一種電化學(xué)納米免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種電化學(xué)納米免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]GST標(biāo)簽是來(lái)自日本血吸蟲中的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶蛋白，其結(jié)構(gòu)非常保守。在基因工程中，蛋白質(zhì)的表達(dá)經(jīng)常用到各種融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其中就包括GST標(biāo)簽表達(dá)體系，其具有蛋白表達(dá)產(chǎn)率高、表達(dá)產(chǎn)物純化方便以及利于抗體制備等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因時(shí)，對(duì)融合表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)非常重要。目前常用的檢測(cè)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽蛋白的方法是Western blot和ELIESA，但周期較長(zhǎng)且靈敏度不高。因此，研究開發(fā)一種快速、靈敏、檢測(cè)成本低的檢測(cè)方法成為科學(xué)家們的強(qiáng)烈需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前對(duì)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)不方便、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本高等現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，而提供一種電化學(xué)納米免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的電化學(xué)納米免疫傳感器不受樣品的濁度、顏色的影響，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行純化、富集等預(yù)處理，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，能夠用于對(duì)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行快速定量檢測(cè)。
[0004]本發(fā)明提供下述技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種電化學(xué)納米免疫傳感器，所述傳感器以海藻酸鈉為橋聯(lián)劑將納米金和辣根過(guò)氧化物酶固定于電極表面，所述納米金吸附有抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體。
[0006]所述抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體為本領(lǐng)域常規(guī)，其來(lái)源和類型均沒(méi)有特殊要求，既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
[0007]所述電極可以是本領(lǐng)域常規(guī)所述的各類電極，優(yōu)選玻碳電極。
[0008]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是:前述電化學(xué)納米免疫傳感器的制備方法，其包括如下步驟:
[0009](1)對(duì)電極進(jìn)行預(yù)處理，然后在電極上包被由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過(guò)氧化物酶溶液組成的混合溶液；
[0010](2)繼續(xù)在電極上包被抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體；
[0011](3)封閉液封閉后即得。
[0012]步驟(1)為對(duì)電極進(jìn)行預(yù)處理，然后在電極上包被由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過(guò)氧化物酶溶液組成的混合溶液。
[0013]其中，所述電極可以是本領(lǐng)域常規(guī)所述的各類電極，優(yōu)選玻碳電極(glassycarbon electrode，GCE)。
[0014]如本領(lǐng)域常規(guī)，所述包被為將電極置于溶液中進(jìn)行包被或者將包被溶液滴涂于電極表面。優(yōu)選地，所述包被為將電極置于由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過(guò)氧化物酶溶液組成的混合溶液中進(jìn)行包被，或者將由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過(guò)氧化物酶溶液組成的混合溶液滴涂于電極表面。
[0015]所述海藻酸鈉(Sodium alginate, SA)溶液優(yōu)選以如下方法制得:將海藻酸鈉溶于水得到海藻酸鈉溶液，備用。更優(yōu)選地，將2g海藻酸鈉溶于100mL雙蒸水中，得到2%的海藻酸鈉溶液，備用。
[0016]所述納米金(AU)溶膠優(yōu)選以如下方法制得:取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入lg/100mL的檸檬酸鈉溶液4mL混勻，置于微波爐中低火保持8_10min，待自然冷卻后用超純水補(bǔ)充至104mL，即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0017]所述辣根過(guò)氧化物酶溶液優(yōu)選以如下方法制得:將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶于磷酸緩沖液(PBS)中，即得辣根過(guò)氧化物酶溶液。更優(yōu)選地，將0.02g辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶于10mL 0.01M pH值為7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，即得2.0g/L辣根過(guò)氧化物酶溶液。
[0018]所述封閉液為免疫檢測(cè)領(lǐng)域常規(guī)的封閉液，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)。
[0019]所述抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體為本領(lǐng)域常規(guī)，其來(lái)源和類型均沒(méi)有特殊要求，既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體，更優(yōu)選Balb/c小鼠單克隆抗體，且純化后抗體的濃度不低于0.5mg/mL。
[0020]在所述包被的操作過(guò)程中，如本領(lǐng)域常規(guī)，一般都需要經(jīng)過(guò)恒溫孵育和清洗的步驟。
[0021]在所述封閉的操作過(guò)程中，如本領(lǐng)域常規(guī)，一般也需要經(jīng)過(guò)恒溫孵育和清洗的步驟。
[0022]所述制備方法較佳地包括如下步驟:
[0023](1)將玻碳電極預(yù)處理后，取由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過(guò)氧化物酶溶液組成的混合溶液滴涂于處理后的玻碳電極表面，置于4°C冰箱自然干燥24h后，浸于質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4%的CaCl2溶液中5min固化成膜，超純水清洗至洗出水在600nm下無(wú)吸光值，除去玻碳電極表面的CaCl2溶液，得到SA/HRP/AU/GCE傳感電極；
[0024](2)將SA/HRP/AU/GCE傳感電極置于純化的抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)單克隆抗體溶液中，4°C自組裝至少24h，得到GST/SA/HRP/AU/GCE傳感電極；
[0025](3)最后將GST/SA/HRP/AU/GCE傳感電極置于濃度為lg/100mL的牛血清白蛋白溶液中，37°C溫育至少lh，以封閉非特異性位點(diǎn)，再以含體積百分比為0.05% Tween-20的磷酸緩沖液清洗未結(jié)合的牛血清白蛋白，自然晾干即得谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶電化學(xué)納米免疫傳感器。
[0026]本發(fā)明的電化學(xué)納米免疫傳感器利用循環(huán)伏安法、交流阻抗法，原子力顯微鏡等表征電極組裝的各個(gè)階段。利用電流時(shí)間曲線法等方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的定量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該傳感器靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及使用壽命等技術(shù)參數(shù)均良好。
[0027]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是:前述電化學(xué)納米免疫傳感器的在谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0028]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0029]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0030]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0031]本發(fā)明的電化學(xué)納米免疫傳感器不受樣品的濁度、顏色的影響，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行純化、富集等預(yù)處理，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠用于對(duì)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行快速定量檢測(cè)，且靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及使用壽命等技術(shù)參數(shù)均良好，具有非常好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為本發(fā)明的電化學(xué)納米免疫傳感器的結(jié)構(gòu)圖，其中，由下往上，GCE指玻碳電極層，SA/HRP/AU指海藻酸鈉/辣根過(guò)氧化物酶/納米金層，Ant1-GST指抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體層，BSA指封閉液牛血清白蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但并不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。下述各實(shí)施例中，所使用的各類設(shè)備、試劑和材料若無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)市售可得。
[0034]實(shí)施例1電化學(xué)納米免疫傳感器的制備
[0035]1、玻碳電極的預(yù)處理:
[0036]將玻碳電極依次分別用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μ m粒徑的α _Α1203漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HN0#P Η 20按體積比1: 1配制的混合液、無(wú)水乙醇和超純水清洗。在lmol/L H2S04溶液中用掃描范圍為1.0?一 1.0V，掃描速度為100mV/S的循環(huán)伏安法活化電極，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。上述穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線滿足下述要求:在實(shí)驗(yàn)室條件下預(yù)處理后的電極的循環(huán)伏安曲線的峰電位差應(yīng)在80mV以下，并盡可能地接近64mV，電極方能使用，最后置于氮?dú)猸h(huán)境中干燥待用。
[0037]2、納米金(Nano-Au)溶膠的制備:
[0038]根據(jù)Frens法取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入lg/100mL的梓檬酸鈉溶液4mL混勻，置于微波爐中低火保持8-10min，待其自然冷卻后用超純水補(bǔ)充至104mL即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆?。利用分光光度?jì)對(duì)所制備的納米金溶膠在可見光范圍內(nèi)(400_700nm)進(jìn)行掃描，光吸收性膠