一種核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒及其制備方法，可用于臨床膀胱癌的早期診斷及術(shù)后療效監(jiān)測(cè)。本發(fā)明的試劑盒包括：1）NMP22校準(zhǔn)品；2）NMP22單克隆抗體預(yù)包被的固相載體；3）NMP22單克隆抗體的酶標(biāo)記物；4）與所述酶作用的發(fā)光底物液；5）濃縮洗液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、無創(chuàng)且能早期診斷膀胱癌。
【專利說明】一種核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種核基質(zhì)蛋白22 (NMP22) 化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，90%以上為移行細(xì)胞癌，其中80 %以上是無 浸潤(rùn)的淺表性癌，10%_20%發(fā)展為浸潤(rùn)性膀胱癌。膀胱移行細(xì)胞癌（transitional cell carcinoma of bladder)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，多發(fā)生于50-70歲之間。這種疾 病死亡率高，及早地發(fā)現(xiàn)、診斷對(duì)治療和預(yù)后有重要作用。有資料表明在疾病早期診斷出的 患者的5年存活率大于90%，而在晚期診斷出的患者其5年存活率僅約為15%-30%。目前對(duì) 膀胱癌診斷和術(shù)后復(fù)查主要靠膀胱鏡和尿細(xì)胞學(xué)檢查，前者雖準(zhǔn)確，但是一種侵入性檢查， 操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、費(fèi)用高額，且給病人帶來很大痛苦，使得很多病人對(duì)此方法有抵觸情 緒，同時(shí)難以發(fā)現(xiàn)原位癌或扁平癌；尿細(xì)胞學(xué)檢查雖無創(chuàng)，且特異性較好，但敏感性低，對(duì)于 分期較低、分化較好的腫瘤，其敏感性僅為30%或更低，而且受診斷醫(yī)師主觀因素的影響較 大。膀胱鏡和尿細(xì)胞學(xué)檢查的局限性限制了對(duì)膀胱癌診斷的應(yīng)用，故尋找一種簡(jiǎn)便、無創(chuàng)且 能早期診斷膀胱癌的檢測(cè)方法及設(shè)備具有很大意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、無創(chuàng)且能早期診斷膀胱癌的 使用化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)試劑盒及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供一種使用化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)核基質(zhì)蛋白22試劑盒。
[0005] 核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒包括NMP22校準(zhǔn)品、NMP22單克隆抗體預(yù) 包被的固相載體、NMP22單克隆抗體的酶標(biāo)記物、與所述酶作用的化學(xué)發(fā)光底物液、以及濃 縮洗液。
[0006] 優(yōu)選，所述的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。
[0007] 優(yōu)選，所述的酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0008] 優(yōu)選，所述的發(fā)光底物為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。
[0009] 優(yōu)選，所述的1，2_二氧乙烷類衍生物為（金剛烷)-1，2_二氧乙烷、3- (2< -螺旋 金剛燒）_4-甲氧基(3"-憐醜氧基）苯基 -1，2- _氧乙燒、CSF*D或CDP-Star。
[0010] 優(yōu)選，所述的濃縮洗液為Tris-HCl或PBST洗滌液。
[0011] 本發(fā)明還提供一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟： 1) 配制核基質(zhì)蛋白22的校準(zhǔn)品； 2) 以酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體； 3) 以核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被固相載體； 4) 配制上述酶所作用的發(fā)光底物液； 5) 配制濃縮洗液； 6)分裝所述核基質(zhì)蛋白22的校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體、酶作用的發(fā) 光底物液和濃縮洗液，并將各組分裝成成品。
[0012] 優(yōu)選，所述步驟3)包被固相載體包括以下步驟： 1) 包被 采用檸檬酸緩沖液與核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)單克隆抗體混合配制成包被液，并將所得 混合液負(fù)載于固相載體上； 2) 用生理鹽水洗滌步驟1)所得載體； 3) 封閉 配制封閉液，pH為7. 0-7. 5,然后將所得的封閉液負(fù)載于步驟2)洗滌后的載體上。
[0013] 更優(yōu)選，所述封閉液選用PBS緩沖液。
[0014] 或更優(yōu)選，所述發(fā)光底物液包含 24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15ml HCl、200ml 3- (2'-螺旋金剛燒)-4-甲氧基(3"-憐醜氧基)苯基 -1，2- _ 氧乙燒、lml Proclin 300、1000ml 雙蒸水。
[0015] 優(yōu)選，所述的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。
[0016] 優(yōu)選，所述的酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0017] 優(yōu)選，所述的發(fā)光底物為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。
[0018] 更優(yōu)選，所述的1，2_二氧乙烷類衍生物為（金剛烷)-1，2_二氧乙烷、3- (2< -螺 旋金剛燒）_4-甲氧基(3"-憐醜氧基）苯基 _1，2- _氧乙燒、CSF*D或CDP-Star。
[0019] 優(yōu)選，所述的濃縮洗液為Tris-HCl或PBST洗滌液。
[0020] 綜上所述，本發(fā)明的有益效果為： 1、本發(fā)明所提供的使用化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)核基質(zhì)蛋白22試劑盒，核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)是一種新的膀胱癌腫瘤標(biāo)志物，能通過檢測(cè)其在人體尿液或血液中的含量來進(jìn)行 膀胱癌的早期診斷及術(shù)后復(fù)發(fā)情況，研究表明尿液或血液中NMP22診斷的靈敏度、特異度 和準(zhǔn)確度均比較高，所以本發(fā)明可用于早期診斷膀胱癌及術(shù)后療效監(jiān)測(cè)。本發(fā)明所述試劑 盒，利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)NMP22,只需提供檢測(cè)樣品（尿液或血液）而不使用任何設(shè)備，具有 操作方便，而且患者無痛苦的優(yōu)點(diǎn)。
[0021] 2、本發(fā)明采用了辣根過氧化物酶（HRP)和堿性磷酸酶(ALP)兩個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研 究，用HRP或ALP對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，然后加入待測(cè)抗原使之結(jié)合，HRP或ALP催化發(fā)光底物 液使之分解而產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)。HRP作用的底物為1，2_二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米 諾，此類物質(zhì)價(jià)格便宜，基本實(shí)現(xiàn)了國(guó)產(chǎn)化，是當(dāng)前在臨床應(yīng)用最廣的一類發(fā)光劑。ALP作用 的底物為1，2-二氧乙烷類衍生物（AMPH))，它是一種新型的化學(xué)發(fā)光劑，屬于二氧雜環(huán)丁 烷類，性能十分穩(wěn)定，5°C下保存的固體AMPH)幾乎不分解。本發(fā)明通過使用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng) 劑AMPPD，增強(qiáng)了化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，延長(zhǎng)了發(fā)光時(shí)間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為實(shí)施例1所制備的試劑盒中的校準(zhǔn)品線性圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制 在所述的實(shí)施例范圍之中。
[0024] 實(shí)施例1-6為核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒的制備 實(shí)施例1 一、 酶標(biāo)抗體制備 辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)單克隆抗體采用改良過碘酸鈉法制備，用 酶標(biāo)記抗體稀釋液以1 :6000工作濃度稀釋酶標(biāo)抗體； 1.辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)單克隆抗體的制備 將標(biāo)記用的核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)單克隆抗體和辣根過氧化物酶用改良過碘酸鈉法 結(jié)合在一起，完成用辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)結(jié)合物。
[0025] 以標(biāo)記10mg核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)單克隆抗體為例，其具體步驟如下： (1) 稱取5mgHRP加 lml 0. lmol/L醋酸鈉或水溶解，充分混勻； (2) 于上液中加入0. 2ml新配的0. lmol/L NaI04溶液，室溫下避光攪拌30min ; (3) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。
[0026] (4)加 20ul 0· 2M ρΗ9· 5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9. 0-9. 5,然 后立即加入10mg核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)單克隆抗體在lml 0. 01M碳酸鹽緩沖液中，室溫 避光輕輕攪拌2h ; (5) 加 0. lml 新配的 4mg/mlNaBH4 液，混勻，再置 4°C，2h ; (6) 將上述液裝入透析袋中，用0. 15M pH7. 4的PB緩沖液中透析，去除銨離子后， 10,000rpm離心30min去除沉淀，上清液即為所需的酶結(jié)合物，加入等量?jī)?yōu)質(zhì)丙三醇，分裝 后，-20°C保存。
[0027] 2.酶標(biāo)抗體稀釋液配方：

【權(quán)利要求】
1. 一種核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：1) NMP22校準(zhǔn)品；2) NMP22單克隆抗體預(yù)包被的固相載體；3) NMP22單克隆抗體的酶標(biāo)記物； 4)與所述酶作用的發(fā)光底物液；5)濃縮洗液。
2. 如權(quán)利要求1所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒，其特征在于，所述的 固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。
3. 如權(quán)利要求1所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒，其特征在于，所述的 酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
4. 如權(quán)利要求1所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒，其特征在于，所述的 發(fā)光底物液的發(fā)光底物為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。
5. 如權(quán)利要求4所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒，其特征在于，所述 的1，2_二氧乙烷類衍生物為（金剛烷）-1，2_二氧乙烷、3- (2< -螺旋金剛烷）-4-甲氧 基-4- (3〃 -磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
6. 如權(quán)利要求1所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒，其特征在于，所述的 濃縮洗液為Tris-HCl或PBST洗滌液。
7. 如權(quán)利要求1所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟： 配制核基質(zhì)蛋白22的校準(zhǔn)品； 以酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體； 以核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被固相載體； 配制上述酶所作用的發(fā)光底物液； 配制濃縮洗液； 分裝所述核基質(zhì)蛋白22的校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體、酶作用的發(fā)光 底物液和濃縮洗液，并將各組分裝成成品。
8. 如權(quán)利要求7所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒的制備方法，其特征在 于，所述發(fā)光底物液包含Tris、NaCl、KC1、HC1、3- (2'-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4- (3 "-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷、Proclin 300和雙蒸水。
9. 如權(quán)利要求7所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒的制備方法，其特征在 于，所述包被固相載體的步驟3)包括以下步驟： 1) 包被 采用檸檬酸緩沖液與核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)單克隆抗體混合配制成包被液，并將所得 包被液負(fù)載于固相載體上； 2) 用生理鹽水洗滌步驟1)所得載體； 3) 封閉 配制封閉液，pH值為7-7. 5,然后將所得的封閉液負(fù)載于步驟2)洗滌后的載體上。
10. 如權(quán)利要求9所述的核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測(cè)劑盒的制備方法，其特征 在于：所述封閉液為PBS緩沖液。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104267197SQ201410573982
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】張華 , 廖鐘財(cái) 申請(qǐng)人:浙江東方基因生物制品有限公司