一種胃蛋白酶原Ⅰ的檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種胃蛋白酶原Ⅰ的檢測(cè)方法及試劑盒，尤其涉及一種胃蛋白酶原Ⅰ的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒。包括以下步驟：1)免疫層析試紙條制備；2)凍干探針制備；3)樣品稀釋液制備；4)樣品檢驗(yàn)；本發(fā)明的胃蛋白酶原Ⅰ的檢測(cè)方法及試劑盒，靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單、成本低。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種胃蛋白酶原I的檢測(cè)方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種胃蛋白酶原I的檢測(cè)方法及試劑盒，尤其設(shè)及一種胃蛋白酶原I 的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 胃蛋白酶原（PG)是胃蛋白酶的前體，是分子量為42000Da的單鏈多態(tài)，依據(jù)其生 化性質(zhì)和免疫原性將其分成兩個(gè)亞群。組分1-5的免疫原性相同稱(chēng)PG I，主要由胃腺的主 細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌，大部分進(jìn)入胃腔；組分6-7稱(chēng)PG II，由胃體的胃底黏膜的泌酸腺 的主細(xì)胞、泌酸腺的黏液頸細(xì)胞、責(zé)口腺和胃竇的幽口腺的黏液細(xì)胞W及十二指腸上段的 Brunner腺分泌。正常情況下約1%的PG進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)入的量十分穩(wěn)定，因此血清中PG 含量可W反映胃黏膜腺體和細(xì)胞的數(shù)量，也間接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。當(dāng)胃 黏膜發(fā)生病理變化時(shí)，血清PG含量也隨之改變，被稱(chēng)為胃黏膜的"血清學(xué)活檢"。
[000引其中，胃是胃蛋白酶原I (簡(jiǎn)稱(chēng)PG I )的唯一來(lái)源，因此PG I可W反映胃粘膜 狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)量的變化。國(guó)內(nèi)外臨床研究指出，當(dāng)PG I低于正常值時(shí)，表明胃體、胃底黏膜 萎縮或受損，可能與淺表性胃炎、萎縮性胃炎等疾病有關(guān)；當(dāng)PG I高于正常值時(shí)，可能與 飲食、藥物的刺激或幽口螺旋桿菌感染W(wǎng)及胃潰瘍、十二指腸潰瘍有關(guān)。通過(guò)PG I的血清 檢測(cè)可W初步篩查胃潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌等消化道疾病，能夠減輕患者的痛苦，而且檢 測(cè)方便，可用于一般的體檢。
[0004] 目前PG I的主要檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法巧LISA)和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 (CLIAKELISA法檢測(cè)精確、能準(zhǔn)確定量，具有很高的敏感性，但是檢測(cè)樣品需要加樣、溫浴、 洗漆、顯色、終止等步驟，操作程序繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，樣品從處理到得出結(jié)論需要至少40min，不 適于大規(guī)模的體檢篩查；樣品檢測(cè)需要洗板機(jī)和酶標(biāo)儀，攜帶不便，因而不能在病人家庭或 急救車(chē)上進(jìn)行檢測(cè)；另外其敏感性、特異性不夠高，對(duì)低濃度樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度不高。而化 學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定，雖然精確度高、檢測(cè)速度快，但檢測(cè)需要昂貴的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，要 求特定的分析室，另外其試劑成本也較高，無(wú)法廣泛用于較基層的醫(yī)院和醫(yī)療機(jī)構(gòu)中。
[0005] 中國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)為CN102654499A的發(fā)明專(zhuān)利，雖然公布了一種光激發(fā)化學(xué)發(fā)光 檢測(cè)胃蛋白酶原I的方法，利用單線(xiàn)態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞，將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生 巧光，通過(guò)檢測(cè)巧光強(qiáng)度獲得數(shù)據(jù)。然而采用該專(zhuān)利技術(shù)檢測(cè)樣品時(shí)需要的操作較多，需要 配套設(shè)備，檢測(cè)復(fù)雜，對(duì)操作人員的要求較高；而且該專(zhuān)利中的試劑盒制作成本較高，程序 較復(fù)雜。中國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)為CN103698525A的發(fā)明專(zhuān)利，雖然公布了一種消除乳糜干擾的膠 乳免疫比濁法檢測(cè)胃蛋白酶原I的試劑盒，通過(guò)膠乳凝集作用放大樣本中待測(cè)物質(zhì)與特異 性抗體的結(jié)合反應(yīng)，添加乳糜消除劑處理產(chǎn)生渾濁的物質(zhì)，消除其干擾。然而該專(zhuān)利只能消 除一些渾濁類(lèi)物質(zhì)的干擾作用，并未消除一些非特異性結(jié)合，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)高于實(shí)際濃 度。中國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)為CN102323417B的發(fā)明專(zhuān)利，雖然公布了一種將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫 磁微粒結(jié)合的方法檢測(cè)胃蛋白酶原I，在本質(zhì)上還是一種酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，操作過(guò)程復(fù) 雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。
[0006] 有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加W研究創(chuàng)新，W期創(chuàng)設(shè)一種靈敏度高、準(zhǔn)確 度高、操作簡(jiǎn)單、成本低的檢測(cè)方法及試劑盒，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單、 成本低的胃蛋白酶原I的檢測(cè)方法及試劑盒。
[000引本發(fā)明的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0009] 1)免疫層析試紙條制備；將胃蛋白酶原I單克隆抗體和雞I巧分別包被在層析試 紙的檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)上，經(jīng)干燥、切割后得到免疫層析試紙條；
[0010] 。凍干探針制備；將兩種不同發(fā)射光波長(zhǎng)的巧光膠乳微粒溶液按比例混合，混合 均勻后加入活化劑反應(yīng)一段時(shí)間，離屯、、洗漆后得到活化巧光膠乳微粒；
[0011] 將胃蛋白酶原I單克隆抗體和羊抗雞I巧分別按比例與活化巧光膠乳微粒偶聯(lián) 反應(yīng)一段時(shí)間，得到胃蛋白酶原I單克隆抗體巧光膠乳微粒、W及羊抗雞I巧巧光膠乳微 粒；
[0012] 隨后將胃蛋白酶原I單克隆抗體巧光膠乳微粒與羊抗雞I巧巧光膠乳微粒按一 定比例混合得到混合巧光膠乳微粒，隨后加入娃藻糖水溶液稀釋?zhuān)瑑龈珊蟊４鏋閮龈商?針；
[0013] 3)樣品稀釋液制備；樣品稀釋液為含有牛血清白蛋白、蛋白保護(hù)劑、表面活性劑 和防腐劑的緩沖液；
[0014] 4)樣品檢驗(yàn)；將血清樣品與凍干探針混合分散一段時(shí)間后，取出一定量加入樣品 稀釋液中，待混合均勻后滴加至免疫層析試紙條上進(jìn)行免疫層析反應(yīng)；隨后在巧光檢測(cè)器 下采用與兩種巧光膠乳微粒相對(duì)應(yīng)的兩種發(fā)射光波長(zhǎng)進(jìn)行巧光檢測(cè)。
[0015] 具體的，所述凍干探針制備步驟中，將兩種不同發(fā)射光波長(zhǎng)的巧光膠乳微粒溶液 按1:5?5:1比例混合，混合均勻后加入活化劑1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺鹽 酸鹽室溫下反應(yīng)0. 5?化，其中，1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺鹽酸鹽與巧光膠 乳微粒的重量比為0. 5:100?5:100。
[0016] 具體的，所述凍干探針制備步驟中，所述兩種巧光膠乳微粒的發(fā)射光波長(zhǎng)分別為 500 ?590nm 和 600 ?740nm。
[0017] 具體的，所述凍干探針制備步驟中，胃蛋白酶原I單克隆抗體與活化巧光膠乳微 粒的混合比例為0. 01:100?0. 05:100,混合后室溫下偶聯(lián)反應(yīng)2?化；羊抗雞I巧與活化 巧光膠乳微粒的混合比例為0. 01:100?0. 05:100,混合后室溫下偶聯(lián)反應(yīng)2?化。
[001引具體的，所述凍干探針制備步驟中，按3:1?6:1的比例混合胃蛋白酶原I單克 隆抗體巧光膠乳微粒和羊抗雞I巧巧光膠乳微粒，得到混合巧光膠乳微粒，將混合巧光膠 乳微粒用含糖量5?30%的娃藻糖水溶液稀釋10?50倍，在-80°C下冷凍化，取出后 在-30?-50°C冷阱溫度下冷凍干燥10?20h，密封保存于4°C。
[0019] 具體的，所述樣品稀釋液制備步驟中，所述緩沖液包括PBS緩沖液、Tris緩沖液、 甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、肥陽(yáng)S緩沖液中的一種或幾種，所述表面活性劑為吐溫20、吐溫 80、曲拉通X-100或聚己二醇，所述防腐劑為疊氮鋼或proclin。
[0020] 本發(fā)明的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)試劑盒，包括試劑盒體、凍存 管、w及稀釋液瓶，所述試劑盒體包括塑料襯板w及固定在塑料襯板上的樣品墊、免疫層析 試紙條和吸水紙，所述樣品墊和吸水紙分別搭接在所述免疫層析試紙條的兩側(cè)，所述免疫 層析試紙條上設(shè)置有檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)，所述檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)內(nèi)分別包被有胃蛋白酶原I單 克隆抗體和雞I巧；所述凍存管中存放有凍干探針，所述凍干探針為由胃蛋白酶原I單克 隆抗體和羊抗雞I巧與兩種不同發(fā)射光波長(zhǎng)的巧光膠乳微粒反應(yīng)制得的凍干探針，所述稀 釋液瓶中存放有樣品稀釋液。
[0021] 進(jìn)一步的，所述試劑盒體還包括殼體，所述殼體上設(shè)置有加樣孔、檢測(cè)窗口和把 手，所述加樣孔設(shè)置在所述樣品墊處，所述檢測(cè)窗口設(shè)置在所述檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)處，所述把 手設(shè)置在所述殼體上位于靠近吸水紙的一側(cè)。
[0022] 進(jìn)一步的，所述免疫層析試紙條為硝酸纖維素膜材質(zhì)。
[0023] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 1)本發(fā)明利用巧光免疫層析方法，實(shí)現(xiàn)胃蛋白酶原I的體外定量檢測(cè)。
[0025] 2)本發(fā)明巧光免疫層析方法，獨(dú)創(chuàng)性使用獨(dú)立控制線(xiàn)方法；檢測(cè)線(xiàn)區(qū)域采用能與 胃蛋白酶原I形成復(fù)合物的胃蛋白酶原I單克隆抗體，配套探針則使用2種巧光膠乳微粒 標(biāo)記的胃蛋白酶原I單克隆抗體；控制線(xiàn)區(qū)域包被有雞I巧抗體，配套探針使用羊抗雞I巧 抗體標(biāo)記的2種巧光膠乳微粒?？刂凭€(xiàn)與檢測(cè)線(xiàn)獨(dú)立反應(yīng)，互不影響和干擾。利用控制線(xiàn) 信號(hào)可W準(zhǔn)確判定冷凍探針在分散在混合液體中的質(zhì)量，用來(lái)校正檢測(cè)線(xiàn)信號(hào)。
[0026] 3)本發(fā)明采用雙波長(zhǎng)比對(duì)校準(zhǔn)方法。通過(guò)收集控制線(xiàn)在不同波長(zhǎng)處的信號(hào)值，可 W預(yù)測(cè)樣品中雜質(zhì)對(duì)巧光信號(hào)的影響，通過(guò)選擇合適波長(zhǎng)的發(fā)射光信號(hào)，降低雜質(zhì)的影響， 可W得出較可靠的數(shù)據(jù)。雙波長(zhǎng)檢測(cè)核屯、在于使用兩種不同發(fā)射波長(zhǎng)的巧光膠乳微粒標(biāo)記 探針抗體，然后同時(shí)參與反應(yīng)，最終在控制線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)上分別有兩種巧光的信號(hào)。相當(dāng)于是 一個(gè)檢測(cè)卡上對(duì)同一待測(cè)物同時(shí)平行做兩次檢測(cè)，在控制線(xiàn)上兩個(gè)波長(zhǎng)結(jié)果均正常的情況 下，對(duì)檢測(cè)線(xiàn)上兩種波長(zhǎng)信號(hào)做運(yùn)算，換算出的濃度結(jié)果取平均值
[0027] 4)本發(fā)明針對(duì)定量層析要求，獨(dú)創(chuàng)性采用探針凍干技術(shù)，將檢測(cè)體系中的探針獨(dú) 立凍干，并在反應(yīng)前用稀釋后樣本進(jìn)行復(fù)溶。該技術(shù)避免傳統(tǒng)免疫層析產(chǎn)品技術(shù)采用噴金 法制得金標(biāo)墊帶來(lái)的如噴不勻、切割誤差等影響檢測(cè)精密度的問(wèn)題。另外傳統(tǒng)層析技術(shù)所 使用的金標(biāo)墊，其干燥條件多采用常壓條件下的加熱干燥，熱處理?xiàng)l件在一定程度上影響 探針的壽命，降低了檢測(cè)靈敏度，并增加檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。
[002引 5)本發(fā)明制備的胃蛋白酶原I檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度高，可檢測(cè)血清樣本中 0. 60ng/ml的胃蛋白酶原I ;檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需專(zhuān)業(yè)操作人員；檢測(cè)快速，10? 20分鐘即可得到檢測(cè)結(jié)果；試劑盒儲(chǔ)存方便。
[0029] 上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予W實(shí)施，W下W本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是本發(fā)明中免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031] 圖2是本發(fā)明中試劑盒體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例六中比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。W下實(shí)施 例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0034] 實(shí)施例一
[0035] 本發(fā)明的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0036] 1)免疫層析試紙條制備：采用劃膜噴金機(jī)將胃蛋白酶原I單克隆抗體和雞I巧分 別包被在層析試紙的檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）和控制線(xiàn)（C線(xiàn)）上，干燥1?化后經(jīng)切條機(jī)切割得到 3?5mm寬度的免疫層析試紙條；
[0037] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是；a)傳統(tǒng)的定性免疫層析技術(shù)采用包被羊抗鼠抗體作為控制線(xiàn)，隨 著血清中胃蛋白酶原I或一些抗鼠源抗體阻斷劑的增加，控制線(xiàn)上的信號(hào)隨之降低，其信 號(hào)值就不能用于計(jì)算，測(cè)試線(xiàn)的信號(hào)的準(zhǔn)確性也沒(méi)有了參考依據(jù)。本發(fā)明采用雞I巧抗體 和羊抗雞抗體作為控制線(xiàn)配對(duì)，C線(xiàn)與T線(xiàn)的反應(yīng)獨(dú)立進(jìn)行，無(wú)交叉影響。能避免C線(xiàn)與T線(xiàn) 彼此競(jìng)爭(zhēng)探針微粒而產(chǎn)生的重復(fù)性偏差；b)干燥時(shí)間小于比，抗體在N控制膜上的結(jié)合效 率低，導(dǎo)致胃蛋白酶原I的檢測(cè)限升高；干燥時(shí)間大于化，抗體容易失活，導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏 度降低，最佳的干燥時(shí)間為3h ;c)試紙條的寬度小于3mm時(shí)，切割機(jī)對(duì)試紙條的影響較大， 大幅度降低檢測(cè)結(jié)果的精密度，試紙條的寬度大于5mm時(shí)，會(huì)增加試紙條和探針的成本，最 優(yōu)化的試紙條寬度為4mm。
[0038] 2)凍干探針制備；將發(fā)射光波長(zhǎng)分別為500?590nm和600?740nm的帶有駿 基或氨基的巧光膠乳微粒溶液按1:5?5:1比例混合，混合均勻后加入活化劑1-(3-二甲 氨基丙基）-3-己基碳二亞胺鹽酸鹽（邸C)室溫下反應(yīng)0. 5?化，其中，1-(3-二甲氨基丙 基）-3-己基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC)與巧光膠乳微粒的重量比為0. 5:100?5:100,離屯、、洗 漆后得到活化巧光膠乳微粒；
[0039] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是；a)發(fā)射光波長(zhǎng)分別為500?590nm和600?740nm的巧光膠乳在 市面上容易獲得，因而在保證檢測(cè)精度的前提下，經(jīng)濟(jì)性和適用性較高；b)巧光膠乳微粒 的體積比是根據(jù)實(shí)際樣品檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行優(yōu)化的，單一膠乳微粒所占比例過(guò)少會(huì)造成靈敏度 降低，過(guò)多增加檢測(cè)成本，最優(yōu)化比例為1:1 ;c化DC與巧光膠乳微粒的重量比小于0. 5:100 時(shí)，膠乳微粒的活化率很低，偶聯(lián)微球上抗體的結(jié)合很少，檢測(cè)時(shí)的靈敏度低；EDC與巧光 膠乳微粒的重量比大于5:100時(shí)，膠乳微粒的活化率隨邸C量增加而增加的幅度有限，成本 升高，最佳比例為1:100 ;d)活化時(shí)間小于0.化，活化的效率不高，浪費(fèi)原材料；活化時(shí)間大 于化，活化的速度小于活化物質(zhì)水解的速度，降低了活化效率，最佳活化時(shí)間比。
[0040] 將胃蛋白酶原I單克隆抗體與活化巧光膠乳微粒的按比例0. 01:100?0. 05:100 混合，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)2?化，得到胃蛋白酶原I單克隆抗體巧光膠乳微粒；將羊抗雞I巧 與活化巧光膠乳微粒按比例0. 01:100?0. 05:100混合，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)2?化，得到羊抗 雞I巧巧光膠乳微粒；
[0041] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是；a)抗體與巧光膠乳微粒的重量比小于0. 01:100時(shí)，偶聯(lián)效率高， 但是浪費(fèi)膠乳微粒，膠乳微粒的大部分活化點(diǎn)未結(jié)合抗體；大于0. 05:100時(shí)，膠乳微粒的 大部分的活化點(diǎn)已被結(jié)合，繼續(xù)增加抗體的量對(duì)偶聯(lián)效率無(wú)明顯影響，浪費(fèi)抗體，最佳比例 為0. 02 ;100 ;b)反應(yīng)時(shí)間與偶聯(lián)率有關(guān)，時(shí)間過(guò)短小于2小時(shí)，則抗體與膠乳微粒的結(jié)合 較少，不經(jīng)濟(jì)；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)大于5小時(shí)，則偶聯(lián)率增加有限，浪費(fèi)時(shí)間，最佳反應(yīng)時(shí)間化。
[0042] 按3:1?6:1的比例混合胃蛋白酶原I單克隆抗體巧光膠乳微粒和羊抗雞I巧巧 光膠乳微粒，得到混合巧光膠乳微粒，將混合巧光膠乳微粒用含糖量5?30 %的娃藻糖水 溶液稀釋10?50倍，每支凍存管中加入15?30 y 1稀釋后的混合巧光膠乳微粒，在-80°C 下冷凍化，取出后在-30?-50°C冷阱溫度下冷凍干燥10?20h，密封保存于4°C。
[0043] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是；a)探針不易保存在樣品稀釋液中，樣品稀釋液的成分會(huì)促進(jìn)探針 之間的團(tuán)聚，會(huì)在硝酸纖維素膜（NC膜）與樣品墊之間聚集，降低檢測(cè)的靈敏度；恒溫干燥 和真空干燥制備的探針粘附力較強(qiáng)，不利于溶解，對(duì)高濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果偏差較大；冷凍 干燥可W很穩(wěn)定的保存探針，避免探針之間的團(tuán)聚，而且凍干的探針在樣品中能很快復(fù)溶， 能很快均勻分布在待測(cè)樣品中；b)含糖量小于5%，稀釋倍數(shù)大于50時(shí)，凍干的探針骨架 結(jié)構(gòu)中的固體含量少，含有大量的氣孔，結(jié)構(gòu)松散，加入樣品時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡，影響加 樣量；含糖量高于30%，稀釋倍數(shù)小于10時(shí)，加入樣品時(shí)，凍干探針需要的溶解時(shí)間稍長(zhǎng)， 反應(yīng)體系的粘稠度增加，不利于層析和加樣，最佳含糖量20% ;c)每支凍存管加入的探針溶 液小于15 y 1時(shí)，分裝時(shí)對(duì)移液器的要求加大，不適合手動(dòng)分裝；大于30 y 1時(shí)，探針溶液中 的糖分含量較多，不利于層析和加樣，最佳分裝量為25 y 1 ;d)冷阱溫度過(guò)低，需要的能耗 大，也跟機(jī)器的功能有關(guān)；冷阱溫度過(guò)高，對(duì)水分的凝結(jié)過(guò)慢，降低了干燥效率，最佳冷阱溫 度為-45°C ;e)冷凍時(shí)間過(guò)短，水分去除不夠，室溫下未凍干的固體會(huì)回潮，影響探針的質(zhì) 量；冷凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，水分基本去除完了，沒(méi)有必要繼續(xù)浪費(fèi)資源；f)胃蛋白酶原I單克隆抗 體巧光膠乳微粒的混合比例是根據(jù)抗原在T線(xiàn)上的結(jié)合能力進(jìn)行調(diào)整的，濃度過(guò)低會(huì)造成 靈敏度不夠，低濃度區(qū)分不夠；濃度過(guò)高，成本會(huì)增加，線(xiàn)性的上限也可能會(huì)下降。
[0044] 3)樣品稀釋液制備；樣品稀釋液為含有牛血清白蛋白、蛋白保護(hù)劑、表面活性劑 和防腐劑的緩沖液；緩沖液包括PBS緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、肥PES 緩沖液中的一種或幾種，表面活性劑為吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100或聚己二醇，防腐劑 為疊氮鋼或proclin ;
[0045] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是；a)牛血清白蛋白起著流動(dòng)封閉的作用，能與人血清中的雜蛋白結(jié) 合，封閉探針上的空白位點(diǎn)，降低探針的非特異性結(jié)合，減少假陽(yáng)信號(hào)；b)蛋白保護(hù)劑用于 降低一些待檢抗原的分解，起著保護(hù)抗原的作用；C)表面活性劑能夠改善免疫體系中疏水 物質(zhì)的親水性，使得探針在NC膜上的分布更均勻，避免了信號(hào)波動(dòng)對(duì)信號(hào)的影響；d)防腐 劑延遲或抑制微生物的生長(zhǎng)，避免樣品稀釋液的腐?。籩)緩沖液用于控制免疫反應(yīng)的反應(yīng) 條件，降低人血清的差異對(duì)反應(yīng)體系的影響
[0046] 4)樣品檢驗(yàn)；將血清樣品與凍干探針混合分散一段時(shí)間后，取出一定量加入樣品 稀釋液中，待混合均勻后滴加至免疫層析試紙條上進(jìn)行免疫層析反應(yīng)；隨后在巧光檢測(cè)器 下采用與兩種巧光膠乳微粒相對(duì)應(yīng)的兩種發(fā)射光波長(zhǎng)進(jìn)行巧光檢測(cè)?；旌弦后w中胃蛋白酶 原I與標(biāo)記有巧光膠乳微粒的胃蛋白酶原I單克隆抗體碰撞結(jié)合形成復(fù)合物，滲透到樣品 墊上，混合液體經(jīng)玻璃纖維過(guò)濾雜質(zhì)后，其中的復(fù)合物繼續(xù)順著硝酸纖維素膜滲透到檢測(cè) 線(xiàn)上，與固定在檢測(cè)線(xiàn)上的胃蛋白酶原I單克隆抗體形成雙抗體夾屯、的新復(fù)合物，檢測(cè)線(xiàn) 上的胃蛋白酶原I單克隆抗體與探針中的胃蛋白酶原I單克隆抗體，其在胃蛋白酶原I上 的表位不同；剩余的抗原-巧光標(biāo)記的抗體復(fù)合物、未結(jié)合的標(biāo)記有巧光膠乳微粒的胃蛋 白酶原I單克隆抗體、W及標(biāo)記有巧光膠乳微粒的羊抗雞I巧繼續(xù)滲透到控制線(xiàn)，標(biāo)記有 巧光膠乳微粒的羊抗雞I巧會(huì)與控制線(xiàn)上固定的雞I巧結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物；巧光 檢測(cè)器下巧光檢測(cè)時(shí)，僅在控制線(xiàn)上檢測(cè)到信號(hào)，才能證明檢測(cè)結(jié)果是有效的。
[0047] 實(shí)施例二
[0048] 如圖1至2所示，本發(fā)明的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)試劑盒，包括 試劑盒體、凍存管、W及稀釋液瓶，試劑盒體包括塑料襯板1 W及固定在塑料襯板上的樣品 墊2、免疫層析試紙條3和吸水紙6,免疫層析試紙條為硝酸纖維素膜材質(zhì)，樣品墊和吸水紙 分別搭接在免疫層析試紙條的兩側(cè)，免疫層析試紙條上設(shè)置有檢測(cè)線(xiàn)4和控制線(xiàn)5,檢測(cè)線(xiàn) 和控制線(xiàn)內(nèi)分別包被有胃蛋白酶原I單克隆抗體和雞I巧；凍存管中存放有凍干探針，凍 干探針為由胃蛋白酶原I單克隆抗體和羊抗雞I巧與兩種不同發(fā)射光波長(zhǎng)的巧光膠乳微 粒反應(yīng)制得的凍干探針，稀釋液瓶中存放有樣品稀釋液；試劑盒體還包括殼體7,殼體上設(shè) 置有加樣孔8、檢測(cè)窗口 9和把手10,加樣孔設(shè)置在樣品墊處，檢測(cè)窗口設(shè)置在檢測(cè)線(xiàn)和控 制線(xiàn)處，把手設(shè)置在殼體上位于靠近吸水紙的一側(cè)。
[0049] 使用時(shí)，將血清樣品加入到凍干探針凍存管中，探針?lè)稚⒑笕〕鲆欢康囊后w加 入到樣品稀釋液中，混合均勻后加入到加樣孔中即可；隨后在巧光檢測(cè)器下采用與兩種巧 光膠乳微粒相對(duì)應(yīng)的兩種發(fā)射光波長(zhǎng)進(jìn)行巧光檢測(cè)?；旌弦后w中胃蛋白酶原I與標(biāo)記有巧 光膠乳微粒的胃蛋白酶原I單克隆抗體碰撞結(jié)合形成復(fù)合物，滲透到樣品墊上，混合液體 經(jīng)玻璃纖維過(guò)濾雜質(zhì)后，其中的復(fù)合物繼續(xù)順著硝酸纖維素膜滲透到檢測(cè)線(xiàn)上，與固定在 檢測(cè)線(xiàn)上的胃蛋白酶原I單克隆抗體形成雙抗體夾屯、的新復(fù)合物，檢測(cè)線(xiàn)上的胃蛋白酶原 I單克隆抗體與探針中的胃蛋白酶原I單克隆抗體，其在胃蛋白酶原I上的表位不同；剩 余的抗原-巧光標(biāo)記的抗體復(fù)合物、未結(jié)合的標(biāo)記有巧光膠乳微粒的胃蛋白酶原I單克隆 抗體、W及標(biāo)記有巧光膠乳微粒的羊抗雞I巧繼續(xù)滲透到控制線(xiàn)，標(biāo)記有巧光膠乳微粒的 羊抗雞I巧會(huì)與控制線(xiàn)上固定的雞I巧結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物；巧光檢測(cè)器下巧光檢 測(cè)時(shí)，僅在控制線(xiàn)上檢測(cè)到信號(hào)，才能證明檢測(cè)結(jié)果是有效的。
[0化0] 本發(fā)明的檢測(cè)用巧光檢測(cè)器，包含激發(fā)檢測(cè)模塊、前置放大模塊、控制分析模塊W 及軟件系統(tǒng)。其中激發(fā)檢測(cè)模塊的光源為發(fā)射波長(zhǎng)為400?600nm的發(fā)光二極管，前置放 大模塊為一前置放大電路。
[0化1] 實(shí)施例S
[0化2] 本發(fā)明還提供一種胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)的具體實(shí)施例，依次 包括W下步驟：
[0化3] 第一步：凍干探針的制備
[0054] 1)將兩種發(fā)射光波長(zhǎng)分別為550nm和700nm的巧光膠乳微粒溶液按照體積比1:1 的比例進(jìn)行混合，混合均勻后，取500 y 1混合巧光膠乳微粒溶液（含駿基）用抑6. 0MES緩 沖液洗漆離屯、分離S次后，沉淀用抑6. 0MES緩沖液稀釋?zhuān)尤雔Omg EDC混勻后，在室溫下 反應(yīng)活化30min，離屯、分離后，沉淀繼續(xù)用抑6. 0 MES緩沖液洗漆S遍，隨后沉淀用抑6. 0 MES緩沖液稀釋?zhuān)尤?25 y g胃蛋白酶原I單克隆抗體，室溫下反應(yīng)3h，加入BSA封閉，繼 續(xù)反應(yīng)30min，離屯、后沉淀用抑7. 4 PBS緩沖液洗漆四次，得到標(biāo)記有巧光膠乳微粒的胃蛋 白酶原I抗體沉淀，同理可W得到標(biāo)記有巧光膠乳微粒的羊抗雞I巧沉淀，將沉淀重懸在 500 yl pH7. 4 PBS緩沖液中，加入15yl proclin，在4°C下保存。
[0055] 2)將偶聯(lián)有胃蛋白酶原I單克隆抗體的膠乳微粒與偶聯(lián)有羊抗雞I巧的膠乳微 粒按體積比6:1混合，混合膠乳微粒與50倍體積的5%娃藻糖水溶液縱禍混合，得到探針溶 液，取30 y 1探針溶液加入到500 y 1凍存管中，在-80°C冷凍化，取出后在-25°C冷凍干燥 化，密封保存在4 °C冰箱。
[0056] 第二步：免疫層析檢測(cè)卡的制備
[0057] 在襯板上依次粘貼硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水紙，樣品墊和吸水紙搭接在膜上， 并且緊密相連。分別將與巧光膠乳微粒標(biāo)記的胃蛋白酶原I單克隆抗體位于不同表位另 一株胃蛋白酶原I單克隆抗體（包被抗體）和羊抗雞I巧用包被液分別配制成Img/ml和 0. 5mg/ml的抗體包被液。將胃蛋白酶原I單克隆抗體包被液和雞I巧包被液W 1 y 1/cm 的線(xiàn)速包被在硝酸纖維素膜上對(duì)應(yīng)的檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)上，檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)間隔8mm，在濕度 <30 %條件下37°C烘干比后，制成巧光免疫層析試紙板。
[005引用切條機(jī)將制備好的巧光免疫層析試紙板縱向切成4mm寬的巧光免疫層析試紙 條，將其放入卡殼內(nèi)經(jīng)壓殼機(jī)處理得到免疫層析檢測(cè)卡。
[0化9] 第S步；樣品稀釋液的配制
[0060] 取0. 01M pH7. 5的PBS緩沖液1L，加入9ml吐溫20,15g抗體保護(hù)劑，6. Ig牛血清 白蛋白和0. 19g疊氮鋼，超聲直至固體全部溶解，混勻。
[0061] 實(shí)施例四
[0062] 本發(fā)明還提供一種胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)的具體實(shí)施例，依次 包括W下步驟：
[0063] 第一步：凍干探針的制備
[0064] 1)將兩種發(fā)射光波長(zhǎng)分別為500nm和600nm的巧光膠乳微粒溶液按照體積比1:5 的比例進(jìn)行混合，混合均勻后，取500 y 1混合巧光膠乳微粒溶液（含駿基）用抑6. 0 MES緩 沖液洗漆離屯、分離S次后，沉淀用抑6. 0 MES緩沖液稀釋?zhuān)尤?mg EDC混勻后，在室溫下 反應(yīng)活化比，離屯、分離后，沉淀繼續(xù)用抑6. 0 MES緩沖液洗漆S遍，隨后沉淀用抑6. 0 MES 緩沖液稀釋?zhuān)尤?2. 5 y g胃蛋白酶原I單克隆抗體，室溫下反應(yīng)化，加入BSA封閉，繼續(xù) 反應(yīng)30min，離屯、后沉淀用抑7. 4 PBS緩沖液洗漆四次，得到標(biāo)記有巧光膠乳微粒的胃蛋 白酶原I抗體沉淀，同理可W得到標(biāo)記有巧光膠乳微粒的羊抗雞I巧沉淀，將沉淀重懸在 500 yl pH7. 4 PBS緩沖液中，加入15yl proclin，在4°C下保存。
[0065] 2)將偶聯(lián)有胃蛋白酶原I單克隆抗體的膠乳微粒與偶聯(lián)有羊抗雞I巧的膠乳微 粒按體積比5:1混合，混合膠乳微粒與30倍體積的5%娃藻糖水溶液縱禍混合，得到探針溶 液，取25 y 1探針溶液加入到500 y 1凍存管中，在-80°C冷凍化，取出后在-25°C冷凍干燥 化，密封保存在4 °C冰箱。
[0066] 第二步：免疫層析檢測(cè)卡的制備
[0067] 與實(shí)施例S中相應(yīng)步驟相同。
[0068] 第立步；樣品稀釋液的配制
[0069] 取0. 01M pH7. 5的PBS緩沖液1L，加入8ml曲拉通X-100,15g抗體保護(hù)劑，6. Ig 牛血清白蛋白和0. 19g疊氮鋼，超聲直至固體全部溶解，混勻。
[0070] 實(shí)施例五
[0071] 本發(fā)明還提供一種胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)的具體實(shí)施例，依次 包括W下步驟：
[0072] 第一步：凍干探針的制備
[0073] 1)將兩種發(fā)射光波長(zhǎng)分別為590nm和740nm的巧光膠乳微粒溶液按照體積比5:1 的比例進(jìn)行混合，混合均勻后，取500 y 1混合巧光膠乳微粒溶液（含駿基）用抑6. 0 MES 緩沖液洗漆離屯、分離S次后，沉淀用抑6. 0 MES緩沖液稀釋?zhuān)尤?0mg EDC混勻后，在室 溫下反應(yīng)活化比，離屯、分離后，沉淀繼續(xù)用抑6. 0 MES緩沖液洗漆S遍，隨后沉淀用抑6. 0 MES緩沖液稀釋?zhuān)尤?12. 5yg胃蛋白酶原I單克隆抗體，室溫下反應(yīng)化，加入BSA封閉， 繼續(xù)反應(yīng)30min，離屯、后沉淀用抑7. 4 PBS緩沖液洗漆四次，得到標(biāo)記有巧光膠乳微粒的胃 蛋白酶原I抗體沉淀，同理可W得到標(biāo)記有巧光膠乳微粒的羊抗雞I巧沉淀，將沉淀重懸 在500 yl抑7. 4 PBS緩沖液中，加入15yl proclin，在4°C下保存。
[0074] 2)將偶聯(lián)有胃蛋白酶原I單克隆抗體的膠乳微粒與偶聯(lián)有羊抗雞I巧的膠乳微 粒按體積比3:1混合，混合膠乳微粒與10倍體積的5%娃藻糖水溶液縱禍混合，得到探針溶 液，取15 y 1探針溶液加入到500 y 1凍存管中，在-80°C冷凍化，取出后在-25°C冷凍干燥 化，密封保存在4 °C冰箱。
[0075] 第二步：免疫層析檢測(cè)卡的制備
[0076] 與實(shí)施例S中相應(yīng)步驟相同。
[0077] 第S步；樣品稀釋液的配制
[007引取0. 01M抑7. 5的PBS緩沖液1L，加入10ml聚己二醇，15g抗體保護(hù)劑，6. Ig牛血 清白蛋白和0. 19g疊氮鋼，超聲直至固體全部溶解，混勻。
[0079] 實(shí)施例六
[0080] 本發(fā)明還提供一種胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)巧光免疫層析檢測(cè)的樣本檢測(cè)方法，包 括W下幾個(gè)方面：
[0081] 1)線(xiàn)性、檢測(cè)限和精密度評(píng)估：
[0082] 采用陰性牛血清作為稀釋液，將胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為300、270、240、 210、180、150、120、90、60、30和0叫/1111的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取標(biāo)準(zhǔn)品100^1與100^1樣品稀釋 液加入到含有凍干探針的凍存管中，吹打15次后取100 y 1加入到加樣孔中，15分鐘后采用 巧光檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明，500?590nm和600?740nm兩組接受光，每組線(xiàn)性的相關(guān)系 數(shù)r'2均大于0. 99,檢測(cè)限分別為0. 90ng/ml和0. 60ng/ml，各濃度的檢測(cè)變異系數(shù)均小于 8%。
[0083] 2)線(xiàn)性參數(shù)的驗(yàn)證：
[0084] 采用低值人血清和高值人血清，配制濃度為300、240、180、120、60ng/ml的胃蛋白 酶原I人血清溶液，每個(gè)樣本重復(fù)4次，結(jié)果表明，采用單波長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)擬合值大于或小于實(shí) 際值的情況，采用取平均值的方法，可W去除單波長(zhǎng)帶來(lái)的影響，r'2大于0. 99,最高檢測(cè) 范圍可達(dá)到30化g/ml。
[0085] 3)準(zhǔn)確度的評(píng)估
[0086] 采用胃蛋白酶原I濃度為lOng/ml的人血清樣本作為基礎(chǔ)樣本，加入同體積不同 濃度的胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)物人血清，配制成濃度為200、67、3化g/ml的胃蛋白酶原I人血 清溶液；另一份樣本加入相同體積的陰性人血清，對(duì)回收樣本和基礎(chǔ)樣本進(jìn)行4次重復(fù)檢 測(cè)分析，并進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，單波長(zhǎng)檢測(cè)回收率在80%-120%范圍內(nèi)，采用取平均值 的方法，回收率可W在95% -105%范圍內(nèi)。其中，回收率=(回收樣本濃度-基礎(chǔ)樣本濃 度）/加入濃度*100 %，具體見(jiàn)表一。
[0087] 表一準(zhǔn)確度的評(píng)估 [008引

【權(quán)利要求】
1. 一種胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 免疫層析試紙條制備：將胃蛋白酶原I單克隆抗體和雞IgY分別包被在層析試紙的 檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)上，經(jīng)干燥、切割后得到免疫層析試紙條； 2) 凍干探針制備：將兩種不同發(fā)射光波長(zhǎng)的熒光膠乳微粒溶液按比例混合，混合均勻 后加入活化劑反應(yīng)一段時(shí)間，離心、洗滌后得到活化熒光膠乳微粒； 將胃蛋白酶原I單克隆抗體和羊抗雞IgY分別按比例與活化熒光膠乳微粒偶聯(lián)反應(yīng) 一段時(shí)間，得到胃蛋白酶原I單克隆抗體熒光膠乳微粒、以及羊抗雞IgY熒光膠乳微粒； 隨后將胃蛋白酶原I單克隆抗體熒光膠乳微粒與羊抗雞IgY熒光膠乳微粒按一定比 例混合得到混合熒光膠乳微粒，隨后加入硅藻糖水溶液稀釋?zhuān)瑑龈珊蟊４鏋閮龈商结槪? 3) 樣品稀釋液制備：樣品稀釋液為含有牛血清白蛋白、蛋白保護(hù)劑、表面活性劑和防 腐劑的緩沖液； 4) 樣品檢驗(yàn)：將血清樣品與凍干探針混合分散一段時(shí)間后，取出一定量加入樣品稀釋 液中，待混合均勻后滴加至免疫層析試紙條上進(jìn)行免疫層析反應(yīng)；隨后在熒光檢測(cè)器下采 用與兩種熒光膠乳微粒相對(duì)應(yīng)的兩種發(fā)射光波長(zhǎng)進(jìn)行熒光檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在 于：所述凍干探針制備步驟中，將兩種不同發(fā)射光波長(zhǎng)的熒光膠乳微粒溶液按1:5?5:1比 例混合，混合均勻后加入活化劑1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽室溫下反應(yīng) 0.5?2h，其中，1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與熒光膠乳微粒的重量比為 0?5:100 ?5:100〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在 于：所述凍干探針制備步驟中，所述兩種熒光膠乳微粒的發(fā)射光波長(zhǎng)分別為500?590nm和 600 ?740nm〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在 于：所述凍干探針制備步驟中，胃蛋白酶原I單克隆抗體與活化熒光膠乳微粒的混合比例 為0. 01:100?0. 05:100,混合后室溫下偶聯(lián)反應(yīng)2?5h ;羊抗雞IgY與活化熒光膠乳微粒 的混合比例為0. 01:100?0. 05:100,混合后室溫下偶聯(lián)反應(yīng)2?5h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在 于：所述凍干探針制備步驟中，按3:1?6:1的比例混合胃蛋白酶原I單克隆抗體熒光膠乳 微粒和羊抗雞IgY熒光膠乳微粒，得到混合熒光膠乳微粒，將混合熒光膠乳微粒用含糖量 5?30%的硅藻糖水溶液稀釋10?50倍，在-80°C下冷凍2h，取出后在-30?-50°C冷阱 溫度下冷凍干燥10?20h，密封保存于4°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在 于：所述樣品稀釋液制備步驟中，所述緩沖液包括PBS緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖 液、MES緩沖液、HEPES緩沖液中的一種或幾種，所述表面活性劑為吐溫20、吐溫80、曲拉通 X-100或聚乙二醇，所述防腐劑為疊氮鈉或proclin。
7. -種胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括試劑盒 體、凍存管、以及稀釋液瓶，所述試劑盒體包括塑料襯板以及固定在塑料襯板上的樣品墊、 免疫層析試紙條和吸水紙，所述樣品墊和吸水紙分別搭接在所述免疫層析試紙條的兩側(cè)， 所述免疫層析試紙條上設(shè)置有檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)，所述檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)內(nèi)分別包被有胃蛋白 酶原I單克隆抗體和雞IgY ;所述凍存管中存放有凍干探針，所述凍干探針為由胃蛋白酶 原I單克隆抗體和羊抗雞IgY與兩種不同發(fā)射光波長(zhǎng)的熒光膠乳微粒反應(yīng)制得的凍干探 針，所述稀釋液瓶中存放有樣品稀釋液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)試劑盒，其特征在 于：所述試劑盒體還包括殼體，所述殼體上設(shè)置有加樣孔、檢測(cè)窗口和把手，所述加樣孔設(shè) 置在所述樣品墊處，所述檢測(cè)窗口設(shè)置在所述檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)處，所述把手設(shè)置在所述殼 體上位于靠近吸水紙的一側(cè)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的胃蛋白酶原I的雙波長(zhǎng)熒光免疫層析檢測(cè)試劑盒，其特征在 于：所述免疫層析試紙條為硝酸纖維素膜材質(zhì)。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104502600SQ201410629054
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】張翼飛, 張鵬, 廖平璋, 張華
申請(qǐng)人:江蘇宏泰格爾生物醫(yī)學(xué)工程有限公司