]7.用于PIF的流式細胞術
[0053]7.1 材料
[0054]材料包括Jurkat白血病細胞(JC);克隆培養(yǎng)基；用于流式細胞儀測量的Falcon管；Mab CD2_Cy5 (Cy-絡偶聯(lián)的抗體，clone RPA-2.10, Pharmigen, Becton Dickinson)；生物樣品(可以是有待檢測PIF活性的人血清，也可以是假定的或合成的PIF肽的溶液)；PBS-2% BSA(IOOmM磷酸鹽緩沖液-2%牛血清清蛋白；陰性對照)；臺盼藍染液；CO2細胞培養(yǎng)箱；流式細胞儀。
[0055]7.2 方法
[0056]制備JC懸液:
[0057]利用臺盼藍排阻染色法檢測JC培養(yǎng)物的可存活性。細胞的可存活性應該在80-90%之間。
[0058]用 IOml PBS-2% BSA 沖洗 JC 兩次。
[0059]在克隆培養(yǎng)基或PBS-2% BSA中制備JC懸液，含有5，000, 000細胞/毫升。
[0060]將50mlJC懸液分散到falcon管中(250，000細胞/管)。
[0061]樣品溫育:
[0062]加入200μ I樣品，來自早期妊娠對照的血清(3個陽性對照)或PBS_2%BSA(陰性對照)。輕輕混合。
[0063]室溫下溫育20-30分鐘。
[0064]加入 200 μ I 在 PBS-2% BSA 中以 I: 200 稀釋的 MabCD2_Cy5。輕輕混合。
[0065]室溫下溫育20-30分鐘。
[0066]流式細胞儀測定:
[0067]測定每個管子的熒光(488nm激光激發(fā)波長)。
[0068]將活的和全部細胞與全部死細胞的熒光(參見圖5)與對照進行比較。按下述方法計算PIF活性:
[0070]全部細胞的熒光/%死細胞X活細胞的熒光
[0071]結(jié)果的解釋:[0072]PIF陰性的活性應該在130-340之間；
[0073]PIF陽性樣品在陰性參考范圍之外。
[0074]本文中引用了多篇參考文獻，在此以引用的方式將其全部內(nèi)容包括在本文中。
[0075]表1 37名患者血清中流式細胞術PIF檢測的臨床有效性的確認
【權(quán)利要求】
1.一種具有序列
Ser-Gly-1le-Val-1le-Tyr-Gln-Tyr-Met-Asp-Asp-Arg-Tyr-Val-Gly-Ser-Asp-Leu 的分離的 肽。
【文檔編號】G01N33/68GK103755787SQ201310654136
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2001年7月2日
【發(fā)明者】艾坦·巴尼, 魯賓·雷內(nèi)·岡薩雷斯·佩雷斯, 保羅·C·利維斯 申請人:倍奧英賽普特有限責任公司